Name: using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.

1. Moleküler klonlama
<ol><li>Gen faiz ve plazmid vitro transkripsiyon (pIVT) vektör11tam uzunlukta kodlama dizisi elde edilir. Not: Tam uzunlukta cDNA klonlar çeşitli satıcılardan ticari olarak kullanılabilir veya ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yolu ile oluşturulabilir. Dışavurumu sıra (EST) veritabanları öğesini ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) online kaynak için Ulusal Merkezi transkript dizileri genler için nükleotit sağlar. Protein kolaylığı için görselleştirme ve analiz ifade düzeyleri, füzyon yeşil flüoresan protein (Gfp) veya başka bir uygun floresan etiket klonlama stratejisinde istenen.</li>
	<li>Doğrulanmış bir klonlama strateji kullanarak, ilgi genin kodlama dizisi pIVT birden çok klonlama bölgesine ekleyebilirsiniz. Moleküler klonlama ayrıntılı bir açıklama ve gerekli adımları daha önce açıklanan 12olmuştur. Not: bir gen-füzyon ürün oluşturulacak ise, klonlama uygun okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Doğru gen ekleme, uygun çerçeve fusion ve hiçbir polimeraz kaynaklı nokta mutasyonlar oluşturulan emin olmak için globin primerler kullanılarak inşa etmek sıra. Not: Sanger DNA sıralama ekipman kullanılabilir değilse, birçok şirket düşük maliyetli DNA Sıralama seçenekleri sunuyoruz.</li>
	<li>DNA tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) veya ekleme/silme (INDELS) üreten varsa mutagenize. DNA mutagenesis adımları 1.5-1.7 açıklanmıştır. Vahşi-türü yapıları için Doğrusallaştırma adım 1.7 ile devam edin.</li>
	<li>Mutagenesis astar tasarım ve üreticinin iletişim kuralı başına mutant yapı oluşturmak için mutagenesis PCR reaksiyon tamamlayın. PCR-aracılı site yönettiği mutagenesis yukarıda açıklanan 13oldu. Ayrıca, birçok şirket iletişim kuralları içerir sitesi yönetmen mutagenesis kitleri teklif.</li>
	<li>Mutagenized DNA'sı bakteriyel konak dönüşümü. İzole ve plazmid arındırmak. Not: Birçok şirket kolayca ayırmak ve plazmid DNA arındırmak için kullanılan kitleri olun. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. E. coligibi gram-negatif bakteri zorlanma kullanıyorsanız, endotoxins kaldırır bir kit kullanılması önerilir.</li>
	<li>Bakteriyel transformants getirilmesi istenen SNP veya INDEL onaylamak için standart Sanger DNA sıralama kullanarak izole DNA'dan sıra.</li>
	<li>Son ürünler tek restriksiyon enzimi sindirim saf DNA kullanarak linearize. Not: PIVT vektör birden çok tek-enzim Addgene 14plazmid haritada listelenen siteler kesmek içerir.</li>
	<li>Ürün özel Jel Elektroforez ile doğrusal olduğundan emin olun. Özel Jel Elektroforez yöntemi önceden tanımlanmış 14oldu. Not: tüm kalan adımları için kararlı, yüksek kaliteli RNA üretimini sağlamak için bariyer (filtre) damlalıklı ipuçları ve RNase içermeyen malzemeler kullanın.</li>
	<li>Doğrulanmış bir DNA temizlik Protokolü veya kit kullanılarak sindirilir ürün arındırmak ve 30 µL RNase/Dnaz-Alerjik suda elute. Not: silikat-matrix spin sütunlara göre kitleri için yüksek kaliteli, tavsiye edilir saf DNA. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin.</li>
	<li>
Vitro T7 polimeraz üreticinin protokol sonrası kullanarak DNA uyarlamak.</li>
	<li>Arındırmak ve RNA RNase/Dnaz ücretsiz su üreticinin protokol sonrası bir silikat-matrix spin sütunlara göre nükleik asit arıtma kit kullanarak 30 µL içinde elute.</li>
	<li>Denaturing özel Jel Elektroforez son RNA ürün boyutu onaylamak için formaldehit kullanarak gerçekleştirin. 14aşağıdaki adımları 1,13-1.22 bakın. (Şekil 1).</li>
	<li>Jel 72 ml 1 g özel Isıtma tarafından eriyene kadar su hazırlamak, sonra 60 ° C'ye serin</li>
	<li>10 X 0.4 M BEZLERİ (pH 7,0), 0.1 M sodyum asetat ve 0.01 M EDTA ekleyerek tampon çalıştıran MOPS hazırlayın.</li>
	<li>10 mL 10 X MOPS tampon ve % 37 formaldehit (12,3 M) 18 mL soğutmalı özel çözüm çalışan ekleyin.</li>
	<li>Kast özel çözüm bir jel şekillendirme konteyner içine dökme tarafından jel. 10 µL kapsayacak kadar geniş bir tarak kullanın. Jel belirledi ve dokunmak için sert olması sonra yavaşça tarak kaldırın.</li>
	<li>Jel Elektroforez tank montajı ve yeterli 1 X arabellek, çalışan jel tamamen kaplıdır sağlanması MOPS ekleyin.</li>
	<li>RNA örnek formaldehit içeren yükleme boya 0.5 X birimlerine RNA'ın 1 µg ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Etidyum bromür 10 µg/mL bir konsantrasyon RNA çözüm ekleyin.</li>
	<li>RNA örnek çözümü 5 min için 70 ° C'de denatüre.</li>
	<li>Steril kullanarak 10 µL filtre ipuçları, molekül ağırlığı işaretleyicinin 5 µL yük ve RNA'ın 5 µL jel ayrı kuyu sample(s) ve boya jel uzunluğu en az üçte göç kadar 5 V/cm electrophorese.</li>
	<li>Bir UV trans ışığı üzerinde jel RNA görselleştirin. RNA moleküler ağırlık işaretçiyi karşılaştırarak doğru boyutu olduğundan emin olun.</li>
	<li>Konsantrasyon ve RNA saflığı ölçmek için steril 10 µL filtre ipuçları UV Spektrofotometre üzerine kullanarak arıtılmış RNA'ın 1.2 µL aktarın. Not yüksek kaliteli RNA A260/280 (1.8-2.2) ve 260/230 Absorbans oranları olmalıdır (> 1,7) anılan sıraya göre.</li>
	<li>10 µL filtre ipuçları, aliquot kalan saf RNA steril 0.5 µL santrifüj tüpler içine (3-5 µL/tüp) kullanarak. Mikroenjeksiyon için hazır kadar tüpler-80 ° C'de depolayın. Not: 500 ng/µL son enjeksiyon yoğunlukta bir en iyi başlangıç noktasıdır. Bu RNA 1: 2'RNase H20 RNA yapışkanlık mikroenjeksiyon pipet içinde azaltmak için mikroenjeksiyon öncesinde ücretsiz sulandırmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>2. kinetochore-Mikrotubul ek tahlil
<ol><li>Yumurtalar mikroenjeksiyon için eşit gruplara bölün. Not: Yumurta toplama, transfer, mikroenjeksiyon ve segregasyonun olgunlaşma tarif edilmiştir ayrıntılı olarak Jüpiter daha önce 15.</li>
	<li>Deneysel mRNA içeren bir grup ve diğer grup WT denetim ve PBS veya Gfp ile microinject mRNA. Not: 500 ng/µL 10ile başlamak için önerilen enjeksiyon bölgedir. Bir picoinjector enjeksiyon tutarları kontrol etmek için kullanılabilir. 5-10 pL bir enjeksiyon hacmi 15önerilir.</li>
	<li>Bir yumurta (100-150 µm), transfer yumurta içine bir kültür ortamında milrinon içermeyen bir petri 100 µL damla çapı daha büyük embriyo kalitesi madeni yağ kaplı bir el ya da ağız nerede cam pipet açılış işletilen pipetting aparatı biraz olduğunu kullanarak ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek için %5 C02 37 ° C'de 7 h için kuluçkaya ben (Met) 15.</li>
	<li>Yukarıdaki gibi aynı pipet cihazları kullanarak kuluçka sonra yumurta önceden soğutulmuş minimum temel medya (MEM) koleksiyon orta iyi Center'da 700 µL ve 500 µL H20 dış halkası içeren bir merkezi-şey organ kültür çanak içine aktarmak ve 7 dakika buzda çanak yerleştirin. Not: Önceden MEM medya soğuk ve de organ kültür yemekleri için en az 20 dk önce yumurta tedavisinde-20 ° C'de ortalamak için önerilir.</li>
	<li>Yumurta % 2 paraformaldehyde 1 X PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde 400 µL içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanarak aktararak düzeltmek.</li>
	<li>Kullanarak pipet aparatı, yumurta başka bir kuyunun içine 400 µL engelleme çözüm (PBS + % 0,3 BSA + % 0,01 ara-20 + %0,02 NaN3) ve mağaza içeren spot bir tabağa aktarın. immunostaining için işlemek için hazır kadar 4 ° C'de. Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için.</li>
	<li>Aynı pipet cihazları kullanarak, bir yerde yeni bir kuyu için transfer yumurta içeren 400 µL permeabilization çözüm (PBS % 0,3 BSA + %0.1 TritonX-100 + %0,02 NaN3) plaka ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle üç üzerinden hızlı bir şekilde Transfer yumurtalar kuluçkaya 400 µL damla herhangi bir kalıntı deterjan kaldırmak için çözüm engelleme. Not: Bir 9-şey açık cam spot tabak iyi grupları birden fazla tedavi ile tek bir yemek (Adım 2.4-2.5) üzerinde hareket etmek için çalışır.</li>
	<li>Kalan immunocytochemistry yordamları bir oksijen odasında ışık oda sıcaklığında korunan gerçekleştirmek. Kullanım bir orta ölçekli plastik konteyner nemli kağıt havlu ve alüminyum folyo ile kapatın ile kaplı.</li>
	<li>Pipet cihazları kullanarak, yumurtalar için 30 µL transfer çözüm bir 96-şey plaka ve oksijen Odası 10 dk içinde yer kapağındaki engelleme. Not: Damla plaka üzerinde dairesel boynundaki yerleştirilir.</li>
	<li>Sentromerler ve Milli, pipet cihazları kullanarak etiket, yumurtalar için 30 µL transfer için anti-centromeric antijen (ACA, Crest) içeren çözüm engelleme (1:30) ve anti-acetylated tübülin (1: 1000) ve en az 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalar üç 30 µL damla 10 min için çözüm engelleme yoluyla aktararak durulayın.</li>
	<li>Pipet cihazları, transfer yumurta kullanarak için 30 µL engelleme çözüm ikincil antikorlar (Anti-insan IgG 1: 200, Anti-fare IgG 1: 200) kullanılan antikor için ücretsiz içeren bırakın ve 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>3, 10 dk 30 µL durulama adımlarını yineleyin 2.11. adımda açıklandığı gibi çözüm engelleme.</li>
	<li>Pipet cihazları, 3-5 µL orta içeren DAPI montaj kullanarak yumurta transferi (5.9 µg/µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki.</li>
	<li>Vazelin 4 küçük damla (bir PIN kafa boyutunu) Yumurta kırma önlemek için kapak Not köşelerinde yer.</li>
	<li>Yavaşça kapak notu vazelin yan slayt yerleştirin.</li>
	<li>Mühür kenarları ile tırnak cilası temizlemek ve 5 min için kurumasını alışverişi coverslip.</li>
	<li>Slaytları işleme confocal mikroskobu ile kadar gelen ışık, korumalı 4 ° C'de depolayın. Not: montaj orta ve coverslip, maç Kırılma indisi kullanılmaktadır belgili tanımlık mikroskop objektif olun. Önerilen montaj malzemeleri daha önce olmuştur 15nitelendirdi.</li>
	<li>Görüntü 40-63 x amaç küçük adımlar yakalama confocal mikroskobunun kullanarak yumurta (≤ 1 µm) z-uçak, optimize edilmiş çalışma amaç ve görüntü metafaz iğ tüm bölge için. Not: 2.11 adımda kullanılan belirli ikincil antikorlar temel alan tüm 3 kanal görüntü emin olun. ≥ 4 ve zoom 3 ortalama görüntü için yeterli çözünürlük idealdir. 1 µm adım boyu mikrotübüller ve fare yumurta kinetochores açık görselleştirme sağlar. Yordamı fotoðraf çekmek için mikroskop mikroskop değişir. Lütfen nasıl mikroskop ayarlarını yapılandırmak için belirli adımlar için üreticileri confocal kullanıcı kılavuzuna bakın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları 2.21 2,23 takip düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak kinetochore-Mikrotubul eki durumunu tanımlar. Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. Ek durum türleri daha önce olmuştur 16 tanımlı.</li>
	<li>Dosya resim J araç çubuğuna sürükleyerek resmi aç.</li>
	<li>Açılan z-serisi, tüm kanallar görünür (DNA, kinetochore ve spindle) "renk" alt sekmesi altında "kanalları Birleştir", "görüntü" açılır menüsünde bulunan tıklayarak yapmak.</li>
	<li>Geçişi görüntü altındaki kullanarak, her z dilimli taşımak ve kinetochore Mikrotubul eki belirler. 16 ayrıntılı ek açıklamaları daha önce olmuştur açıklanan
</li>
</ol>3. kromozom hizalama Challenge tahlil
<ol><li>Pipet aparatı 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak, aktarım milrinon ücretsiz kültür orta petrol altında bir 100 µL damla içine yumurta ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek 7 h için kuluçkaya ben (Met) daha önce 2,3 17. adımda açıklandığı gibi . Not: Oosit toplanması, mikroenjeksiyon ve olgunlaşma yordamlar özetlenen daha önce 15. Ek tahlil Protokolü adım 2.1-2.2 denetimleri ve RNA mikroenjeksiyon konsantrasyonları bakın.</li>
	<li>Aynı pipet cihazları kullanarak, Merkezi-şey organ kültürüne transfer yumurta içeren 700 µL Kültür Merkezi iyi ve 400 µL H20 çevreleyen halka monastrol [100 µM] içeren orta çanağı ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalar, pipet aparatı olarak yukarıda, 100 µL CZB kültür orta, üç damla aracılığıyla kullanarak aktarma tarafından monastrol dışarı durulama ve yumurta içeren 700 µL kültür orta + MG132 yeni bir merkezi-şey organ kültür çanak transfer [5 mikron] Merkezi 3 h için yüzüğü. 400 µL H20 dış halka ekleyin.</li>
	<li>Yumurtalar, PBS içinde oda sıcaklığında 20 dakika için 400 µL % 2 paraformaldehyde içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanılarak aktarım tarafından tamir.</li>
	<li>Fiksasyon sonra yumurta transferi, pipet cihazları, şeffaf cam spot plaka 400 µL içeren yeni bir kuyunun içine kullanarak engelleme çözüm ve mağaza kadar 4 ° C'de işleme için immunostaining. Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için.</li>
	<li>Permeabilize ve yumurta immunocytochemistry via 2.6-2.16 adımlarda açıklandığı gibi etiket.</li>
	<li>Görüntü yakalama, 40-63 x amaç üzerinde confocal mikroskop kullanarak yumurta < 1 µm adım z-uçak metafaz iğ tüm bölge görüntü emin olmak istedim.</li>
	<li>Durum kromozom hizalamasını belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın. Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış.</li>
	<li>Görüntü resmi J kontrol paneline sürükleyin.</li>
	<li>Açılan z-serisi, nokta aracını (görüntü J kontrol çubuğu noktası aracı simgesini tıklatarak bulunur) kullanın aracı görüntüdeki Milli direk üzerine yerleştirip resmine tıklayarak onların anılan sıraya göre z-dilim her işmili kutbunda sonunda Puan işaretlemek için. Bu noktalar, Command + t klavye tuşlarına basarak faiz (ROI) Yöneticisi bölgesine ekleyin.</li>
	<li>Her adım 3.10 ROI Yöneticisi'nde belirli nokta vurgulama ve ölçü birimi düğmesini tıklatarak ayarlama pozisyonlar için belirli koordinatları belirleyin. Bu bir sonuçları sağlayacaktır tabloyu içeren x ve y koordinatlarını her noktası için. Bunlar sırasıyla X1, Y1 ve X1, Y2, Puan olacaktır.</li>
	<li>Daha sonra gerçek Z Koordinat belirleyin. Bu hangi Milli direk tespit z yığınındaki belirli z-dilim dilim sayısı çarpılarak yapılır (Yani dilim #2 / 6) bireysel her noktası yığının kalınlığı (Yani 1 µm) tarafından olan (örnek: 2 x 1 µm dilim = 2). Bunlar sırasıyla Z1 ve Z2 noktalarında olacak.</li>
	<li>Pisagor teoremi denklemi kullanarak iğ uzunluğunu belirleyin (2 + b2 = c2) önceden tanımlanmış kullanarak x, y ve z koordinatları adımlardan 3.11-3.13. Son uzunluğu her mil için eşittir: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>İğ midzone belirler. Bu yarım mil uzunluğu hesaplanır. Çizgi aracı görüntü J kullanarak, görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak bir Milli Kutbu'ndan iğ midzone olduğunu bir çizgi çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir.</li>
	<li>Kromozom hizalama durum satırı ölçüm aracını kullanma iğ midzone kromozom Uzaktan değerlendirilmesi tarafından belirler. Görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi için kromozom iğ midzone çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir. Kromozomlar iğ midzone üzerinden 4 µm den büyük hizalanmamış 18olarak kabul edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thoma, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+infertility+in+the+United+States+as+estimated+by+the+current+duration+approach+and+a+traditional+constructed+approach.">Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach.</a> Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).</li><li>Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+estimates+of+infertility+prevalence+and+treatment-seeking:+potential+need+and+demand+for+infertility+medical+care.">International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care.</a> Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).</li><li>Treff, N. R., Zimmerman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Preimplantation+Genetic+Testing+for+Monogenic+Disease+and+Aneuploidy.">Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).</li><li>Franasiak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+aneuploidy+with+increasing+age+of+the+female+partner:+a+review+of+15,169+consecutive+trophectoderm+biopsies+evaluated+with+comprehensive+chromosomal+screening.">The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening.</a> Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Scott, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+biopsy+with+comprehensive+chromosome+screening+and+fresh+embryo+transfer+significantly+increases+in+vitro+fertilization+implantation+and+delivery+rates:+a+randomized+controlled+trial.">Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single+blastocysts+for+fresh+transfer+via+standard+morphology+assessment+alone+and+with+array+CGH+for+good+prognosis+IVF+patients:+results+from+a+randomized+pilot+study.">Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study.</a> Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+preimplantation+genetic+diagnosis+for+aneuploidies+in+advanced+maternal+age:+a+randomized,+controlled+study.">In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study.</a> Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Aurora+Kinase+B+and+C+variants+associated+with+maternal+aneuploidy.">Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy.</a> Mol Hum Reprod. , (2017).</li><li>Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+PLCbeta1+in+mouse+eggs+change+calcium+oscillatory+behavior+following+fertilization.">Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization.</a> Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).</li><li>Armstrong, J. A., Schulz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+and+force+behind+kinetochore+orientation:+lessons+from+meiosis.">Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).</li><li>Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+B+modulates+chromosome+alignment+in+mouse+oocytes.">Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes.</a> Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).</li><li>Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+anaphase-promoting+complex+activation+in+mouse+oocytes+is+predicted+by+microtubule-kinetochore+attachment+but+not+by+bivalent+alignment+or+tension.">Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension.</a> Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+threonine+3+on+histone+H3+by+haspin+kinase+is+required+for+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol,+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin,+Eg5.">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl genetik varyantların anlamak için yararlı olan erkek etkisi olabilir iken mayoz insan germ hücreleri için benzer tabi düşük maliyetli, manipulable yumurtalar hazır bir kaynak sağlanması sırasında insan yumurta kullanılarak impracticalities atlar doğurganlık.
Çünkü bu yöntemler fare yumurta mikroenjeksiyon yolu ile insan proteinin Ektopik ifade istihdam, ilk önce bir konsantrasyon kontrolü, segregasyonun olgunlaşma değiştirmez vahşi tipi RNA yapmanız önemlidir. Bu segregasyonun olgunlaşma Kinetik olduğunu tavsiye edilir (nükleer zarf gruplarına göre kutup vücut ekstrüzyon) temel parametreleri ve değerlendirilmesi iğ ve kromozom morfolojisi kurmak için denetim yumurta içinde izlenir. Buna ek olarak, tek tip mikroenjeksiyon birimleri sağlanması grupları karşılaştırmak için önemlidir. Faiz gen floresan etiketinde de dahil olmak üzere bu teknik sorun basitleştirebilirsiniz. Oosit mikroenjeksiyon mastering için teknikleri daha önce gösterdiği 15olmuştur. Floresan mikroskop ya da protein ifade western blot yoluyla belirleme altında enjekte yumurta görselleştirme tutarlı enjeksiyon konsantrasyonları doğrulanması için değerli araçlar mevcuttur.
Kromozom segregasyon memeli yumurta içinde hataları embriyonik anöploidi ve gebelik kaybı5önde gelen nedenidir olduğundan, kinetochore-Mikrotubul ekleri analizini sağlamak bir gen ilgi olup olmadığını değerlendirmek için değerli bir araç etkiler Kromozom ayrımı (Yani uygunsuz ekleri mis segregasyon neden olur). Soğutulmuş medya 10 dk maruz görselleştirme istikrarlı eklerin confocal mikroskobu 24üzerinden sağlayan bir kinetochore-Mikrotubul eki yapmadığınız mikrotübüller depolymerize yeterli olur. Bu tahlil için bu istikrarlı mikrotübüller bozulumu için yol açacak gibi yumurta aşırı soğuk değil önemlidir. Buna ek olarak, optimizasyon yordamlar boyama görselleştirme kinetochore ve Mikrotubul yapıları için anahtardır. Analiz, küçük adımlar için yeterli görüntü çözünürlüğü sağlamak için (≤ 1 mikron) z-uçak 40 x-63 x kullanarak amaç yakalanması ve tüm ekleri emin olmak için tüm iğ yapısında alma görüntülerdir görünür. Var yaygın olduğuna dikkat edin bekâr kinetochores sırasında prometafaz mayoz, ben 25.
Kromozom hizalama sınama tahlil kazanç veya işlev kaybı türevleri değerlendirme için yararlıdır. Kazancı işlevi değişik fare yumurta genç kadın üzerinden anöploidi seviyesinin düşük olduğundan değerlendirmek zor olabilir. Bu tahlil oosit deneysel İndüklenmiş yanlış kinetochore-Mikrotubul ekleri düzeltmeniz gereken bir durum oluşturarak bu engeli üstesinden gelir. Bir mutant artan hizalama verimliliği (yetenekleri olacakYani daha iyi uyum sağlayıp sağlamadığını belirlemek için ölçülebilir bir senaryo kurtarma sağlar sonra içinde 1-2 yanlış hizalanmış kromozomlar denetim yumurta içeren bir zaman noktası oluşturma korumak euploidy). Kromozom hatalı hizalaması, içinde hangi kromozomlar iğ üzerinden 4 mikron daha büyük midzone karakterizedir gibi hizalanmamış olabilir bir daha önce oluşturulmuş protokol miktar için kullanılan 18yaşında.
İşlev kaybı türevleri çalışmaya, ek deneysel koşullar nedeniyle çalışma sistemi içinde endojen homolog gereklidir. Bu sorunu hafifletmek için bir ilgi türevi bir nakavt fare modeli oluşturmak veya kullanmak için yoludur. Keskin/Cas9 sistem gelişiyle böyle knockouts 26oluşturmak için hızlı bir yol sağlayabilir. Alternatif olarak, bir nakavt model bir seçenek değilse, antianlamlı morpholino oligonucleotides veya küçük müdahale RNA'ların ortak enjekte gibi klasik devirme teknikler istihdam olabilir. Ancak, sıra tasarım dikkatleri microinjected değişken altında eğitim potansiyel bir girişimi engellemek için gereklidir. Örneğin, morpholino Oligonükleotid 5' Çevrilmeyen bölgesi (5' UTR) bağlamak için mikroenjeksiyon yolu ile tanıtılan insan mRNA versiyonu dahil değildir fare genin tasarlanabilir. Küçük müdahale kullanıyorsanız RNA'ların bir homolog sırası bölge hedef veya hedefleme kaçmasına insan gen sessiz noktası mutasyonların tanıtmak olabilir. Ancak, insan genomu heterozigoz durumda adl değişik olarak endojen protein kopya hala mevcut varyant ifade sahip bilgilendirici olabilir.
Son olarak, bu protokol için açıklanmayan rağmen kromozom anöploidi değerlendirme kolayca bir araya geldi II yumurta son tahlil insan varyant analizi için boru hattı olarak değerlendirilebilir. Bu in situ yaymak kromozom Protokolü ayrıntılı bir açıklama daha önce 15nitelendirdi. Kısaca, tedavi fiksasyon önce bir segregasyonun iğ depolymerizing maddesi ile aşağıdaki bir araya geldi II sahne gelinceye microinjected yumurta olgunlaştı vitro vardır. Kinetochore ve burada açıklandığı gibi kromozom boyama kromozom içerik değerlendirilmesi için izin verir.
Fare yumurta değerli bir araç proteinler için kadın mayoz kritik çalışma için bazı sınırlamalar modeli EXIST için sunarken. Overexpression proteinlerin segregasyonun olgunlaşma huzursuz ve bu nedenle bir RNA konsantrasyonu bir fenotip neden değil olmayabilir. Buna ek olarak, endojen fare homolog eksojen insan proteini lokalizasyonu ile girişime neden olabilir. Nakavt fare modelleri nesil bu soruna bir çözüm sağlar; Ancak, bu tüm durumlarda mümkün olmayabilir. Alternatif bir yaklaşım ortak RNAi enjekte edilerek fare protein tüketmek olacaktır veya morpholino oligonucleotides eksojen RNA ve protein değil hedef için tasarlanmış. Son olarak, birçok protein arasında homolog olmakla birlikte bu unutmamak önemlidir insan ve fare, farklılıklar var, Yerelleştirme ve türler arası analiz bu tür engel işlev farklılıkları lider. Daha ucuz ve daha ortak yer Cas9-genom düzenleme27 gibi genetik manipülasyon araçları olmak gibi bu protokol üzerinde mikroenjeksiyon güvenmek yerine çakma, insanlaşmış fare hatları içine yapım gelişmeye.

Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3' tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve daha kısa bir süre için bu strateji sonuçlandı çünkü tek kromozom normal (euploid) embriyolar rahim transfer için seçme yararı sermiştir gebelik 6,7,8,9ulaşmak. Bu nedenle, insan anöploidi etyolojisinde anlama önemli etkileri yardımcı üreme olabilir.
Aneuploidies için ön-implantasyon genetik test kısırlık tedavi sonuçlarının karşılaştırılması yararlı olmakla birlikte, nasıl aneuploidies kaynaklanan kapsamlı bir anlayış hala eksik. Bu yaygın segregasyonun aneuploidies (gamet üretim sırasında kökenli) ve maternal yaş, ancak, onların belirli yaş 4için ortalama oranı sapma bazı kadınlar mevcut embriyonik anöploidi oranları pozitif bir korelasyon olduğu kabul edilir. Bu gibi durumlarda yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil öneririz. Diğer faktörler gen türevleri gibi embriyonik anöploidi riski artan bir rol oynayabilir.
Bir gen varyantı anöploidi potansiyel katkısını oosit mayoz sırasında araştıran bir anahtar hızla segregasyonun gen işlevini değerlendirmek için bir sistem tasarımı için yönüdür. Etik kısıtlamaları ve sınırlı erişim nedeniyle, insan yumurta kullanılarak bu deneyler yapmak zordur. Bu sorunları fare yumurta kullanarak atlatılabilmişlerdir, ve deneyleri mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için bir dizi ben burada açıklanan. Mesajcı RNA (mRNA) faiz gen türevi için kodlama microinjecting tarafından fare yumurta insan protein lokalizasyonu olabilir görüntülenir ve vahşi-türü ve mutasyona uğramış insan proteini Ektopik ifade herhangi içinde sonuçları belirlemek için kullanılan fenotipik değişiklikler anöploidi için neden olabilir. Bu protokolü kazanç ve fonksiyon kaybı araştırmak için kullanılabilir, bu fenotipleri bir artış için uygun olmayan kız kardeşimin kinetochore ve metafaz, kromozom hizalamasını mayoz ı. önemlisi desteklemek için yetersizlik iliştirdiği mikrotübüller içerir. oosit mayoz önemli olaylar gibi meydan okumak için belirli deneysel koşullar kurarak genetik varyantların bina ve kromozom hizalama 10iğ.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.

Vitro sonra transkripsiyon kaliteli RNA (1.8-2.2) A260/A280 oranını ve ne zaman bir Spektrofotometre kullanarak ölçülen bir A260/A230 oranı ≥1.7 olacak. Şekil 1 ' deki resmi vitrogeçiş gösterir-RNA üzerinde denaturing bir özel Jel Elektroforez sonra üretilen. Desen veya çoklu boy bands sahip bir örnek bulaşmış bir grup kirlenme veya bozulması örnek gösterebilir. Alternatif olarak, birden çok grup mRNA değil tamamen denatüre veya başlangıç plazmid değil tamamen doğrusallaştırılmış olduğunu gösteriyor olabilir. MRNA mRNA içinde vitroistikrarlı ifade veren pIVT inşa Poli-adenylated kuyruk yüzünden tahmin daha büyük çalışır. Mikroenjeksiyon sonra tek tip enjeksiyon birimleri ve floresan mikroskobu ile ifade düzeyleri sağlamak için önerilir. Şekil 2 resimde profaz-tutuklandı yumurta düzgün Gfpile enjekte gösterir. Tutarlı mikroenjeksiyon tekniği bu iletişim kuralı için önemlidir. Görüntü analiz yazılımı, görüntü J gibi homojenlik ve teknik ustalık sağlamak için ifade düzeylerini doğrula için kullanılabilir. Not hücre altı yerelleştirme bilgi görüntüleme için her iki deneyleri yaparken elde edilebilir. Bir gen varyantı etkilerini değerlendirirken tüm mikroenjeksiyon deneyler için vahşi tipi gen yumurtalar bir denetimi hizmet kümesini içine enjekte. Bu bir fare oosit bir potansiyel overexpression fenotipleri insan gen için denetime izin verir. PBS veya Gfp yapıları, fluorophore etiketli için olması gerektiğini de yumurta mikroenjeksiyon kaynaklı fenotipleri için denetime bir alt içine enjekte. Floresan etiketi olmadan yapıları için Gfp mRNA yeterli mikroenjeksiyon emin olmak için ortak enjekte olabilir. İki veya daha fazla yapıları aynı anda birlikte enjekte öyle ki nihai çözüm 500 ng/µL her mRNA içerir mRNA konsantrasyonu artırmak emin olun.
Soğuk-kararlı Mikrotubul tahlil kinetochores mikrotübüller için eki durumunu değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Şekil 3 z projeksiyon bir metafaz confocal mikroskop görüntünün olduğunu ben yumurta. Bu yumurta soğuk ortam tedaviye kinetochores için bağlı değil tüm mikrotübüller depolymerize maruz bırakıldı. Bu yumurtalar tavsiye için yeterli bir süre kromozomlar (çok kısa sonuçlarında çok fazla lifleri) veya eksikliği lifleri hep birlikte bağlı değil Mikrotubul lifleri (çok uzun sonuçlarında hiçbir Milli yapı) içerir ve bu tedavi yumurta analizde kullanılan. Mayoz metafaz ben bekâr veya yanal ekli kinetochores içeren yumurta için ortak, bu nedenle bu bir kontrol grubu herhangi bir ek çalışma odasında kullanılması önerilir. Ortalama olarak, vahşi tipi yumurta kinetochores de MI olacak % 5-10'u içermez henüz stabil ekli 19yaşına. Tüm yumurta kinetochore-Mikrotubul ek durum analizi için aynı aşamada olması esastır. Bu deneysel sağlamak ve grupları denetlemek için benzer zaman ölçekleri ile olgun hücre döngüsü Kinetik değerlendirmek için tavsiye öyle. Bu tahlil gerçekleştirmek için denetim ve deneysel yumurtalar bir alt kümesini olgunlaştı ve canlı hızlandırılmış microcopy altında görüntülenir. Yayın milrinon ile eksik medya içine izin öyle ki yeniden başlamasını mayoz aynı saat 20yumurta eşitlenecek mayoz profaz içinde ben, milrinon kullanımına izin verir. Yumurta kontrol ve deneysel grupları bir kutup vücut, mayoz II (II) bir araya geldi, benzer zaman noktalarda metafaz yüksekliğe gösterge A'ya. Live-cep mikroskobu yoksa, yumurta Met'e olgunlaştı ben (7 saat) ve bir araya geldi sabit ve lekeli DNA ve mikrotübüller daha önce anlatıldığı gibi algılamak için II (16 h). Met ı ve II bir araya geldi bir varil şeklinde, iki kutuplu iğ görünür olmalıdır. Denetim yumurtalar, kromozomlar metafaz plaka uyumlaştırılması gerekmektedir. Kromozomlar hizalamasını değişken etkiler bağlı olarak deneysel gruplardaki farklı olacaktır, ancak, kromozomlar yoğunlaşmak ve mikrotübüller için kromozomlar iğ üzerinde merkezi bir konumda bulunan çoğunluğu ile bağlı. Yumurtalar benzer bir dizi mayoz II kontrolü ve deneysel grupları ulaşmış olmanız gerekir. Eki belirleme zorlukları azaltmak için bu önerilir durumu z-uçak, küçük adımlarla yumurta Imaging belirli çalışma amaç için optimize. Analiz z-dilimleri ayrı ayrı görüntülenmesini içerir ve mikrotübüller bağlı hangi kutup belirlemek için birleştirilmiş ayarlarında dan sızmak. Şekil 3B anormal kinetochore-Mikrotubul ekleri örnekleri gösterilmektedir. Hangi tek bir kardeş kinetochore çifti bir hiçbir ek olarak tanımlanan bir Milli Mikrotubul bağlı olduğu bir bivalent gösterilir. Ardından, syntelic eki hangi her iki kardeş kinetochore çiftleri aynı iğ kutup bağlı gösterilir. Son olarak, merotelic eki hangi bir kardeş diğer kız kardeşi ise her iki Milli Polonyalılar kinetochore bağlı olduğu gösterilmiştir kinetochore çiftinin tek iğ direğe bağlı.
Şekil 4 Albümdeki kromozom hizalama sınama tahlil adımları boyunca bir hamle olarak ilerici beklenen DNA ve Milli yapılandırmaları gösterilmektedir. Bu tahlil farklı deneysel grupları aracılığıyla mayoz benzer Kinetik ile ilerleme önemlidir. Açıklandığı gibi daha önce bu önce meydan tahlil iletken hücre döngüsü Kinetik analizleri tamamlamak için tavsiye. Bu tahlil başarıyla anormal kinetochore-Mikrotubul ekleri düzeltmek yumurta için yetenek değerlendirilir. Bu test etmek için yumurta ilk Met'e olgunlaştı ben kurulabilmesi için kinetochore-Mikrotubul eklere izin vermek için. Daha sonra yumurta monastrol ve iki kutuplu iğ monopolar iğ 21çöker Kinesin 5 (EG5) inhibitörü, inkübe. Monopolar iğ nesil % 100 yanlış Mikrotubul-kinetochore ekleri neden olmaktadır. Monastrol inhibitörü sonra kurtarma izin vermek için yıkanır. İyileşme süresi sırasında yumurtalar İki kutuplu bir iğ yeniden ve Mikrotubul ekleri düzeltmek için çalışır. Proteasome inhibitörü MG132 ilavesi anafaz başlangıçlı engeller. Bir denetim olarak yumurta her deney grubu üzerinden küçük bir alt-ebilmek saptanmak protokol içinde her aşamada (ı, tedavi, monastrol bir araya geldi kurtarma sonrası) tüm grupları yanıt tedaviler ve aynı ölçüde emin olmak için. Metafaz ben yumurta metafaz plaka hizalanmış kromozom ile namlu şeklinde bipolar iğ içermelidir. Monastrol ile tedavi yumurta monopolar iğ tek kutup odaklı kromozom ile içermelidir. Kurtarılan yumurta bir kez daha bir varil şeklinde bipolar iğ içermelidir. Kromozom hizalama herhangi bir kromozom tanımlanan iğ midzone 22daha--dan 4 mikron. DNA ve kinetochores her iki kinetochores bu sadece DNA tespit kullanarak belirlemek zor olabilir bu Merkez bölgesi dışından şunlardır Eğer kurmak için algılamak için yumurta leke yararlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57442/57442fig1.jpg"> Şekil 1. Denaturingagarose Jel Elektroforez RNA'ın. RNA kalite ve boyutu üzerinde bir denaturing özel Jel Elektroforez tarafından tespit edilebilir. Denaturing jel ikincil yapı oluşumunu önlemek için tavsiye edilir. 1 yolu için bir RNA moleküler ağırlık işaretçisi içerir. 2 yolu için bir RNA örneğidir. Not RNA yerleşik polyA kuyruk nedeniyle hesaplanan daha büyük çalışır. <a href="/files/ftp_upload/57442/57442fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57442/57442fig2.jpg"> Şekil 2. Oosit mikroenjeksiyon doğrulanıyor. Floresan mikroskopi başarılı oosit mikroenjeksiyon ve ifade doğrulamak için kullanılabilir. Gfp ile microinjected profaz-tutuklandı yumurta inşa gecede ifadeden sonra gösterilir. Bu resmi Invitrogen EVOS FL görüntüleme sistemi GFP ışık küp ile donatılmış otomatik kullanarak elde edildi. Ölçek çubuğu var. 100 µm <a href="/files/ftp_upload/57442/57442fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57442/57442fig3.jpg"> Şekil 3. Kinetochore-Mikrotubul ekleri değerlendirilmesi. (A) A temsilcisi z-projeksiyon soğuk tedavi ben oosit tanıştım. İğ (yeşil), kinetochores (kırmızı) ve DNA (mavi) görüntülenir. Kutuyu görme duyusuyla ilgili vınlamak bölge gösterir. Ok uçları son tarihinde tek bir bivalent mikrotübüller kinetochores, ekleri göstermek. Ölçek çubuğu iğ, kinetochore, DNA ve kanalları Birleştir için 10 µm var. Ölçek çubuğu görme duyusuyla ilgili vınlamak için 5 µm. (B) anormal kinetochore-Mikrotubul eki türü örnekleri fare yumurta var. Oklar kinetochore-Mikrotubul eki siteleri gösterir. Ölçek çubuğu var. 5 µm <a href="/files/ftp_upload/57442/57442fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57442/57442fig4.jpg"> Şekil 4. Kromozom hizalama sınama tahlil. Yumurtalar her adımda temsilcisi z-projeksiyonları ile akış şeması yordam. Yumurta ilk mayoz metafaz için olgunlaştı ben (Ben araya), o zaman monopolar iğ oluşumu ikna etmek 2 h için monastrol içeren yeni bir tabak transfer. Sonraki yumurta proteasome inhibitörü (MG132 3 h için anafaz başlangıçlı önlemek için) ile takıma olgunlaşma ortamda kurtarmak için izin verilir. Bir kez kurtarılan yumurta spindle (yeşil), kinetochores (kırmızı) ve DNA (mavi) için etiketli, sabit ve hizalama durumunu belirlemek için confocal mikroskobu ile görüntüsü. Hatları Milli (40 µm) uzunluğunu belirtmek ve Pisagor teoremi denklemi kullanarak kararlı midzone (20 µm) iğ. Oklar her kutup noktası aracı pozisyonlarında gösterir. Herhangi bir kinetochores > Milli midzone üzerinden 4 µm olarak kabul edilir hizalanmamış. Yıldız işareti hizalanmamış kromozom (midzone 5.6 µm) gösterir. Ölçek çubuğu var. 10 µm <a href="/files/ftp_upload/57442/57442fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Nanyang Technological University

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Görüntüleme.  IVI-RMA New Jersey. İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Video: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genetik

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Gelişim Biyolojisi

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Farelerin Profaz Tutuklu Oositlerinde DNA Hasarının Belirlenmesi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi