Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.

1. Moleküler klonlama
<ol><li>Gen faiz ve plazmid vitro transkripsiyon (pIVT) vektör11tam uzunlukta kodlama dizisi elde edilir. Not: Tam uzunlukta cDNA klonlar çeşitli satıcılardan ticari olarak kullanılabilir veya ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yolu ile oluşturulabilir. Dışavurumu sıra (EST) veritabanları öğesini ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) online kaynak için Ulusal Merkezi transkript dizileri genler için nükleotit sağlar. Protein kolaylığı için görselleştirme ve analiz ifade düzeyleri, füzyon yeşil flüoresan protein (Gfp) veya başka bir uygun floresan etiket klonlama stratejisinde istenen.</li>
	<li>Doğrulanmış bir klonlama strateji kullanarak, ilgi genin kodlama dizisi pIVT birden çok klonlama bölgesine ekleyebilirsiniz. Moleküler klonlama ayrıntılı bir açıklama ve gerekli adımları daha önce açıklanan 12olmuştur. Not: bir gen-füzyon ürün oluşturulacak ise, klonlama uygun okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Doğru gen ekleme, uygun çerçeve fusion ve hiçbir polimeraz kaynaklı nokta mutasyonlar oluşturulan emin olmak için globin primerler kullanılarak inşa etmek sıra. Not: Sanger DNA sıralama ekipman kullanılabilir değilse, birçok şirket düşük maliyetli DNA Sıralama seçenekleri sunuyoruz.</li>
	<li>DNA tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) veya ekleme/silme (INDELS) üreten varsa mutagenize. DNA mutagenesis adımları 1.5-1.7 açıklanmıştır. Vahşi-türü yapıları için Doğrusallaştırma adım 1.7 ile devam edin.</li>
	<li>Mutagenesis astar tasarım ve üreticinin iletişim kuralı başına mutant yapı oluşturmak için mutagenesis PCR reaksiyon tamamlayın. PCR-aracılı site yönettiği mutagenesis yukarıda açıklanan 13oldu. Ayrıca, birçok şirket iletişim kuralları içerir sitesi yönetmen mutagenesis kitleri teklif.</li>
	<li>Mutagenized DNA'sı bakteriyel konak dönüşümü. İzole ve plazmid arındırmak. Not: Birçok şirket kolayca ayırmak ve plazmid DNA arındırmak için kullanılan kitleri olun. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. E. coligibi gram-negatif bakteri zorlanma kullanıyorsanız, endotoxins kaldırır bir kit kullanılması önerilir.</li>
	<li>Bakteriyel transformants getirilmesi istenen SNP veya INDEL onaylamak için standart Sanger DNA sıralama kullanarak izole DNA'dan sıra.</li>
	<li>Son ürünler tek restriksiyon enzimi sindirim saf DNA kullanarak linearize. Not: PIVT vektör birden çok tek-enzim Addgene 14plazmid haritada listelenen siteler kesmek içerir.</li>
	<li>Ürün özel Jel Elektroforez ile doğrusal olduğundan emin olun. Özel Jel Elektroforez yöntemi önceden tanımlanmış 14oldu. Not: tüm kalan adımları için kararlı, yüksek kaliteli RNA üretimini sağlamak için bariyer (filtre) damlalıklı ipuçları ve RNase içermeyen malzemeler kullanın.</li>
	<li>Doğrulanmış bir DNA temizlik Protokolü veya kit kullanılarak sindirilir ürün arındırmak ve 30 µL RNase/Dnaz-Alerjik suda elute. Not: silikat-matrix spin sütunlara göre kitleri için yüksek kaliteli, tavsiye edilir saf DNA. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin.</li>
	<li>
Vitro T7 polimeraz üreticinin protokol sonrası kullanarak DNA uyarlamak.</li>
	<li>Arındırmak ve RNA RNase/Dnaz ücretsiz su üreticinin protokol sonrası bir silikat-matrix spin sütunlara göre nükleik asit arıtma kit kullanarak 30 µL içinde elute.</li>
	<li>Denaturing özel Jel Elektroforez son RNA ürün boyutu onaylamak için formaldehit kullanarak gerçekleştirin. 14aşağıdaki adımları 1,13-1.22 bakın. (Şekil 1).</li>
	<li>Jel 72 ml 1 g özel Isıtma tarafından eriyene kadar su hazırlamak, sonra 60 ° C'ye serin</li>
	<li>10 X 0.4 M BEZLERİ (pH 7,0), 0.1 M sodyum asetat ve 0.01 M EDTA ekleyerek tampon çalıştıran MOPS hazırlayın.</li>
	<li>10 mL 10 X MOPS tampon ve % 37 formaldehit (12,3 M) 18 mL soğutmalı özel çözüm çalışan ekleyin.</li>
	<li>Kast özel çözüm bir jel şekillendirme konteyner içine dökme tarafından jel. 10 µL kapsayacak kadar geniş bir tarak kullanın. Jel belirledi ve dokunmak için sert olması sonra yavaşça tarak kaldırın.</li>
	<li>Jel Elektroforez tank montajı ve yeterli 1 X arabellek, çalışan jel tamamen kaplıdır sağlanması MOPS ekleyin.</li>
	<li>RNA örnek formaldehit içeren yükleme boya 0.5 X birimlerine RNA'ın 1 µg ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Etidyum bromür 10 µg/mL bir konsantrasyon RNA çözüm ekleyin.</li>
	<li>RNA örnek çözümü 5 min için 70 ° C'de denatüre.</li>
	<li>Steril kullanarak 10 µL filtre ipuçları, molekül ağırlığı işaretleyicinin 5 µL yük ve RNA'ın 5 µL jel ayrı kuyu sample(s) ve boya jel uzunluğu en az üçte göç kadar 5 V/cm electrophorese.</li>
	<li>Bir UV trans ışığı üzerinde jel RNA görselleştirin. RNA moleküler ağırlık işaretçiyi karşılaştırarak doğru boyutu olduğundan emin olun.</li>
	<li>Konsantrasyon ve RNA saflığı ölçmek için steril 10 µL filtre ipuçları UV Spektrofotometre üzerine kullanarak arıtılmış RNA'ın 1.2 µL aktarın. Not yüksek kaliteli RNA A260/280 (1.8-2.2) ve 260/230 Absorbans oranları olmalıdır (> 1,7) anılan sıraya göre.</li>
	<li>10 µL filtre ipuçları, aliquot kalan saf RNA steril 0.5 µL santrifüj tüpler içine (3-5 µL/tüp) kullanarak. Mikroenjeksiyon için hazır kadar tüpler-80 ° C'de depolayın. Not: 500 ng/µL son enjeksiyon yoğunlukta bir en iyi başlangıç noktasıdır. Bu RNA 1: 2'RNase H20 RNA yapışkanlık mikroenjeksiyon pipet içinde azaltmak için mikroenjeksiyon öncesinde ücretsiz sulandırmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>2. kinetochore-Mikrotubul ek tahlil
<ol><li>Yumurtalar mikroenjeksiyon için eşit gruplara bölün. Not: Yumurta toplama, transfer, mikroenjeksiyon ve segregasyonun olgunlaşma tarif edilmiştir ayrıntılı olarak Jüpiter daha önce 15.</li>
	<li>Deneysel mRNA içeren bir grup ve diğer grup WT denetim ve PBS veya Gfp ile microinject mRNA. Not: 500 ng/µL 10ile başlamak için önerilen enjeksiyon bölgedir. Bir picoinjector enjeksiyon tutarları kontrol etmek için kullanılabilir. 5-10 pL bir enjeksiyon hacmi 15önerilir.</li>
	<li>Bir yumurta (100-150 µm), transfer yumurta içine bir kültür ortamında milrinon içermeyen bir petri 100 µL damla çapı daha büyük embriyo kalitesi madeni yağ kaplı bir el ya da ağız nerede cam pipet açılış işletilen pipetting aparatı biraz olduğunu kullanarak ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek için %5 C02 37 ° C'de 7 h için kuluçkaya ben (Met) 15.</li>
	<li>Yukarıdaki gibi aynı pipet cihazları kullanarak kuluçka sonra yumurta önceden soğutulmuş minimum temel medya (MEM) koleksiyon orta iyi Center'da 700 µL ve 500 µL H20 dış halkası içeren bir merkezi-şey organ kültür çanak içine aktarmak ve 7 dakika buzda çanak yerleştirin. Not: Önceden MEM medya soğuk ve de organ kültür yemekleri için en az 20 dk önce yumurta tedavisinde-20 ° C'de ortalamak için önerilir.</li>
	<li>Yumurta % 2 paraformaldehyde 1 X PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde 400 µL içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanarak aktararak düzeltmek.</li>
	<li>Kullanarak pipet aparatı, yumurta başka bir kuyunun içine 400 µL engelleme çözüm (PBS + % 0,3 BSA + % 0,01 ara-20 + %0,02 NaN3) ve mağaza içeren spot bir tabağa aktarın. immunostaining için işlemek için hazır kadar 4 ° C'de. Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için.</li>
	<li>Aynı pipet cihazları kullanarak, bir yerde yeni bir kuyu için transfer yumurta içeren 400 µL permeabilization çözüm (PBS % 0,3 BSA + %0.1 TritonX-100 + %0,02 NaN3) plaka ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle üç üzerinden hızlı bir şekilde Transfer yumurtalar kuluçkaya 400 µL damla herhangi bir kalıntı deterjan kaldırmak için çözüm engelleme. Not: Bir 9-şey açık cam spot tabak iyi grupları birden fazla tedavi ile tek bir yemek (Adım 2.4-2.5) üzerinde hareket etmek için çalışır.</li>
	<li>Kalan immunocytochemistry yordamları bir oksijen odasında ışık oda sıcaklığında korunan gerçekleştirmek. Kullanım bir orta ölçekli plastik konteyner nemli kağıt havlu ve alüminyum folyo ile kapatın ile kaplı.</li>
	<li>Pipet cihazları kullanarak, yumurtalar için 30 µL transfer çözüm bir 96-şey plaka ve oksijen Odası 10 dk içinde yer kapağındaki engelleme. Not: Damla plaka üzerinde dairesel boynundaki yerleştirilir.</li>
	<li>Sentromerler ve Milli, pipet cihazları kullanarak etiket, yumurtalar için 30 µL transfer için anti-centromeric antijen (ACA, Crest) içeren çözüm engelleme (1:30) ve anti-acetylated tübülin (1: 1000) ve en az 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalar üç 30 µL damla 10 min için çözüm engelleme yoluyla aktararak durulayın.</li>
	<li>Pipet cihazları, transfer yumurta kullanarak için 30 µL engelleme çözüm ikincil antikorlar (Anti-insan IgG 1: 200, Anti-fare IgG 1: 200) kullanılan antikor için ücretsiz içeren bırakın ve 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>3, 10 dk 30 µL durulama adımlarını yineleyin 2.11. adımda açıklandığı gibi çözüm engelleme.</li>
	<li>Pipet cihazları, 3-5 µL orta içeren DAPI montaj kullanarak yumurta transferi (5.9 µg/µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki.</li>
	<li>Vazelin 4 küçük damla (bir PIN kafa boyutunu) Yumurta kırma önlemek için kapak Not köşelerinde yer.</li>
	<li>Yavaşça kapak notu vazelin yan slayt yerleştirin.</li>
	<li>Mühür kenarları ile tırnak cilası temizlemek ve 5 min için kurumasını alışverişi coverslip.</li>
	<li>Slaytları işleme confocal mikroskobu ile kadar gelen ışık, korumalı 4 ° C'de depolayın. Not: montaj orta ve coverslip, maç Kırılma indisi kullanılmaktadır belgili tanımlık mikroskop objektif olun. Önerilen montaj malzemeleri daha önce olmuştur 15nitelendirdi.</li>
	<li>Görüntü 40-63 x amaç küçük adımlar yakalama confocal mikroskobunun kullanarak yumurta (≤ 1 µm) z-uçak, optimize edilmiş çalışma amaç ve görüntü metafaz iğ tüm bölge için. Not: 2.11 adımda kullanılan belirli ikincil antikorlar temel alan tüm 3 kanal görüntü emin olun. ≥ 4 ve zoom 3 ortalama görüntü için yeterli çözünürlük idealdir. 1 µm adım boyu mikrotübüller ve fare yumurta kinetochores açık görselleştirme sağlar. Yordamı fotoðraf çekmek için mikroskop mikroskop değişir. Lütfen nasıl mikroskop ayarlarını yapılandırmak için belirli adımlar için üreticileri confocal kullanıcı kılavuzuna bakın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları 2.21 2,23 takip düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak kinetochore-Mikrotubul eki durumunu tanımlar. Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. Ek durum türleri daha önce olmuştur 16 tanımlı.</li>
	<li>Dosya resim J araç çubuğuna sürükleyerek resmi aç.</li>
	<li>Açılan z-serisi, tüm kanallar görünür (DNA, kinetochore ve spindle) "renk" alt sekmesi altında "kanalları Birleştir", "görüntü" açılır menüsünde bulunan tıklayarak yapmak.</li>
	<li>Geçişi görüntü altındaki kullanarak, her z dilimli taşımak ve kinetochore Mikrotubul eki belirler. 16 ayrıntılı ek açıklamaları daha önce olmuştur açıklanan
</li>
</ol>3. kromozom hizalama Challenge tahlil
<ol><li>Pipet aparatı 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak, aktarım milrinon ücretsiz kültür orta petrol altında bir 100 µL damla içine yumurta ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek 7 h için kuluçkaya ben (Met) daha önce 2,3 17. adımda açıklandığı gibi . Not: Oosit toplanması, mikroenjeksiyon ve olgunlaşma yordamlar özetlenen daha önce 15. Ek tahlil Protokolü adım 2.1-2.2 denetimleri ve RNA mikroenjeksiyon konsantrasyonları bakın.</li>
	<li>Aynı pipet cihazları kullanarak, Merkezi-şey organ kültürüne transfer yumurta içeren 700 µL Kültür Merkezi iyi ve 400 µL H20 çevreleyen halka monastrol [100 µM] içeren orta çanağı ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalar, pipet aparatı olarak yukarıda, 100 µL CZB kültür orta, üç damla aracılığıyla kullanarak aktarma tarafından monastrol dışarı durulama ve yumurta içeren 700 µL kültür orta + MG132 yeni bir merkezi-şey organ kültür çanak transfer [5 mikron] Merkezi 3 h için yüzüğü. 400 µL H20 dış halka ekleyin.</li>
	<li>Yumurtalar, PBS içinde oda sıcaklığında 20 dakika için 400 µL % 2 paraformaldehyde içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanılarak aktarım tarafından tamir.</li>
	<li>Fiksasyon sonra yumurta transferi, pipet cihazları, şeffaf cam spot plaka 400 µL içeren yeni bir kuyunun içine kullanarak engelleme çözüm ve mağaza kadar 4 ° C'de işleme için immunostaining. Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için.</li>
	<li>Permeabilize ve yumurta immunocytochemistry via 2.6-2.16 adımlarda açıklandığı gibi etiket.</li>
	<li>Görüntü yakalama, 40-63 x amaç üzerinde confocal mikroskop kullanarak yumurta < 1 µm adım z-uçak metafaz iğ tüm bölge görüntü emin olmak istedim.</li>
	<li>Durum kromozom hizalamasını belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın. Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış.</li>
	<li>Görüntü resmi J kontrol paneline sürükleyin.</li>
	<li>Açılan z-serisi, nokta aracını (görüntü J kontrol çubuğu noktası aracı simgesini tıklatarak bulunur) kullanın aracı görüntüdeki Milli direk üzerine yerleştirip resmine tıklayarak onların anılan sıraya göre z-dilim her işmili kutbunda sonunda Puan işaretlemek için. Bu noktalar, Command + t klavye tuşlarına basarak faiz (ROI) Yöneticisi bölgesine ekleyin.</li>
	<li>Her adım 3.10 ROI Yöneticisi'nde belirli nokta vurgulama ve ölçü birimi düğmesini tıklatarak ayarlama pozisyonlar için belirli koordinatları belirleyin. Bu bir sonuçları sağlayacaktır tabloyu içeren x ve y koordinatlarını her noktası için. Bunlar sırasıyla X1, Y1 ve X1, Y2, Puan olacaktır.</li>
	<li>Daha sonra gerçek Z Koordinat belirleyin. Bu hangi Milli direk tespit z yığınındaki belirli z-dilim dilim sayısı çarpılarak yapılır (Yani dilim #2 / 6) bireysel her noktası yığının kalınlığı (Yani 1 µm) tarafından olan (örnek: 2 x 1 µm dilim = 2). Bunlar sırasıyla Z1 ve Z2 noktalarında olacak.</li>
	<li>Pisagor teoremi denklemi kullanarak iğ uzunluğunu belirleyin (2 + b2 = c2) önceden tanımlanmış kullanarak x, y ve z koordinatları adımlardan 3.11-3.13. Son uzunluğu her mil için eşittir: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>İğ midzone belirler. Bu yarım mil uzunluğu hesaplanır. Çizgi aracı görüntü J kullanarak, görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak bir Milli Kutbu'ndan iğ midzone olduğunu bir çizgi çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir.</li>
	<li>Kromozom hizalama durum satırı ölçüm aracını kullanma iğ midzone kromozom Uzaktan değerlendirilmesi tarafından belirler. Görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi için kromozom iğ midzone çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir. Kromozomlar iğ midzone üzerinden 4 µm den büyük hizalanmamış 18olarak kabul edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thoma, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+infertility+in+the+United+States+as+estimated+by+the+current+duration+approach+and+a+traditional+constructed+approach.">Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach.</a> Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).</li><li>Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+estimates+of+infertility+prevalence+and+treatment-seeking:+potential+need+and+demand+for+infertility+medical+care.">International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care.</a> Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).</li><li>Treff, N. R., Zimmerman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Preimplantation+Genetic+Testing+for+Monogenic+Disease+and+Aneuploidy.">Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).</li><li>Franasiak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+aneuploidy+with+increasing+age+of+the+female+partner:+a+review+of+15,169+consecutive+trophectoderm+biopsies+evaluated+with+comprehensive+chromosomal+screening.">The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening.</a> Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Scott, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+biopsy+with+comprehensive+chromosome+screening+and+fresh+embryo+transfer+significantly+increases+in+vitro+fertilization+implantation+and+delivery+rates:+a+randomized+controlled+trial.">Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single+blastocysts+for+fresh+transfer+via+standard+morphology+assessment+alone+and+with+array+CGH+for+good+prognosis+IVF+patients:+results+from+a+randomized+pilot+study.">Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study.</a> Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+preimplantation+genetic+diagnosis+for+aneuploidies+in+advanced+maternal+age:+a+randomized,+controlled+study.">In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study.</a> Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Aurora+Kinase+B+and+C+variants+associated+with+maternal+aneuploidy.">Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy.</a> Mol Hum Reprod. , (2017).</li><li>Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+PLCbeta1+in+mouse+eggs+change+calcium+oscillatory+behavior+following+fertilization.">Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization.</a> Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).</li><li>Armstrong, J. A., Schulz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+and+force+behind+kinetochore+orientation:+lessons+from+meiosis.">Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).</li><li>Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+B+modulates+chromosome+alignment+in+mouse+oocytes.">Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes.</a> Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).</li><li>Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+anaphase-promoting+complex+activation+in+mouse+oocytes+is+predicted+by+microtubule-kinetochore+attachment+but+not+by+bivalent+alignment+or+tension.">Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension.</a> Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+threonine+3+on+histone+H3+by+haspin+kinase+is+required+for+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol,+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin,+Eg5.">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl...

Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3' tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve daha kısa bir süre için bu strateji sonuçlandı çünkü tek kromozom normal (euploid) embriyolar rahim transfer için seçme yararı sermiştir gebelik 6,7,8,9ulaşmak. Bu nedenle, insan anöploidi etyolojisinde anlama önemli etkileri yardımcı üreme olabilir.
Aneuploidies için ön-implantasyon genetik test kısırlık tedavi sonuçlarının karşılaştırılması yararlı olmakla birlikte, nasıl aneuploidies kaynaklanan kapsamlı bir anlayış hala eksik. Bu yaygın segregasyonun aneuploidies (gamet üretim sırasında kökenli) ve maternal yaş, ancak, onların belirli yaş 4için ortalama oranı sapma bazı kadınlar mevcut embriyonik anöploidi oranları pozitif bir korelasyon olduğu kabul edilir. Bu gibi durumlarda yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil öneririz. Diğer faktörler gen türevleri gibi embriyonik anöploidi riski artan bir rol oynayabilir.
Bir gen varyantı anöploidi potansiyel katkısını oosit mayoz sırasında araştıran bir anahtar hızla segregasyonun gen işlevini değerlendirmek için bir sistem tasarımı için yönüdür. Etik kısıtlamaları ve sınırlı erişim nedeniyle, insan yumurta kullanılarak bu deneyler yapmak zordur. Bu sorunları fare yumurta kullanarak atlatılabilmişlerdir, ve deneyleri mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için bir dizi ben burada açıklanan. Mesajcı RNA (mRNA) faiz gen türevi için kodlama microinjecting tarafından fare yumurta insan protein lokalizasyonu olabilir görüntülenir ve vahşi-türü ve mutasyona uğramış insan proteini Ektopik ifade herhangi içinde sonuçları belirlemek için kullanılan fenotipik değişiklikler anöploidi için neden olabilir. Bu protokolü kazanç ve fonksiyon kaybı araştırmak için kullanılabilir, bu fenotipleri bir artış için uygun olmayan kız kardeşimin kinetochore ve metafaz, kromozom hizalamasını mayoz ı. önemlisi desteklemek için yetersizlik iliştirdiği mikrotübüller içerir. oosit mayoz önemli olaylar gibi meydan okumak için belirli deneysel koşullar kurarak genetik varyantların bina ve kromozom hizalama 10iğ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1602-4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well glass spot plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7812G17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21050</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21091</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA0356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corp</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:100 diution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td>
			<td>Antibodies Incorportated</td>
			<td>15-234</td>
			<td>1:30 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier (Filter) Pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM12635</td>
			<td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0445-07-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-07-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center Well organ culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25381-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (With cooling ability)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>any standard model&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 11 x 22 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6663F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6663-F10</td>
			<td>thickness will vary for particular microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC H20</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>888700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600400</td>
			<td>For DNA cloning&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes for linearizing pIVT</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>NdeI or KasI can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Fluorescent microscope may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>9311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde RNA loading dye</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Length cDNA Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#39;.&#160; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#39; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td>Vacutip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tupperware can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>27925901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Any Standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (NIH) Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid of 96 well plate</td>
			<td>Nalgene Nunc International</td>
			<td>263339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacVector&#160;</td>
			<td>MacVector</td>
			<td></td>
			<td>Sequence analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4659</td>
			<td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5310</td>
			<td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouthpiece</td>
			<td>Biodiseno</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for antivibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish; Clear</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any clear nailpolish can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax 10X Running buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>Thermo Scnentific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ Culture Dish 60x15mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>08-772-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.&#160;</td>
			<td>577773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 139 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>501V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 mm</td>
			<td>Falcon BD</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoinjector</td>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Flaming-Brown Micropipette puller</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVT plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>32374</td>
			<td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>493-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>200523</td>
			<td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>210512</td>
			<td>mutagenesis kit for single site changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Fine point)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Medium point)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>WP114225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Warmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Bioscienes</td>
			<td>309623</td>
			<td>1 ml, 27G(1/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>x-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>SN.743.12.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP UV/White lite transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UV95041501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.

Vitro sonra transkripsiyon kaliteli RNA (1.8-2.2) A260/A280 oranını ve ne zaman bir Spektrofotometre kullanarak ölçülen bir A260/A230 oranı ≥1.7 olacak. Şekil 1 ' deki resmi vitrogeçiş gösterir-RNA üzerinde denaturing bir özel Jel Elektroforez sonra üretilen. Desen veya çoklu boy bands sahip bir örnek bulaşmış bir grup kirlenme veya bozulması örnek gösterebilir. Alternatif olarak, birden çok grup mRNA değil tamamen d...

Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Görüntüleme.  IVI-RMA New Jersey. İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Video: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genetik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse splenocytes with the pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, and heat-killed Listeria monocytogenes and examine their effect on the molecular circadian clock. Previously, studies have focused on examining the influence of LPS on the molecular clock using a variety of in vivo and ex vivo approaches from an assortment of models (e.g., mouse, rat, and human). This protocol describes the isolation and challenge of splenocytes, as well as the methodology to assess clock gene expression post-challenge via quantitative PCR. This approach can be used to assess not only the influence of microbial components on the molecular clock but other molecules as well that may alter expression of the clock. This approach could be utilized to tease apart the molecular mechanism of how PAMP-Toll-like receptor interaction influences clock expression.

This protocol describes a technique using mouse splenocytes to discover pathogen-associated molecular patterns that alter molecular clock gene expression.

Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, the data obtained from rodent islets are often not fully reproduced in or applicable to human islets due to well-known differences in islet structure and function between the species. Currently, techniques that are available to manipulate gene expression of human islets are very limited. Introduction of transgene into intact islets by adenovirus, plasmid, and oligonucleotides often suffers from low efficiency and high toxicity. Low efficiency is especially problematic in gene downregulation studies in intact islets, which require high efficiency. It has been known that enzymatically-dispersed islet cells reaggregate in culture forming spheroids termed pseudoislets. Size-controlled reaggregation of human islet cells creates pseudoislets that maintain dynamic first phase insulin secretion after prolonged culture and provide a window to efficiently introduce lentiviral short hairpin RNA (shRNA) with low toxicity. Here, a detailed protocol for the creation of human pseudoislets after lentiviral transduction using two commercially available multiwell plates is described. The protocol can be easily performed and allows for efficient downregulation of genes and assessment of dynamism of insulin secretion using human islet cells. Thus, human pseudoislets with lentiviral mediated gene modulation provide a powerful and versatile model to assess gene function within human islet cells.

A protocol to create gene modified human pseudoislets from dispersed human islet cells that are transduced by lentivirus carrying short hairpin RNA (shRNA) is presented. This protocol utilizes readily available enzyme and culture vessels, can be performed easily, and produces genetically modified human pseudoislets suitable for functional and morphological studies.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...