Bu eser bir hibe desteği ile gerçekleştirilen 5R21HD080684-02, Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan gelişimi. Yazar Ken Cho onun sürekli coşku ve destek için teşekkür etmek istiyor. Yazar ayrıca değerli için Bruce Blumberg kamerasını, Rebekah Charney, el yazması ve Sean McNamara ve Marcin Wlizla Ulusal Xenopus kaynak (RRID:SCR_013731), eleştirel okuma kullanımı için kabul etmek istiyorum X. tropicalis beslenme ve hayvan bakımı rejimleri ile ilgili konuşmaları.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve University of California, Irvine kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. PGC nakli hazırlıkları
<ol><li>Diseksiyon araçları peşin, yukarıda açıklanan23hazırlayın. Not: Kaş saç bıçak embriyo ameliyatları gerçekleştirirken stabilize etmek için saç döngüsü yardımı ile insizyon yapmak için kullanılır. Kaş kıllar ve saç döngüler önce bir alev içinde çizilmiştir borosilikat Pasteur Pipetler cam içine yapıştırılmış ve inceltilmiş kısmı üzerinde kırık ( şekil 1A, bkz: ok ucu) daha kısa, dar ipucu (şekil 1B) için daha fazla beceri oluşturmak için ameliyatları gerçekleştirirken.</li>
	<li>SgRNAs yordamlar yukarıda açıklanan24 kullanarak oluşturun. Not: Kısaca, sgRNAs için kodlama kısa DNA şablonları bir hata içermeyen, opsonins DNA polimeraz ile komplementer 5' bakteriyofaj T7 rehberleri ve "dolu" içeren örtüşen deoxyoligonucleotides kullanarak oluşturulur. Vitro sgRNA sentez reaksiyonları (kullanılan seti bağlı olarak) bir gecede birkaç saat inkübe. Tepkiler Dnaz şablonu kaldırmak için tedavi. SgRNAs fenol/kloroform çıkarma ve amonyum asetat/isopropanol bulutlu, seti üreticisinin yönergeleri24göre standart yöntemlerle saf.</li>
	<li>Kısa bir süre microinjections gerçekleştirmeden önce Cas9-sgRNA kompleksleri hazırlamak ilk denaturing ~ 250 tarafından RNAse free (diethylpyrocarbonate-tedavi) H2O 60-65 ° c 5 dk, 3 µL toplam hacmine sgRNA ng takip hızlı soğutma tarafından on Ice 5 min için. SgRNA bir kaç saniyeliğine santrifüj kapasitesi, 1 µg/µL Cas9 protein 1 µL ekleyin ve 10 dk 37 ° C'de karmaşık oluşumu teşvik etmek için kuluçkaya. Not: Bu kuluçka tüp buza mikroenjeksiyon için embriyo hazırlarken tutulabilir.</li>
	<li>X. Tropicalis embriyo vitro fertilizasyon standart yöntemlerle, yukarıda açıklanan25elde. 25,26 de-jöle 10 dk sonrası döllenme, embriyo. Not: Gübreleme zamanı kabul edilir zaman sperm süspansiyon yumurta eklenir ve çanak 1/9thX ile sular altında olduğunu sonra Marc'ın modifiye Ringers (MMR)26. X. Tropicalis25, X. laevis, aksine gerçekleştirmek için de-1/9'jellying x MMR % 3 sistein ücretsiz Bankası (değil HCl tuzu), içeren birden fazla yıkama 1/9 tarafından pH 7.8-8.0 için ayarlanmış takip x MMR. Bir özel (% 1) embriyo transferi-boyalı çanak 1/9 içeren x MMR oda sıcaklığında.</li>
	<li>Hemen içeren 1 %1 özel kaplı bir yemek için enjekte edilebilir embriyo transfer Pasteur pipet kullanarak x MMR.</li>
	<li>
1-hücre aşamada enjekte. Başvurular26,27 Xenopus mikroenjeksiyon yöntemleri ayrıntılı açıklamaları için bkz.
	<ol>
<li>Hayvan pole, tek bir sitede her embriyo 4 ile enjekte nL Cas9-sgRNA Kompleks (son tutar = 1 Cas9 ve sgRNA ~ 250 pg ng; bkz: tartışma)24. Enjeksiyon Makinası şifa 10-20 dakika sonra 1/9 içeren bir özel kaplı yemek için embriyo transfer x MMR ve 25 ° C'de kuluçkaya Ayrıca uninjected kardeş bir fincan greft alıcılar görev yapacak embriyo oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
~ 5 mm içeren Petri tabak (60 mm) hazırlamak-0,3 içinde yapılan % 1'özel kalın tabaka nakillerine X. tropicalisveya 1 Eğer x MMR, x MMR X. laevisiçin.
	<ol>
<li>Çöküntü ~ 3-4 oluşturmak mm derin bir 3 ekleyerek-x (96-şey PCR plaka kesim tarafından oluşturulan) 4-şey kalıp içine erimiş özel plakaları dökme zaman (bkz: şekil 1 c ve D). Kalıp birkaç milimetre kadar özel sertleştirilmiş bir yüzük standına bağlı bir kelepçe kullanarak Petri kabına alt yukarıda tutun.</li>
		<li>Ayrıca, bir 24-şey plaka wells ile yapılan 1/9 ' % 1'özel ince bir tabaka kaplama tarafından ev bireysel embriyolar için yapmak x MMR. Not: Kültür bu kuyuları için eklendi 1/9 x MMR viomisin sülfat/mL 50 µg ile desteklenmiş ortamıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PGCs nakli
<ol><li>Ne zaman Nieuwkoop ve Faber28 blastula aşamasında 9 (şekil 2A), ~4.5 h ulaşmak sadece embriyoların sonrası döllenme (hpf) X. tropicalisiçin 25 ° C kuluçka makinesi çıkarıp ve oda sıcaklığında ek için equilibrate izin 0,5 h.</li>
	<li>5 nakli başlamak için hpf (şekil 2B), kullanmak Pasteur pipet (Cas9-sgRNA ile enjekte) bir PGC donör embriyo transferi (1.7. adımda oluşturduğunuz) çöküntü içinde 0,3 içeren 60 mm özel yemek için x MMR (veya 1 X. laeviskullanıyorsanız x MMR). Ayrıca bir uninjected kardeş embriyo, greft alıcıya bu çanak transfer. Not: Her biri bu embriyoların kimlikleri değil karışık önemlidir.</li>
	<li>El ile vitelline zarflar forseps kullanarak her embriyo kaldırmak ve böylece onların bitkisel Polonyalılar görünümünde ve ameliyat için erişilebilir her iki embriyo döndürün. Not: El ile de-vitellination embriyo açıklaması daha önce açıklanan26oldu.</li>
	<li>Bir kaş saç bıçak keskin ucu kullanarak, nerede blastopore işaretlemek gelecekteki şişe hücreleri oluşturacak bölge içinde alıcı embriyo bitkisel kutup bir kare şeklinde dört Sığ kesik olun. İnsizyon hemen altında yüzey ve yukarı doğru hareketleri saç döngüsü ile embriyo sabitleme Dilimleme olun embriyo içine kaş saç bıçak ucu ekleyerek olursunuz. Not: Yarım aralıklarla 4.5-7.0 hpf göstermek belgili tanımlık cep büyüklük ve şişe hücreleri (kesik çizgili beyaz daire) nerede oluşturacak tahmin etmek için bir kılavuz sağlamak için Şekil 2 bitkisel bir embriyo görünümlerini gösterir. Amaç kesik kesik kara kutu nerede belirtilir hale getirmektir.</li>
	<li>Bir kez kare dört tarafı kesikler tarafından belirlenen, her kesi bir derinlik, yaklaşık 1/3 1/2 mesafe blastocoel yere ulaşmak için benzer kesme hareketleri kullanarak kaş saç bıçakla derinleştirmek.</li>
	<li>Bitkisel doku explant alıcı embriyo ücretsiz (şekil 3A ve B) bir yatay (bitkisel yüzeye paralel) yaparak derin bitkisel bölgesinde cut(s). Not: PGC içeren bitkisel explant yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine boyutudur. Bu bitkisel explant alıcı embriyo artık gerekli değildir ve bu nedenle bir kenara atılmak üzere ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde çalışma, bu yordamı (Adım 2,4-2,6) PGC donör embriyo nakli için benzer şekilde ölçekli bitkisel doku parçası oluşturmak için yineleyin. Not: Bu ikinci diseksiyon onun açık yara iyileşmesi alıcı embriyo süresini en aza indirmek için küçük gecikme ile gerçekleştirmek önemlidir.</li>
	<li>Bir kez PGCs içeren doku donör embriyo kaldırılır, kaş saç bıçak ve saç döngü içine alıcı embriyo oluşturulan açılması bulunduğu bu explant taşımak için kullanın. Not: Alıcı embriyo iç donör greft iç yüzeyine karşı karşıya gerekir. Alıcı embriyo ile greft ventral dorsal ve sol-sağ eksen yönelimleri eşleştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>Greft yüzeyine paralel düzenlenen kaş saç bıçak mili uzun kenarını hafifçe bastırın greft içine alıcı embriyo bitkisel yüzeyine açılış için kullanın.</li>
	<li>Greft yerleştirildi, bir hairloop veya bir kaş saç bıçak mili donör embriyo "karkas" özel yüzey üzerinde ve bir özel depresyon içine yavaşça kaydırın kılabilmesi için. Karkas açık yara toplu sıvı dönük olduğundan emin olun. Eğer değilse, bu yönlendirme ulaşmak için embriyo döndürmek için kaş saç bıçak kullanın.</li>
	<li>Yerde, bitişik bir depresyon içine şifa greft ile alıcı embriyo slayt ve aynı şekilde aşılı bitkisel pole doku toplu sıvı dönük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Başka bir organ nakli/karkas çifti oluşturmak için başka bir çifti donör ve alıcı embriyo kullanarak bu yordamı (adımları 2.1-2.11) yineleyin; bunları boş çöküntü aktarın. Not: Bir karkas ve nakli taşıyan embriyolar uyumlu çiftleri izlemek için gösterimler yapar önemlidir. Donör leşleri Cas9 sgRNA bağlı mutagenesis nakli taşıyan hayvanlar cinsel olgunluğa ulaşana kadar hangi kolayca denetlesinler cant transplante PGCs içinde verimlilik için bir proxy olarak kullanılan (bkz. Adım 3.3, aşağıda ve tartışma ).</li>
	<li>Embriyo yaklaşık 6,5 yaklaşık erken gastrula etap 10, ulaşana kadar nakli yapmaya devam X. tropicalis yılında hpf (bkz. şekil 2E).</li>
</ol>3. embriyo bakım sonrası iyileşme
Not: ~ 30 dakika içinde yerine Greftler iyileşmek ve hücre lizis embriyo (şekil 3 c) yayan yolky bazı enkazı gözlemlemek için normaldir.
<ol><li>
Sonra iyileşti, Pasteur pipet çok yavaşça transfer embriyoların çöküntü bir özel kaplamalı 24-şey plaka bireysel wells için kullanabilirsiniz. Çıktı olacak (şekil 3D) aktarım sırasında karıştırma sıvı tarafından kaldırıldı.
	<ol>
<li>Bunlar bitkisel kadar toplu çözüm karşı karşıya kutup yerleştirilir embriyo döndürür. Yine, donör leşleri yerleştirin ve embriyo çiftleri takip içinde yardımcı olmak için alıcılar bitişik Wells grefti; Bu bilgileri kaydeder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede kültür için 25 ° C kuluçka için embriyo içeren 24-şey plaka aktarın. Not: Ertesi gün, embriyo tailbud aşamaları ulaşmış.</li>
	<li>Özel kaplamalı 6-şey plakaları viomisin sülfat/ml, iyi başına 1 embriyo ile 50 µg ile MMR takıma 1/9 x içeren temizlemek için greft alıcılar taşıyın. Bunlar maç donör leşleri açık bir kaydını tutmak grefti alıcılar.</li>
	<li>Mutagenesis verimliliği sıralama PCR amplicons5,17,24 ya da PCR amplicons ( tartışmabakın) kullanan diğer yöntemleri kullanarak değerlendirmek için 0.2 mL PCR şerit tüpler için bireysel leşleri taşıyın. Orta çoğunu kaldırın ve alçalarak P200 pipet kullanarak pipetting K (PK) tarafından tekrarlanan İndinavir içeren 100 µL lizis arabellek24 ' te lunaparkçı.</li>
	<li>Embriyo lizis24 PK sindirim izin vermek için bir gecede 6 h için 56 ° C'de gerçekleştirin. Bu 90-95 ° C-10 dk hızlı 4 ° C'ye soğutma tarafından takip için Isıtma tarafından PK devre dışı bırakma Lysates daha fazla temizleme adımları olmadan doğrudan Sanger DNA sıralama24için kısa amplicons elde etmek için PCR reaksiyonları tohum için kullanın. Lysates-20 ° C'de depolayın Not: Birkaç gün içinde Kurbağa yavrularını besleme aşamaları (yaklaşık sahne 45-46) ulaşacak ve bir süspansiyon planktonik tozu (sera Micron)-ebilmek var olmak fed.</li>
	<li>Temizlik korumak ve mikrobiyal büyüme, en aza indirmek için kültür ortamının günlük değişimleri ile ~ 1 hafta sonra damla akış ile dolaşan bir su sisteminde küçük tanklar için Kurbağa yavrularını taşımak. Sıralama veri iribaşlar Kurbağa yavrularını üzerinden son derece verimli bir şekilde mutagenized PGCs ile alt mutagenesis verimlilik ile ayırmak için kullanın. Metamorfoz tamamlandıktan sonra froglets laboratuar yetişkin su sisteminde taşıyın. Not: Ulusal Xenopus kaynak (deniz Biyoloji Laboratuvarı, Woods Hole, MA) tarafından geliştirilen rejimleri29 ve yetişkin kurbağa bakım30besleme kurbağa yavrusu için bir kılavuz sağlar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu rapor, nakli PGCs PGCs. içeren bitkisel doku nakli için detaylı bir protokol genom düzenleme teknolojileri (Örneğin, CRISPR/Cas9) ile birlikte germline değiştirmek için kullanılır bir hayvan sağlar Neredeyse tüm onun somatik dokuların genetik olarak vahşi türü olarak sürdürmek. Leapfrogging için başarılı olmak için bir dizi performans gösteren nakillerine gerçekleştirmeden önce dikkat edilmesi gereken kritik faktör vardır.
Germline tam yedek mutant gen...

Nasıl kodladığını genotip fenotip yeniden keşfi beri Biyoloji Mendel'ın yasaları büyük bir soru olmuştur. Genler, onların yönetmelik ve etkileşimleri gen ağları içerisinde rolleri ve işlevleri açığa çıkarmak yeni Biyoloji ve hastalık durumlarında ameliorating araçları sağlamak için kodlanmış ürünleri vaatlerin bir anlayış. Yarım yüzyıl1için, Afrika pençeli kurbağası Xenopus, temel Biyoloji ve Biyomedikal geliştirme genetik kontrolü de dahil olmak üzere, çok çeşitli konular üzerinde çalışmalar için önde gelen bir model olmuştur. Tarihsel olarak, çoğu araştırma Xenopus allotetraploid kurbağa, X. laevis, kullandı ama son zamanlarda, onun diploidy nedeniyle X. tropicalis bir amfibi genetik model olarak geliştirilmiştir. Komple genom dizileri hem Xenopus türler2,3monte edilmiştir. "Kurbağa" Şimdi bir dönüm noktasında nerede temel genom değişiklik teknoloji eğitim gen işlevinin hemen hemen at will ruhsatı topluluktur. Programlanabilir CRISPR/Cas9 endonucleases gen mutagenesis yüksek verimli, biallelic mutasyon mümkün çoğu hücrelerde hayvan4,5,6,7ile yapmış, 8,9,10,11. Bu çalışmalar, Bhattacharya vd tarafından vurguladı 12 ve Shigeta vd. 13, birçok genlerin fonksiyonun F0 mozaik hayvanlarda mutagenesis tarafından okudu olabilir göstermiştir. Bu yaklaşım pek çok avantajı vardır; Ancak, Cas9-sgRNA-microinjected embriyo çoğunlukla nedeniyle eksik işlev (LOF) kaybı değişken fenotipleri görüntüler. Daha da önemlisi, mutant satırları bazı uygulamalar için son derece avantajlı olduğunu — bir anne mRNA katkı var genler okurken özellikle. Anne mRNA'ların ve proteinler ve onların etkileri epigenetik üzerinde uzun bir süre için erken gelişimsel katkıları pek çok gen işleme embriyogenez14,15,16, kalıcı Refrakter F0 analiz için. Bu nedenle, diğer LOF yaklaşımlar gereklidir.
Mutant satırları oluşturmak Aradığınız zaman, çeşitli engeller homozigoz LOF embriyo elde etmek için yolu vardır. Çünkü cinsel olgunluk, uygun bir çizgi üretimi ile müdahale için hayatta yetersizliğinde temel gen işlev sonuçlar biallelic mutasyonları üretmek için ilk, verimli mutagenesis dezavantajlı olabilir. Cas9-sgRNA teslim miktarı dikkatli titrasyon ortak bir çözümdür. Amaç da germline mutagenesis verimliliği en üst düzeye ölümcül azaltmak arasında bir denge elde etmek için burada. İkinci bir sorun nerede fenotipik analizleri F2 nesil kadar ertelenmiş standart üreme düzeninden doğar. Standart yaklaşım kullanarak, mutant gen germline aracılığıyla "hangi sonra cinsel olgunluğa yetiştirilmektedir F1 heterozigoz taşıyıcılar", üretmek için outcrossed iletimi F0 hayvanlar cinsel olgun. İki F1 heterozygotes sonra F2 mutant embriyo % 25 bir beklenen Mendel frekansta üretmek için intercrossed. Böylece, iki kuşak ıslahının mutant fenotipleri analizi için gereklidir. Mutant hayvanlar ya homozygotes ya da bileşik heterozygotes (F1 intercross içinde kullanılan ebeveyn hayvanların genotip bağlıdır içeren iki farklı mutant gen,Yani, döl) olabilir.
Hangi leapfrogging17adlı yeni bir yöntemi altında yatan programlanabilir nükleaz aracılı mutagenesis germ hücreleri, hapsetmesi tarafından bu engellerin üstesinden gelebilir. Leapfrogging iki ana bileşeni vardır: (1 mikroenjeksiyon Cas mRNA ile birlikte sgRNA veya nükleaz-sgRNA kompleksleri (veya, ilke, TALENs veya çinko parmak enzimler) embriyonik genom verimli bir şekilde mutagenize için tek hücreli aşamada takip (2) tarafından PGCs nakli içine wildtype kardeş embriyolar, nerede endojen PGCs çıkarıldı. Her iki adım mutant germ hücreleri ile verimli, tam germline replasmanı olduğunda elde edilebilir. Blackler 1960'ların başında Xenopus PGCs geç neurula, embriyo ve erken tailbud aşamaları18,19arasında nakledilen gösterdi. Leapfrogging için Blackler'ın yaklaşımı PGCs embriyo20,21bitkisel kutbunda yerelleştirilmiş zaman blastula aşamasında17, nakillerine gerçekleştirerek güncellenmiştir. Nakli gastrulasyon önce iki ana avantajı vardır. İlk olarak, nakli ve sonraki normal gelişim engraftment ekimi blastula aşamasında (yayınlanmamış gözlemler) gerçekleştirildiğinde daha verimli olmasını bulundu. İkinci olarak, kısa bir süre zygotic transkripsiyon başladıktan sonra blastula aşamasında nakillerine gerçekleştirerek, bir gelişimsel gen gastrulasyon veya bu bozabilir mutasyonlar, aksi halde hatalı biçimlendirilmiş geç neurulae için yol kaynaklanan ölümcül önleyebilirsiniz. PGC nakli taşıyan embriyolar ("başkanıkendini") için cinsel olgunluğa yetiştirilen ve intercrosses bu F0 hayvanlar arasında birçok durumda, F1 döl % 100'ünü (çoğu bileşik varlık LOF fenotip görüntülemesini göstermiştir heterozygotes), tam germline değiştirme ile hedeflenen mutasyonlar gösteren.
Bu leapfrogging Xenopusgenetik yaklaşımlar hızlanır bekleniyor. Anne etkisi genler (yayınlanmamış gözlemler) LOF analizi için alternatif "transfer ev sahipliği" yöntemi22 sağlar Ayrıca leapfrogging. Geçerli yayında özellikle PGC nakli üzerinde odaklama yöntemi, ayrıntılı bir açıklama X. tropicalis içinde ( X. laevisiçin küçük değişiklikler) sunulur. PGCs nakli burada Xenopusile çalışan diğer laboratuvarlar bu teknolojinin daha hızlı bir transfer kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Bu yöntemin ilkeleri diğer kurbağalar (Örneğin, urodeles) başarılı olmalı ve metodoloji olarak organizma özel değişiklikleri uygulama verimli mutagenesis gerçekleştirilebilir birçok hayvan için izin vermelidir ve PGCs kolayca transplantable.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

Genom düzenleme mutant satırların yaratılması çoğu canlıda genetik analiz hızlanıyor. CRISPR/Cas9 yöntemleri Afrika pençeli kurbağası, Xenopus, uzun süredir devam eden model organizma biyomedikal araştırmalar için kullanmak için adapte edilmiştir. Homozigoz mutant hatları ile mutagenesis CRISPR/Cas9-hedef oluşturmak için geleneksel ıslah düzenleri çeşitli zaman alan ve zahmetli adımlar var. Özellikle embriyo için gerekli olan genlerin dışarı vurma ile ilişkili engelleri aşmak için mutant embriyo oluşturulması kolaylaştırmak için leapfrogging adlı yeni bir yöntem geliştirildi. Bu teknik Xenopus embriyo "kes ve Yapıştır" sağlamlık güçlendirir embriyoda yöntemleri. Leapfrogging primordial germ hücreleri (PGCs) transferini PGC-ablated wildtype kardeşler verimli bir şekilde mutagenized donör embriyo kullanır. Bu yöntem için temel gen mutasyon verimli chimeric hayvanları içeren bir mutant germline taşıyan wildtype somatik hücreler oluşturarak sağlar. Ne zaman iki F0 hayvan taşıyan "birdirbir nakli" (Yani, mutant germ hücreleri) intercrossed, böylece fenotipik verileri elde etmek için tam üretimi zamandan tasarruf homozigoz veya bileşik heterozigoz, null F1 embriyolar, ürettikleri. Leapfrogging de yeni bir yaklaşım CRISPR/Cas9 mutagenesis takip F0 fenotipik analiz için ateşe dayanıklı anne etkisi genler analiz etmek için sağlar. Bu el yazması PGC nakli başarıyla gerçekleştirmek nasıl üzerinde durularak leapfrogging yöntemi ayrıntıları.

Ekimi, nitel CRISPR/Cas9 mutagenesis etkinliğinin belirlenmesi hayvancılık büyümek ve cinsel olgunluğa hayvanları korumak için çaba sokmaksızın önce gerçekleştirilmelidir. Birdirbir nakli taşıyan hayvan somatically wildtype ve germline doğrudan ölçülerini erişmek zordur çünkü donör embriyo mürekkep tasarrufu önemli hale gelir. Mürekkep DNA analizinden transplante germline17' oluşur mutagenesis kapsam için bir vekil olarak hizmet vermek...

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

Video: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genetik

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biyoloji

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Manipülasyon ve

Kök hücre benzeri

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama