Başlamak için, Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini 10 milimolar yığın tamponu ile destekleyerek yıkama tamponunu hazırlayın. Tamponu kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. DMEM'de retina pigment epiteli veya RPE ortamını hazırlayın ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.
Ötenazi uygulanmış fareyi, göz yukarı bakacak şekilde yan yatırın. İşaret parmağını gözün üzerine ve başparmağınızı altına yerleştirin. Göz küresinin dışarı çıkmasını sağlamak için göz çevresindeki kemik yapısına hafif bir baskı uygulayın.
Hafif açık makasın ucunu gözün altına sokun ve göz yuvasından ayrılana kadar bileği nazikçe gözden 90 derece uzağa döndürün. Hemen gözü yerleştirin ve beş saniye boyunca% 70 etanol içinde yuvarlayın. Daha sonra gözü buz üzerinde tutulan bir yıkama tamponuna aktarın.
Diseksiyon mikroskobu altında, gözü yıkama tamponu ve ıslatılmış gazlı bez şeritleri ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Optik siniri cımbızla tutarak ve cerrahi bir bıçak kullanarak Ora Serrata seviyesinde nazikçe bir kesi yaparak gözü stabilize edin. Vannas Makasını kesiye yerleştirin ve ön segment ve vitreus çıkarılana kadar Ora Serrata'nın çevresini kesin.
RPE tabakasını bozmadan, gergin forseps kullanarak retinayı göz kabından nazikçe soyun. Makas yardımıyla, göz kapağını delmeden göz kabından optik siniri ve fazla bağ dokusunu çıkarın. Göz kabını bir mililitre %0.25 tripsin ve %0.02 EDTA içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
göz kabını 37 santigrat derece su banyosunda 10 dakika inkübe edin. Her iki dakikada bir tüpü çıkarın ve alt kısmı tezgahın üzerine 40 kez sıkıca vurun. İnkübasyondan sonra, AP-1000 pipetini kullanarak göz kabını bozmak için üç kez hafifçe yukarı ve aşağı karıştırın.
Tripsini nötralize etmek için, göz kabı hariç olmak üzere, ayrılmış RPE tabakalarını hemen 15 mililitrelik konik bir tüpte 0,5 mililitre FBS üzerine yerleştirin. Ardından, tripsini seyreltmek için RPE ortamını FBS ve RPE tabakalarının katmanlarına ekleyin. RPE'yi 340G'de üç dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve hücreleri 24 oyuklu bir plaka için uygun miktarda RPE ortamında yeniden süspanse edin. RPE'yi üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. RPE izolasyonundan 24 saat sonra, bir çekirdek pigmentli hücreler tam yapışma olmadan çökelmeye başlar.
48 ila 72 saat boyunca, bu hücreler bağlanır ve yayılır, şeffaf bir çekirdekte koyu pigmentasyonu korur. Beş gün sonra, RPE hücreleri, altıgen yapılara sahip polarize bir tek tabakaya dönüşen hücreden hücreye temaslar oluşturmaya başlamada artan akıcılık gösterir. İzole RPE, kültürde altı gün sonra RPE'ye özgü belirteç ve sıkı bağlantı bütünlüğü ile kanıtlandığı gibi saflık gösterdi.
