Bu yayında bildirilen araştırmalar NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) ve P30 EY011373 tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayan kuruluşun bu araştırmanın tasarımında veya yürütülmesinde hiçbir rolü yoktu.

Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı, Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), kalsiyum içermez, magnezyum içermez, fenol kırmızısı içermez 10 mM HEPES tampon çözeltisi ile takviye ederek yıkama tamponu ortamı hazırlayın. Kullanana kadar çözeltiyi 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu 4.5 g/L glikoz, 1.25x GlutaMAX Takviyesi (stok konsantrasyonu 100x veya 200 mM; nihai konsantrasyon 2.5 mM L-glutamin), %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin ve 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) ile destekleyerek RPE ortamını hazırlayın. Kullanmadan önce, ortamı bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.</li>
</ol>2. Fare gözü çıkarma
<ol><li>IACUC onaylı bir ötenazi yöntemi kullanarak, tercihen 3 ila 14 haftalık yaşları arasında değişen fareyi ötenazi yapın (20 g fare başına 0.1 mL'de bir Ketamin / ksilazin kokteyli kullanılarak anestezi altında servikal çıkık [87.5 mg / kg Ketamin ve 12.5 mg / kg Ksilazin] bu çalışmada kullanılan yöntemdi). NOT: Genç farelerden toplanan gözler, zamanla artan retina pigmenti epitel hücresi verimini kolaylaştıracak ve ardışık geçişler için kapasiteyi artıracaktır.</li>
	<li>Fareyi, göz yukarı bakacak şekilde yan yatırın.</li>
	<li>İşaret parmağını ve başparmağını sırasıyla gözün üstüne ve altına yerleştirin. Göz küresinin dışarı çıkmasını sağlamak için gözü çevreleyen kemik yapısına hafifçe baskı uygulayın.</li>
	<li>Hafifçe açılmış makasın ucunu gözün altına sokun ve göz yuvasından ayrılana kadar bileği gözden 90° uzağa nazikçe döndürün. NOT: Gözü veya optik siniri kesmek için makası kapatmayın, çünkü bu, vizör lastiğinin diseksiyonunu daha zor hale getirecektir.</li>
	<li>Buz üzerinde tutulan bir yıkama tamponu ortamına aktarmadan önce gözü hemen %70 etanole yerleştirin ve en fazla 5 saniye boyunca yuvarlayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, her seferinde bir gözü yıkama tamponu ve ıslatılmış gazlı bez şeritleri ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Optik siniri cımbızla tutarak gözü stabilize edin. 3.00 mm 45° cerrahi bıçak veya 0.009" tıraş bıçağı kullanarak ora serrata seviyesinde nazikçe bir kesi yapın.</li>
	<li>Vannas makası kullanarak, makası nazikçe kesiğe sokun ve ön segment ve vitreus çıkarılıp atılana kadar ora serrata'nın çevresini kesin.</li>
	<li>RPE tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek, gergin forseps kullanarak retinayı vizör lastiğinden nazikçe soyun. NOT: Retinanın çıkarılmasını kolaylaştırmak için, bir transfer pipetini yıkama tamponu ortamıyla doldurun ve retinayı nazikçe kaldırmak için vizör lastiğinin kenarlarına dikkatlice uygulayın.</li>
	<li>Son olarak, makas kullanarak optik siniri ve fazla bağ dokusunu vizör lastiğinden çıkarın. Vizör lastiğini delmemeye dikkat edin.</li>
</ol>3. Birincil RPE'nin izolasyonu
<ol><li>Vizör lastiğini 1 mL %0.25 tripsin + %0.02 EDTA içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Kültürlenebilir RPE'nin verimini artırmak için bir Tripsin-EDTA alikotuna iki vizör lastiği eklenebilir.</li>
	<li>Mikrosantrifüj tüplerini 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Her 2 dakikada bir, tüpleri su banyosundan çıkarın ve tüpün altını tezgahın üzerine 40 kez sıkıca vurun.</li>
	<li>10 dakika sonra, bir P1000 veya 2 mL serolojik pipet kullanarak en fazla 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek vizör lastiğini mekanik olarak nazikçe bozun. NOT: Büyük sayfalar düzgün şekilde yapışmayacağı için RPE sayfalarının parçalanması çok önemlidir.</li>
	<li>Ayrılmış RPE tabakalarını, ancak vizör lastiğini değil, 15 mL'lik konik bir tüpte 0.5 mL fetal sığır serumu (FBS) üzerine katmanlayarak tripsini hemen nötralize edin.</li>
	<li>Ayrıca, 3 mL RPE ortamını FBS ve RPE tabakalarının katmanları üzerine damla damla katmanlayarak tripsini seyreltin.</li>
	<li>RPE'yi 340 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücreleri 24 oyuklu bir plaka (1.9 cm2 / oyuk) veya 48 oyuklu bir plaka (0.75 cm2 / oyuk) için uygun miktarda RPE ortamında yeniden süspanse edin. NOT: RPE, yapışmayı artırmak için hücre dışı matris proteinleri, özellikle laminin, kollajen IV veya fibronektin ile kaplanmış kuyucuk plakaları üzerine kaplanabilir11. RPE ayrıca 1 mL RPE ortamında yeniden süspanse edilebilir ve saf RPE hücrelerini daha fazla izole etmek için %40'lık bir yoğunluk ayırma gradyanı üzerine katmanlanabilir. Ek olarak, plakayı 3-5 dakika boyunca 340 x g'da döndürmek hücre yapışmasınıartırabilir 13.</li>
	<li>37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
</ol>4. RPE'nin Kültürlenmesi
<ol><li>İzole RPE'yi en az 3 gün boyunca bozmayın. 72 saat sonra, eski ortamı yavaşça çıkarın ve yeni, önceden ısıtılmış ortamla değiştirin.</li>
	<li>İlk 3 günden sonra her 48 saatte bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>Hücreler birleştiğinde,% 0.25 tripsin +% 0.02 EDTA kullanarak hücreleri geçirin ve% 2'ye düşürün NOT: Primer RPE'nin daha önce 5-7 geçişten sonra farklılaşmaya başladığı ve altıgen şeklini ve pigmentasyonunu kaybetmeye başlayacağıbildirilmiştir 14.</li>
</ol>

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).</li><li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration.">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+genes+and+disease+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li><li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li><li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium.">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li><li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells.">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li><li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina.">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li><li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li><li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs.">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li><li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+to+study+retinal+diseases.">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449 (2015).</li><li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1/ALK5+inhibitor.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li><li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts.">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758 (2022).</li><li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier.">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211 (2019).</li><li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18 (1997).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870 (2021).</li></ol>

İlgili finansal veya finansal olmayan açıklama yoktur.

Bu yazıda, murin retinal pigment epitelinin izolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş bir protokol özetledik. Yetişkin farelerin gözlerinden izole edilen RPE hücreleri, RPE'ye özgü bir belirteç olan RPE65 ve hücreler arası bir bağlantı belirteci olan ZO-1'i eksprese etti. Ek olarak, kültürlenmiş hücreler kültürde pigmentli, altıgen tabakalar halinde gelişti.
Kemirgenlerde RPE'nin izolasyonu için çeşitli yöntemler daha önce yayınlanmıştır</...

Retina pigment epiteli (RPE), fotoreseptörler ve koroid1 arasında bulunan Bruch zarını kaplayan özel bir hücre tek tabakasıdır. RPE hücreleri, retinanın düzgün çalışmasında kritik bir rol oynar. RPE hücreleri, glikoz ve A vitaminini fotoreseptörlere taşır, all-trans retinalin 11-cis retinal içine yeniden izomerizasyonu ile görüşü teşvik eder ve dökülen dış segmentlerin fagositozu yoluyla fotoreseptörün dış segmentlerini korur, subretinal boşluktan suyu uzaklaştırır, sıkı bağlantıların varlığı yoluyla dış kan-retina bariyerini oluşturur ve nörotropik büyüme faktörleri salgılar (Pigment Epitel Türetilmiş Faktör gibi, ve Temel Fibroblast Büyüme Faktörü) fotoreseptörleri destekleyen2. RPE hücrelerinin disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli retinopatilerin patogenezinde rol oynar 3,4,5. RPE hücrelerini kullanan in vitro çalışmalar, bu hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamız için kritik öneme sahiptir. Primer RPE hücreleri bu çalışmalar için daha çok tercih edilir, çünkü RPE hücre hatları hazır bulunmakla birlikte, primer RPE hücrelerinin temel özelliklerinden yoksundur.
Primer RPE hücrelerinin kaynağı olarak çeşitli türler kullanılırken, fareler retinopatilerin patogenezini anlamaya yardımcı olmak için genetik modifikasyonları kullanma avantajına sahiptir. RPE hücrelerini kemirgenlerden izole etmek için daha önce tarif edilen protokoller ya yenidoğan hayvanların kullanılmasını gerektirir, uzundur, teknik beceri gerektirir ya da kültür 6,7,8,9,10,11,12 için uygun değildir. RPE hücrelerini, bu hücrelerin oldukça saf kültürlerini veren yetişkin farelerden izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.009 RD Single-Edge Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>941202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>no Calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Unitome Knife</td>
			<td>BVI Beaver</td>
			<td>377546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Microplates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td>24-well or 48-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult mice

Retina pigment epitel hücreleri (RPE), retinanın düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi önemli retina hastalıklarının patogenezinde rol oynar. RPE'nin murin yetişkin gözlerinden izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunuyoruz. Daha önce bildirilen yöntemlerin aksine, bu yaklaşım yetişkin farelerden yüksek saflıkta RPE'nin izolasyonunu ve kültürünü mümkün kılar. Bu basit ve hızlı yöntem, kapsamlı teknik beceri gerektirmez ve temel bilimsel araçlar ve reaktiflerle elde edilebilir. Primer RPE, 3 ila 14 haftalık C57BL/6 arka plan farelerinden gözün enükleasyonu ve ardından ön segmentin çıkarılması ile izole edilir. Enzimatik tripsinizasyon ve santrifüjleme, RPE'yi vizör lastiğinden ayırmak ve izole etmek için kullanılır. Sonuç olarak, bu yaklaşım, retina fonksiyonu ve hastalığı çalışmasında RPE'nin kullanımı için hızlı ve etkili bir protokol sunmaktadır.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized cell monolayer lining the Bruch&#39;s membrane located between photoreceptors and the choroid1. RPE cells play a critical role in the proper function of the retina. RPE cells transport glucose and vitamin A to photoreceptors, promote vision by re-isomerization of all-trans retinal into 11-cis retinal and maintain outer segments of photoreceptor through phagocytosis of shed outer segments, remove water from the subretinal space, form the outer blood-retinal barrier through the presence of tight junctions and secrete neurotropic growth factors (such as Pigment Epithelium Derived Factor, and Basic Fibroblast Growth Factor) that support photoreceptors2. Dysfunction of RPE cells is involved in the pathogenesis of various retinopathies, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy3,4,5. In vitro studies using RPE cells are critical to improving our understanding of the pathogenesis of these diseases. Primary RPE cells are much preferred for these studies since RPE cell lines, while readily available, lack key characteristics of primary RPE cells.
Whereas various species have been utilized as sources of primary RPE cells, mice have the advantage of using genetic modifications to help understand the pathogenesis of retinopathies. Previously described protocols to isolate RPE cells from rodents either require the use of neonatal animals, are lengthy, require technical skill, or are not suitable for culture6,7,8,9,10,11,12. We describe a simple and fast method to isolate RPE cells from adult mice that yield highly pure cultures of these cells.

Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells or RPE are located between photoreceptors and the choroid. Dysfunction of RPE is important in the pathogenesis of diseases, such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and retinitis pigmentosa. The use of primary RPE is key to studies to improve the understanding of how disease is developed.While various species have been used as a source of primary RPE, mice have the advantage of allowing to use genetic manipulation to help understand how retinopathies develop. Prior methods of isolation of primary RPE from rodents require either the use of neonatal animals, are lengthy, require technical expertise, or are not suitable for cell culture. We describe a simple and fast method to isolate primary RPE from adult mice that yields highly pure cultures of the cells.

Açıklanan protokol C57BL/6 arka plan farelerinde kullanılmıştır. Cinsiyet, RPE'yi kültürleme yeteneğini değiştirmiyor gibi görünmektedir. 6 haftadan küçük fareler, yaşlı farelere kıyasla sınırlı RPE tabakaları verir ve optimal birleşmeye ulaşmak için daha fazla göze ihtiyaç duyulabilir. İzolasyonu takiben, RPE hücrelerinin stabilize olması ve hücre kültürü plakasına bağlanması yaklaşık 3 gün sürer. İzolasyondan yaklaşık 24 saat sonra, anükleat gibi görünen yuvarlak, pigment...

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

a-simplified-method-for-isolation-culture-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

645 Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Retina pigment epitel hücreleri veya RPE, fotoreseptörler ve koroid arasında bulunur. RPE'nin disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve retinitis pigmentosa gibi hastalıkların patogenezinde önemlidir. Primer RPE'nin kullanımı, hastalığın nasıl geliştiğinin anlaşılmasını geliştirmeye yönelik çalışmaların anahtarıdır.Primer RPE kaynağı olarak çeşitli türler kullanılmış olsa da, fareler re...

Video: Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Nörobilim

Extraction and Cultivation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice Eyes

To begin, prepare the wash buffer by supplementing Hank's Balanced Salt Solution with 10 millimolar heaps buffer. Store the buffer at four degrees Celsius until use. Prepare retinal pigment epithelium or RPE medium in DMEM and prewarm to 37 degrees Celsius in a water bath.Lay the euthanized mouse flat on its side with the eye facing upwards. Place the index finger above the eye and the thumb below it. Apply gentle pressure on the bone structure around the eye to cause the eyeball to protrude.Insert the tip of slightly open scissors under the eye and gently rotate the wrist away from the eye 90 degrees until the eye detaches from the socket. Immediately place and roll the eye in 70%ethanol for five seconds. Then transfer the eye to a wash buffer kept on ice.Under a dissecting microscope, place the eye in a Petri dish filled with wash buffer and strips of soaked gauze. Stabilize the eye by holding the optic nerve with tweezers and using a surgical knife gently make an incision at the level of the Ora Serrata. Insert Vannas Scissors into the incision and cut around the circumference of the Ora Serrata until the anterior segment and vitreous are removed.Gently peel away the retina from the eye cup using tethered forceps without disturbing the RPE layer. With the help of scissors, remove the optic nerve and excess connective tissue from the eye cup without puncturing the eye cup. Transfer the eye cup to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube containing one milliliter of 0.25%trypsin and 0.02%EDTA.incubate the eye cup in a 37 degrees Celsius water bath for 10 minutes. Every two minutes, remove the tube and firmly tap the bottom 40 times onto the countertop. After incubation, using AP-1000 pipette gently mix up and down three times to disrupt the eye cup.To neutralize the trypsin, immediately layer the detached RPE sheets, excluding the eye cup onto 0.5 milliliters of FBS in a 15 milliliter conical tube. Then dropwise, add RPE media onto the layers of FBS and RPE sheets to dilute the trypsin. Centrifuge the RPE at 340G for three minutes.Discard the supernatant and resuspend the cells in a suitable amount of RPE media for a 24 well plate. Incubate the RPE at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three days. 24 hours after RPE isolation, a nucleate pigmented cells begin to settle without full adherence.Over the 48 to 72 hours, these cells attach and spread, retaining dark pigmentation in a transparent nucleus. After five days, RPE cells show increased co fluency in start forming cell to cell contacts shaping into a polarized monolayer with hexagonal structures. Isolated RPE showed purity as evidenced by the RPE specific marker and tight junction integrity after six days in culture.