Başlamak için, FN ipek şişelerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve nakliye için kuru buza koyun. Şişeleri biyolojik bir güvenlik kabinine getirin ve bir mikro santrifüj tüp rafına yerleştirin. Çözüldükten sonra, 48 oyuklu bir plakanın her ikinci kuyucuğuna 550 mikrolitre ipek çözeltisi pipetleyin.
Kapağı tabağa yerleştirin ve steril bir kutuya yerleştirin. Kutuyu biyolojik güvenlik kabininden dikkatlice aktarın ve gece boyunca ortam koşullarında bırakın. Ertesi gün, FN-ipek membranlar ve steril ekler içeren plakayı içeren kutuyu biyolojik güvenlik kabinine getirin.
Plakayı kutudan dikkatlice kaldırın, plakanın kapağını açın ve kuyucuklardaki bulanıklığı gözlemleyerek zar oluşumunu görsel olarak doğrulayın. Steril cımbız kullanarak, bir parça alın ve tutamaklar kuyunun tepesine değene kadar zarın üzerine doğru yönlendirin. Tüm ekler indirildikten sonra, kapağı plakanın üzerine yerleştirin ve plakayı steril kutuya geri koyun.
Membranların iki saat boyunca eklere yapışmasına izin verin. Ardından, plakayı kutudan çıkarın ve kapağı açın. Steril cımbız kullanarak, eki kuyudan çıkarın.
Ek parçayı bazal tohumlama için 100 mikrolitre DMEM/F12 veya apikal tohumlama için 200 mikrolitre ile doldurun. Ek parçayı 24 oyuklu bir plakanın boş bir kuyusuna aktarın ve kuyuyu bir mililitre DMEM/F12 ile doldurun. İstenilen sayıda insan keratinositini topladıktan sonra, bir P200 pipeti kullanarak, 20 ila 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu aspire edin.
Pipet ucunu zarın ortasına doğru tutun ve pipet pistonuna yavaşça bastırarak damlacığı ekin içindeki kültür ortamıyla temas ettirin. Tüm zarlar aktarıldıktan sonra, hücreleri zarlar boyunca eşit olarak dağıtmak için plakayı sekiz şeklinde hareket ettirin. Kültürü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Cımbız kullanarak, ekleri 24 oyuklu plakadan kaldırın ve kültür ortamını kuyucuklarda bırakın. Ardından, ek parçayı bazal tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Ters çevrilmiş eki Petri kabına yerleştirin.
Bir P200 pipeti ile yeniden süspanse edilmiş insan keratinosit hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini aspire edin. Pipet ucunu zarın ortasına doğru tutun ve zarın üzerine düşen bir damlacık oluşturmak için pipet pistonuna yavaşça bastırın. Kapağı Petri kabının üzerine yerleştirin.
Petri kabını ve orta içeren 24 oyuklu plakayı 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın. İnkübasyondan sonra, 24 oyuklu plakayı ve Petri kabını biyolojik güvenlik kabinine getirin. Cımbız kullanarak, bir uç seçin ve zarın apikal tarafı yukarı ve bazal tarafı aşağı bakacak şekilde ters çevirin.
Bir P200 pipeti kullanarak, ekin içine 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Ek parçayı 24 oyuklu plakanın önceden doldurulmuş bir kuyusuna geri yerleştirin. Ekleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.
FN-ipek zar üzerinde kültürlenen keratinositler yüzeyi eşit şekilde kapladı ve ilk gün parke taşı morfolojisi gösterdi. Keratinositler, üçüncü günde epitel fonksiyonunu gösteren birleşik bir tabaka oluşturdular ve fizyolojik epitel fonksiyonlarını üstlendiklerini gösteren sıkı bağlantılardan oluşan bir ağ oluşturdular. Üç gün sonra FN-ipek zarları boyunca yüksek hücre canlılığı gözlendi ve merkez ile çevre arasında canlılık açısından önemli bir fark olmadı.
FN-ipek membran sistemi, ticari PET membran sistemlerine benzer veya daha iyi keratinosit canlılığını destekledi.
