Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık (NIH) hibe R01DK069403 ve P30DK079307 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

Aşağıdaki protokol kısmı (Hentschel ve ark 2005) ve (Weinstein ve ark 1995) hafif değişiklikler rapor yayınlandı yöntemleri dayanmaktadır. Bölüm 1: Microinjections Mikroenjeksiyon için önceden ayarlayın <ul><li> Balık, 2 gün sonrası fertilizasyon (DPF) enjekte edilir. Bu nedenle, yetişkin zebrafish planlı bir deney önce 3 gece yetiştirilmektedir. Embriyolar toplayın ve 28.5 E3 su (5mM NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM CaCl 2 0.33mM MgSO 4) ile bir Petri kabındaki ° C Petri kabı başına 80-100 embriyolar vardır, böylece, ilk günün sonunda Petri kabı ve ayrı embriyolar ölü embriyolar kaldırmak. </li><li> Bir elektrot çektirmesi ile kılcal tüpler (4 inç uzunluğunda, 0,63 / 0,20 OD / ID milimetre (mm) R-6 Özel Cam Boru Drummond bilimsel şirketi, Broomall, PA 9-000-3000) çekerek cam iğneler hazırlayın. Ucu çapı 10-20 mikron olmalıdır. Diseksiyon mikroskobu altında (Leica S6E), kalıcı bir kalem, bir cetvel yardımı ile iğne boyunca yaklaşık 10 1mm çizgiler çizmek ve kil rampaları büyük bir Petri kabındaki iğneler saklamak. </li><li> Iç çapı kadar bir Bunsen beki alev ince duvarlı borosilikat cam kapiller tüp (152 mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100-6, Dünya Precision Instruments, Inc.) Yangın lehçe ipucu: holding pipet hazırlayın ucu 0,4-0,5 mm dir. Böyle bir boyut 2 dpf&#39;e Zebra balığı larvalarının yolk kesesi iyi tutuş sağlar. Uzun forseps kullanarak kapiller ve Bunsen beki ile kılcal zıt ucu 1-2 saniye süreyle ısı, alev ışığı mavi iç konisi, sıcak parçası üzerinde dikey yerleştirerek bir cam parçası bir ucundan tutun. bir bile erimeyen elde etmek için haddeleme. Bir sahne mikrometre (Ward 94 W 9910), birkaç kez, sonra mikroskop altında kılcal incelenmesi bu işlemi tekrarlayın. Bu önemli bir adım, larvaları işleme sırasında, birkaç holding pipetler ateş-lehçe ve daha sonra uygun bir boyutu seçmek için gerekli olabilir. Eğer dikkatli bir elinde pipet çoklu mikroenjeksiyon oturumları için sürer. </li><li> Mineral yağ üreticisi tarafından verilen talimatları izleyerek Manuel mikroenjektör Pompa (MMP, Dünya Precision Instruments, Inc.) Doldurun. Pipet tutucu bir demir plaka (Narishige IP) manyetik bir stand (Narishige, MN 151) ile bağlı bir joystick manipülatör (Narishige, MN-151), eklenir. </li></ul> Mikroenjeksiyon <ul><li> 20μl enjeksiyon karışımı hazırlayın: 2.4μl gentamisin (salin solüsyonu Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml) ve 10-kDa 17.6μl lucifer sarı dekstran (Invitrogen D1825, (tuzlu çözüm 1mg/ml) kontrol balık gentamisin serum fizyolojik ile değiştirilir. floresan dekstran (birçok farklı renkler kullanılabilir) enjeksiyon doğruluğunu ve larvaları nephrotoxicant enjekte edilmiştir seçmek için yeterli olacaktır. </li><li> Çözümleri buharlaşmasını önlemek için, altında enjeksiyon karışımı ve kontrol karışımı yerleştirmek için 2ml mineral yağ ile 2 30mm Petri kapları hazırlayın. </li><li> Anestezi 400 mg tricaine tozu (etil-m-aminobenzoate methanesulfonate SIGMA A-5040) 97.7 ml DD su, 2.1 ml 1M Tris (pH 9): hazırlayın. PH 7 ayarlayın. 4.2 ml hacimde, bu stok solüsyonu dondurucuda saklayın. Tricaine bir anestezik 4.2 ml, 100 ml E3 su (Westerfield 1993) tricaine stok solüsyonu sulandırmak ve oda sıcaklığında bekletin olarak kullanmak için. </li></ul> Aşağıdaki adımları diseksiyon mikroskop altında yapılmaktadır <ul><li> Elle ince forseps ile kalan herhangi bir chorions çıkartın ve oda sıcaklığında ısınmış tricaine ile bir Petri kabındaki aktardıktan zebrafish uyutmak. Zebra balığı microinjections başlamadan önce en az 15 dakika tricaine maruz olmalıdır. </li><li> Bir jilet (VWR bilimsel 55.411-050) kullanarak bir iğne ucu açın. Hafif bir açıyla eğim oluşturmak ve yaklaşık 10-20μm çaplı bir ipucu açılış elde etmek gibi ucu kesmek için bıçak tutun. </li><li> Mikroenjeksiyon cihazları (Dünya hassas aletler Inc, PV820 pnömatik picopump) güç, vakum ve hava kaynağı açın. Iğne, mikromanipülatör ve devirme tabanı (Word Precision Instruments, Inc, Model M3301R, TB-1) üzerine monte iğne tutucu içine yerleştirin. </li><li> Iğne doldurmak için, mineral yağ (Fisher Kimyasallar, 0121-1) ile dolu 30mm Petri kabındaki enjekte edilecek çözümün bir damlacık (10μl) yerleştirin. Batığın çözüm açılan iğne ucu kadar manuel mikromanipülatör açar picopump ayarlamak (&quot;delik&quot; PV820 vakum eşittir) &quot;çıkmasına&quot; yol geçiş ve çekerek iğne doldurup &quot;havalandırma / tutun.&quot; iğne ucu ile çözüm. Çözüm çok hızlı iğne içine alırsa, birkaç dakika sürebilir.ucunun çapı çok büyük olduğu anlamına gelir ve enjeksiyonlar doğru olmayacaktır. Iğne doldurulduktan sonra, (&quot;hold&quot; PV820 enjekte eşittir) &quot;tutmaya&quot; picopump ayarlayın. </li><li> Iğne kalibre etmek için, &quot;geçitli&quot;, menisküs işaretleyerek bir sonraki (1 seyahat etmek için gereken süreyi (saniye) iğne boşaltmak için ayak pedalına basın ve kayıt picopump &quot;geçitli / zamanlı&quot; anahtarı ayarlayın mm toplam mesafe). 3 kez tekrarlayın, ortalama süre (saniye) ve 30 (1 mm lineer mesafe ilgili nanoliters hacim (nl)) değeri bölmek çözüm 1 nl sunmak için gerekli milisaniye sayısını belirlemek için. Aralık dönemi topuzu bu numaraya ayarlayın ve &#39;zamanlı&#39; &quot;/ zamanlı kapılı&quot; anahtarı taşımak. Şimdi picopump 1nl darbe bir çözüm sunmak için ayarlanır. </li><li> Mineral yağ çanağı ve pozisyon mikroskop altında larvaları ile Petri kabı çıkarın. Petri kabı ve odak merkezinde balık. </li><li> Petri kabı ucu önceden ve mikroskop odak düzlemi içine, mikroenjektör karşı tarafında manuel mikroenjektör pompa tutarak pipet (MMP, Dünya hassas aletler) yerleştirin. Holding pipetle çok uç Petri kabı alt dokunarak ve yatay yakın olduğunu, böylece, oldukça sığ bir açı ile bükün. Tepki süresi yavaş ve MMP hassas azalacağı, sistem herhangi bir hava kabarcığı değil emin olun. </li><li> Mikroskop daha yüksek bir büyütme değiştirin ve holding pipet çok yakın yumurta sarısı ile larva balık dorsal yüzü aşağı pozisyonda kolu (Ted Pella 113) ile ince kirpik kullanmak. Manuel mikroenjektör pompa kontrol mikrometre sürücü saat yönünün tersine çevirerek holding pipet içine yumurta sarısı emerek larva balık tutun. Holding pipet içine çok derin çekti sarısı patlaması gibi, çok uzak mikrometre açmak için özen gösterin. Yumurta sarısı üzerine, sadece periderm altında yatıyor ve çok yüksek bir kan akışı site oluşturarak ortak kardinal ven odaklanın. Enjeksiyon aparatları mikromanipülatör ile, gelişmekte olan ortak kardinal ven içine iğne rehberlik eder. Ortak kardinal ven çok yüzeysel olduğu gibi, genellikle iğne takıldıktan sonra biraz geri çekmek için gerekli. Ayak pedalına basarak çözüm 1nl enjekte edilir, daha sonra holding pipet larvaları serbest ve embriyo su geri. Bu, özellikle kritik bir adım, ilk kez balık konumlandırma ve teçhizat emme ve basınç kontrol uygulama belirli bir miktar gerektirir çünkü. Embriyonun yumurta sarısı düzgün tutarak pipet ile yapılan iğne girerken, rulo değil. </li><li> Mikroenjeksiyon başarısını doğrulamak için, floresan mikroskop altında zebrafish kalbinde lucifer sarı dekstran varlığı monitör. Nefrotoksik çözüm enjeksiyon 2 saat içinde çok az lucifer sarı dekstran enjeksiyon yerinde kalan göreceksiniz doğru enjekte ise dolaşım sistemi içine gondererek önce yaklaşık 20 dakika süreyle kalp lucifer sarı görünür kalır. Çözüm yolk kesesi, lucifer sarı dekstran bir nokta enjekte ise enjeksiyon yerinde kalacaktır. (Şekil 1). E3 orta balık dönün. </li><li> İki gün sonrası enjeksiyon, larvaları (Şekil 2) azalmış böbrek fonksiyonu bir sonucu olarak perikardiyal ödem geliştirmek. </li></ul> Bölüm 2: Fiksasyon ve immünofloresan Na + / K + ATPaz antikor (α-6F) <ul><li> Dpf&#39;e 4, 10 ve 15 larva zebrafish 4ml cam şişeleri (Weathon 225.012) arasında 1ml Dent (80% MeOH% 20 DMSO) RT az 4 saat koymak ve onları düzeltmek. </li><li> Çözüm pipetleme ve (aynı flakon için yeni bir çözüm ekleyerek, kademeli bir MeOH / PBT (0.5% Tween20 ile PBS) serisi, 75:25 50:50, 25:75,% 100 PBT embriyolar rehidrate başına çözüm 1 ml flakon), her çözümün 20 dakika. Larva havaya maruz asla çözümler değiştirirken larvaları kapsayan küçük bir çözüm bırakın. </li><li> PBT çıkarın ve bir nutator 4 ° C az 3 saat engelleme solüsyonu (PBS DMSO ile% 1,% 0.5 Tween20,% 10 normal keçi serumu) 1ml yerine. </li><li> 2ml mikrofuge&#39;ye larva transferi. Serum engelleme çıkarın ve bir nutator 4 ° C&#39;de bir gecelik inkübasyon çözüm 300μl primer antikor (% 1 PBS ile DMSO,% 0.5 &#39;lik Tween20,% 2 Normal keçi serum) ile değiştirin. Biz 1:25 seyreltme monoklonal Na + / K + ATPaz antikor (α-6F, süpernatant, Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa) </li><li> Primer antikor çıkartın ve oda sıcaklığında inkübasyon solüsyonu ile 3 x 30 dakika yıkayın. </li><li> Sekonder antikoru (keçi anti-fare cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) ile inkübe 2 saat inkübasyon çözüm 1:500 seyreltilmişRT. </li><li> PBT 3 x 30 dakika yıkayın. </li></ul> Bölüm 3: JB-4 plastik gömme <ul><li> , Adım başına 10 dakika kademeli etanol serisi (% 75;% 95% 100 x 2% 50) ile doku dehydrate. </li><li> JB-4 Gömme Çözüm 25 ml (Polysciences 0226A) ve katalizör 0.24g (Polysciences 02.618): infiltrasyon çözüm hazırlayın. Katalizör yaklaşık 20-30 dakika çözmek için bir süre alır. Çözüm 4 saklanabilir ° C 1 aya kadar. </li><li> % 100 etanol Durusu ve plastik infiltrasyon çözümü ile değiştirin. Rotator şişeleri 4 ° C yerleştirin ve infiltrasyon larvaları lavabo cam flakon altına kadar devam etmek için izin. Bu işlem genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin plastik kalıp fincan tepsisi (Polysciences, Inc. 16643A): protokol gömülmesi. Bardak içine kapsayacak şekilde infiltrasyon çözümü ile birlikte, larva transferi. Plastik gömme medya küçük bir plastik tüp hazırlanır. Biz normalde bir seferde bir balık Her fincan için 4-5 balık gömün. Infiltrasyon çözüm her ml 5-6 ml (1.2 ml Her fincan için çözüm gömme) gömme plastik JB-4 Gömme Çözüm &quot;B&quot; 35 ul (Polysciences Inc. 0226B) ekleyerek hazırlayın. Infiltrasyon çözüm her ml JB-4 Gömme Çözüm &quot;B&quot; (Polysciences A.Ş. 0226B) 35 ul ekleyin. Plastik Pasteur pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme, iyice karıştırın. Karışık değilse de JB-4 düzgün Polimerize olmaz, çünkü bu önemlidir. Gömme plastik 5ml hazırlandıktan sonra, Pasteur pipeti ile örnek etrafında infiltrasyon plastik çıkarın. Plastik gömme su bardağı doldurun. Örnek blok sahibi iyi eki sağlamak için plastik bardak, dışarı sızmak gerekir. Zebrafish renal tübüller tespit için, enine kesitler iyi. Bu amaçla, balık dikey gömülü, baş aşağı. Kirpik sap veya ince forseps yardımı ile plastik onların konumunu hareket etmiyor o kadar da zor hale gelene kadar, periyodik olarak, dikey balık pozisyon. Yaklaşık 20-30 dakika sürer. Daha sonra, bardak üzerinde EBH-2 Blok Tutucu (Polysciences A.Ş. 15.899) yerleştirin ve 4 tepsi ° C gecede terk. Polimerizasyon eksik, buz küpleri gibi bloklar pop. </li><li> Birden fazla larva için alternatif gömme protokolü: yarım tam JB-4 kalıpları doldurun ve polimerize izin. 15 mm kare kalıplar için yarım kalıp doldurmak için 700μl JB-4 birimini kullanır. Sonra, önceden polimerize yarı dolu kalıplara sertleştirici ile JB-4 batırılmış larvaları ekleyin. Orient kafa kalıp uzun tarafına doğru baktığından ve larvaları hizalamak larvaları gözbebekleri hattı (bir satır tek bir kalıp içinde 10 balık koyabilirsiniz). Blok polimerize sonra, blok kenarları kesebilir tarafı bıçak bakacak şekilde açın ve mikrotom uygun bir plastik &quot;chuck&quot; superglue. Bu yöntem ile plastik merkezli aynı blok ve kesitleri için hazır larvaların çok sayıda pozisyon olabilir. Bakım her balık eşdeğer bölümleri tek bir bölümü alınır, böylece bıçak bloğu yönlendirme alınacak. Gözüyle kesit ederken bu gerçekleştirilebilir: yani yönlendirmek blok gözleri eşdeğer bölümlerde her bir balık için alınır böylece. Sonuçta tek bir mikroskop lamı üzerine, eş zamanlı olarak pek çok balık analiz edebilirsiniz. </li></ul> Bölüm 4: Kesit <ul><li> Mikrotom mandren tutucu (biz Shandon Finesse Thermo Electro Corporation mikrotom) numune ayarlayın </li><li> 45 sıcak slayt ayarlayın ° C </li><li> Behere DI su dökün ve mikrotom yakın yerde </li><li> Kesit önce, balık mükemmel enine bölümleri elde etmek için blok gibi odaklı olduğundan emin olun. Yönelim baş ayar kolları bıçak doğru örnek kafa pozisyonu sağlayan döndürülebilir. Kalınlığında kesitler balık kafası ile kesme başlayın. Yönlendirmek blok gözüyle kesit ederken, gözleri eşdeğer bölümleri her balık için alınan böylece. Pronephric tübüller başlattığınızda pektoral yüzgeçler bölümlerde göründüğünde, yani. Bu noktadan itibaren, 4 blok 32 um bölümleri hakkında kesin. </li><li> Forseps ile bölümleri toplayın ve forseps ile su dokunmadan, onları su ile beher içine bırakalım. Su yüzeyine çarparsa bölüm yakında genişleyecektir, şimdi bir slayt toplayabilirsiniz. 45 ° açıyla suya slayt takın ve sadece bölümün sınırları dokunmadan, kulplu bir kirpik yardım bölümü yaklaşım. </li><li> Tamamen kuruyana kadar sıcak bir slayt slaytlar inkübe edin. </li><li> Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak bölümleri. </li></ul> Bölüm 5: Temsilcisi Results Doğru yapıldığında, enjekte balık küçük floresan dekstran, kalp ve dolaşım sistemi görünür (Lucifer Sarı bu durumda), Şekil 1 gibi görünür. Enjeksiyon çok derin ise, enjekte edilen malzeme yolk kesesi konsantre olabilir, ya da kalbin aşırı kanama neden yırtılmış olabilir. Holding pipet doğru yapılırsa, balık rulo veya hareket enjekte edildiğinde, bu daha doğru bir enjeksiyon sağlayacaktır. Ayrıca, tepki süresi yavaş ve sistemi hassas azalacağı, MMP herhangi bir hava kabarcığı değil emin olmak için önemlidir. Genellikle, gentamisin nefrotoksisite bir sonucu olarak, enjekte edilen balığın% 80 perikardiyal ödem (Şekil 2) geliştirmek. Biz belirgin perikardiyal ödem, ancak hafif ve orta eksenin eğriliği ile ciddi ödemli balık, perikardiyal ve gövdede ödem, başkaları değil, fenotipleri gözlemlenebilir orta derecede ödem ile balık fenotip temelli bir sınıflandırma sistemi kullanır. Renal tübül antikor karşı Na + / K + ATPaz (α-6F) denetimleri (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, hasarlı tübüller hücre polarite ve tübüler bozulma belirgin bir kayıp ile enine bölümlerde hasarlı tübüller oluşturulabiliyor . Bu desen, çok sayıda enine bölümleri ile tutarlıdır. Gömme sırasında balık doğru konumlandırmak için önemlidir renal tübüller mükemmel enine bölümleri elde etmek için. Bölümleri karşılaştırıldığında, göğüs yüzgeçleri ve proksimal dolambaçlı tübüller anatomik belirteç olarak kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Nephrotoxin mikroenjeksiyon. Lucifer sarı, beyaz ok ortak kardinal ven soluk bir ifade ile konjuge (A) Başarılı bir 10kDa dekstran enjeksiyon,. (B), dolaşım sistemi, kırmızı ok içine dağıtmak değildir lucifer sarı konjuge 10kDa dekstran mevduat yanlış enjeksiyon sonucu. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Gentamisin-aracılı ödem. (A) Kontrol larva zebrafish enjekte. Gentamisin ile larva Zebra balığı (B) orta veya şiddetli ödem (C) enjekte edilir. Tüm larvalar, sol anterior 4 dpf&#39;e ve dorsal kadar. Siyah oklar, B ve C perikardiyal ödem <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 AKI immünhistokimya. kontrol Na + / K + ATPaz 48 saat sonrası gentamisin enjeksiyonu (4 dpf larvaları) (A, B) ve gentamisin enjekte (C, D) larvaları için α-6F antikor boyama. A, C bazolateral polarite ve tübül bozulması, beyaz ok, D, A ve C Not kaybı doğru Tübüllerin 3X dijital büyütmelerde B&#39;ye göre 20X büyütme ve B ve D.

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia.">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li><li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock,+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish.">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1993).</li></ol>

Bu video makalede AKI bir model için bir intravenöz mikroenjeksiyon tekniği, Zebra balığı larvaları gentamisin aracılı proksimal tübüler hasar oluşturarak gösterdi. Bu hasar, perikardiyal ve / veya ağır ödem oluşumunu sonuçları, su dengesini düzenleyen bir yetersizlik yansıtan. Ayrıca hücre polarite kaybı ve hasarlı böbreklerde proksimal tübül bir bozulma gösteren, farklılaşmış böbrek kanallarında (Majumdar ve ark 2000) işaretleri bir antikor ile bir immünhistokimya deney nitelendirdi. İntravenöz microinjections Zebra balığı larvalarının kana çözünebilir bir madde sağlamak için etkili bir yöntem temsil eder. Bu teknik, çeşitli maddelerin bir tanıtım için mükemmel bir araçtır, floresan işaretleyici üniforma enjeksiyonları yardımı ile tutarlı sonuçlar için izin defalarca tekrar edilebilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;6F mouse monoclonal </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental study Hbridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Block Holder EBH-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, INC</td>
<td>TW100-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company, Broomall PA</td>
<td>9-000-3000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalyst Powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>02618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.</td>
<td>155-165-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular probes</td>
<td>D1825</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eyelash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>G8648</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials 4ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Weathon</td>
<td>225012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iron plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nariscige</td>
<td>IP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>0226A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>0226B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Joystick micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual microsyringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electro Corporation</td>
<td>Shandon Finesse</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil, light</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>0121-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kopf</td>
<td>720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic molding cup tray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>16643A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WVR Scientific</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide warmer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage micrometer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wards </td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tilting base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TB 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P7949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>S6F</td>
<td>Dissecting microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205FA</td>
<td>Fluorescent microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury

Bu video makalede nephrotoxicant olarak gentamisin kullanarak AKI zebrafish modeli açıklanmaktadır. Tekniği 2 dpf&#39;e zebrafish intravenöz microinjections oluşur. Bu teknik, saatte 15-20 balık enjeksiyon için izin, Zebra balığı larvalarının kana çözünen maddeler sunmak için etkin ve hızlı bir yöntem temsil eder. AKI çalışmaları yanı sıra, bu mikroenjeksiyon tekniği da, anjiyografi gibi deneysel çalışmalar, diğer türleri için kullanılabilir. Biz, azalmış böbrek fonksiyonu görsel önlemler için gerekli ekipman tekniğin ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda bir böbrek tübül marker, plastik gömme ve larva zebrafish kesit fiksasyon, tüm montaj immünohistokimya sürecini göstermektedir. Ödem, proksimal tübüler epitel hücreleri hücre polarite kaybı ve tübül morfolojik bozulması: gentamisin ile enjekte Zebra balığı larvaları tutarlı AKI ile morfolojik özellikleri göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury at JoVE.com

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. 2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Video: Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Zebra balığı larvalarının Microgavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...