Bu prosedürün genel amacı, cisplatinin yetişkin zebra balıklarında nefrotoksik bir ajan olarak kullanılması, iltihabın analiz edilmesi ve böbrek dokusunda hücre ölümü açıklanmaktadır. Bunu başarmak için ve yetişkin zebra balıkları uyuşturulur ve periton boşluğuna belirli bir doz cisplatin enjekte etmek için tartılır. Mortaliteyi izledikten sonra böbrek parçalanır ve hücreler akış sitometrisi için izole edilir veya floresan TUNEL tahlili ile analiz edilmek üzere sabitlenir ve parçalara ayırılır.
Aşağıdaki prosedürler, akut böbrek yaralanması modeli ve yetişkin zebra balığı geliştirmek için bir araç olarak cisplatinin nefrotoksik etkilerini kullanarak böbrek alanındaki önemli soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu model, böbrek korumasında yeni terapötik hedeflerin araştırılması ve zebra balık böbreğindeki yenilenme mekanizmasının aydınlatılması için kullanılabilir. Cisplatin, çeşitli kanserleri tedavi etmek için kullanılan bir kemoterapi ajanıdır.
Bununla birlikte, böbrekte kolayca birikebilir, hücre ölümü, iltihaplanma üretebilir ve böbrek fonksiyonunu azaltabilir. Cisplatin etkisi doza bağlıdır, bu nedenle dozlama artışımızı hedeflerinize bağlı olarak düşürebilirsiniz. Burada inflamasyon ve hücre ölümünü analiz etmek için kullanılan teknikler sadece hastalık modelinin yayılması için değildir.
Zebra balıklarındaki akış sitometrisi, hayvanın enflamatuar durumlarını nicel bir şekilde aydınlatmaya yardımcı olabilirken, TUNEL'de fizyolojik ve patolojik bağlamlarda poptozlu hücrelerin varlığını netleştirebileceğini söylüyoruz. Deneye başlamadan önce, stok çözeltisini % 0,9 sodyum klorürde mil başına 820 mikrograma seyrelterek cisplatin çalışma çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, başka bir zebra balığını uyuşturun ve bazı kağıt havlulardaki fazla suyu kurulayın.
Balıkları bir tartıya yerleştirerek, ağırlığı not alarak tartın. Enjekte etmek için tam hacmi bilmek için hesaplamaları yapın. Gram ağırlık başına 120 mikrogram dozu elde etmek için bir sonraki formülü kullanın.
Son dozu çalışma çözeltisinin dozu ile bölün ve 120 mikrogram cisplatin hacmini elde etmek için 1000'e çarparak bu sayıyı mikrolitrelere dönüştürün. Daha sonra, enjekte edilecek son hacmi elde etmek için bu sayıyı balığın ağırlığıyla çarpın. Islak bir süngerin üzerine, tutmak için küçük bir fincanla bir balık yerleştirin.
Ventral tarafı yukarı ve hesaplanmış bir cisplatin hacmi ile bir insülin şırınna doldurun. İğneyi ventral orta çizgiye sığ bir açıyla yerleştirin, iç organları delmemek için ventral duvarı hafifçe yukarı çekerek. Ve sonra çözeltiyi enjekte edin.
Enjeksiyondan sonra, anesteziden kurtulmak için bir tanka bir balık yerleştirin ve yüzme ve uygun hareketler gibi iyileşme belirtilerini bekleyin. Sonraki günler için günde iki kez balıklara bak. Bu dozda, cisplatin ilk 24 saatte mortalitenin yaklaşık% 30'unu indükler.
Balıkları ötenazileyin ve kağıt havluda fazla suyu kurulayın. Başı ve iç organları çıkardıktan sonra, vücut duvarlarını sabitlemek için diseksiyon iğneleri kullanın. Balığın dorsal duvarında böbreği bulun ve böbreği ayırmak için tokmak kullanın.
Böbreği bir 1X PBS, % 2 FBS'lik serin bir çözelti ile altı kuyu plakasına yerleştirin ve buzda tutun. Daha sonra, dokuyu bir miktar sıvı ile alın ve 40 mikron hücreli bir süzgeçten geçirin ve dokuyu bir şırınga pistonu ile hafifçe maceralaştırın. Bir adet 1X PBS, %2 FBS ile iki kez yıkayın.
Ve hücreleri 50 mils şahin tüpünde toplayın. Sonra 400 G.'de beş dakika santrifüj yapın. Hücreleri yeniden askıya almak ve beş mil akışlı sitomemetri tüpüne yerleştirmek için 500 mikrolitre soğuk 1X PBS ekleyin.
Onları buzda tut. Numuneden 10 mikrolitre alın ve bir Eppendorf tüpünde 90 mikrolitre trippan mavisi ile karıştırın. Bir Neobauer odasına 10 mikrolitre karışım ekleyin ve mikroskoptaki hücreleri sayın.
Bir sitometre ile okunacak hücreleri alın ve ardından ilgi alanlarınızın popülasyonunu seçerek sonuçları analiz edin. Bu işlem için, bir balığı ötenazi edin ve böbreği vücuda bağlı bırakarak iç organları çıkarın. Ardından, gövde duvarlarını bir mantar yüzeyine sabitlayın ve sabitleme çözeltisinin üzerine kademeli olarak yerleştirin.
Bir gecede 4 derece olsun. Ertesi gün, böbreği ince bir kürs ile parçalara ayrıştırın. Bozmamaya çalış.
Durulamak için küçük bir petri kabına veya 1X PBS'li Eppendorf tüpüne yerleştirin. PBS'yi değiştirin ve sağlam bir şekilde işlemden önce böbrek için bir destek matrisi oluşturmak için% 2 agarose hazırlayın. Kalan tüm PBS'leri atın ve agarose'yi yavaşça dökün.
Daha sonra, böbreği katlanmasını önlemek için ince forseps ile konumlandırın. Agarose oda sıcaklığında katılanın. Agarose katılaşmasından sonra, küçük küpler oluşturan böbreklerin etrafındaki Agarose'yi kesmek için bir neşter kullanın.
Agarose küplerini histolojik bir kasetin içine yerleştirin ve dokuyu parafin içine gömmek için histolojik işleme gönderin. Parafin blokları, daha sonra beş mikron kalınlığında bölümler keseceğiz. De-wax slaytlar ve damıtılmış suda tutmak.
Alta ıslak kağıt havlu koyarak koyu renkli bir inkübatör odası hazırlayın. Slaytları karanlık odaya yerleştirin ve dokunun permeabilizasyonu için Proteinaz K ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
Numuneler inkübe edilirken, 450 mikrolitre etiket çözeltisine 50 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyerek TUNEL reaksiyon karışımını hazırlayın. Ve ışıktan korun. Koyu odayı alın ve bir 1X PBS ile iki kez dilim yıkayın.
Ardından, slaytları kurutun ve TUNEL reaksiyon karışımının üzerine koyun. Ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. İnkübasyondan sonra, bu slaytları bir 1X PBS ile tekrar yıkayın.
Ve çekirdek sayacı boyama için DAPI ekleyin. Beş dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatarak, ışıktan korunur. Bir adet 1X PBS ile üç kez durulayın.
Ve sonra, slaytları solmaya karşı hidrofilik bir ortamla şekillendirin. Bir kapak fişi yerleştirin. Ve oje ile mühürleyin.
Örnekleri floresan mikroskopta görselleştirin. Bu grafikte, cisplatin'in sadece% 0.9 sodyum klorür ile enjekte edilen bir kontrole kıyasla, balık hayatta kalma üzerinde bir doz yanıt etkisine sahip olduğunu görmek mümkündür. Bu grafikteki kırmızı çizgi, bu videoda kullanılan gram başına 120 mikrogramlık bir dozu temsil ediyor.
Bu doz erkeklere ve kadınlara uygulanabilir, çünkü aralarında istatistiksel bir fark bulunmadı. Akış sitometrisi, bir dokuda bulunan farklı hücrelerin ölçülmesini sağlar. Hematopoetik hücre popülasyonları, birkaç balığın böbreğinde boyut veya ileri saçılım ve taneciklilik veya boyut dağılımlarına göre tanımlanır.
Bu şekilde, eritrositler, lenfositler, granülositler ve hematopoetik öncüllerdeki popülasyonları ayırmak mümkündür. Burada granülositleri, singlet'ları ve MPO pozitif hücrelerini seçen mevcut kapı stratejisi, miyelooperoksidazın floresan ekspresyumu ile işaretlenmiş böbrekteki nötrofillerin popülasyonunun bulunmasına izin verir. Bu durumda, cisplatin enjeksiyonu böbrekte bulunan nötrofillerin yüzdesinde artışa neden oldu.
TUNEL tahlil, bir dokudaki apoptotik hücrelerin, floresan mikroskopla böbreğin doku kaymasını gözlemleyerek tespit etmesine izin veriyor, bazı hücrelerin çekirdeklerinin içinde apoptotik sinyali görmek mümkün, burada kırmızı. Maviler içinde böyle bir DAPI'daki nükleer lekenin tezattı. Cisplatin enjeksiyonu böbrekte apoptotik hücrelerin varlığını artırdı, manuel olarak veya bir görüntü yazılımı kullanarak ölçmek mümkündür.
Bu videonun sonunda, yetişkin zebra balıklarında akut böbrek yaralanmasına neden olmak için cisplatin dozunun nasıl enjekte edileceğini ve ayarlanacağını bilmelisiniz. Ve böbreğin farklı amaçlarla nasıl parçalanarak incelenerek nasıl incelendirilmek. Akış sitometrisi, laboratuvarınızdaki tragenklav hatlarının mevcudiyetine bağlı olarak farklı hücre türlerinin profilini anlamanıza yardımcı olacak mükemmel bir araçtır.
Tüm hücre tiplerini etiketlemek için antikor kullanmak istiyorsanız, taşıyıcı çizgilerinin rengini göz önünde bulundurmayı unutmayın. TUNEL tahlili, apoptotik hücre ve dokuyu tespit etmemizi sağlayan basit bir araçtır ve sadece mikroskopi ile değil, aynı zamanda akış sitometrisi ile de analiz edilebilir. Unutmayın, tüm prosedür boyunca her zaman kişisel koruyucu ekipman kullanın.
