Name: kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury
Uploaded: 2015-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury at JoVE.com

This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

NOT: Etik Beyanı: Bütün deneyler, araştırmada hayvan kullanımı için Massachusetts General Hastanesi esaslara uygun olarak yapılmıştır. 1. Ön Hazırlık <ol><li> Kaç yetişkin zebrabalıkları 6-12 aylık yaralama belirleyin. Plan gerekli olacak% 10-20 daha fazla balık yaralama. Değişkenliği en aza indirmek için, kullanımı yaşı kabaca aynı boyutta ve daha az genetik değişkenlik için, aynı tankın birlikte yetiştirilen eş balık eşleşti. Kadın balık nedeniyle karnın geniş kapasiteli, erkek balıkların göre enjekte çok daha kolay. Ancak, erkekler ve dişiler benzer sonuçlar verir. </li><li> İlk kez deney yaparken, balık belirli bir suş için uygun olan gentamisin dozajı belirlemek için bir doz eğri çizilir. Gentamisin saflık partiden partiye değişiklik beri deneylerde kullanılmadan önce gentamisin her yeni toplu test edin. Uygun bir dozaj expressi değerlendirerek belirlenmelidirBöyle lhx1a olarak yaralanma belirteçlerin üzerinde. (- D Şekil 1A bakınız). </li><li> Gentamisin çözüm hazırlayın. Gentamisin stok çözeltisi, -20 ° C&#39;de saklanır ve daha sonraki kullanım için çözülmüş olabilir. Örneğin, 0.5 g ağırlığındaki bir balık, bir 80 mg / kg dozda (vücut ağırlığı 80 mg gentamisin / kg) için, uygun bir çalışma çözeltisi olarak fosfat tamponlu tuzlu su içinde gentamisin 2 mg / ml hazırlar. Bu balıklara intraperitonal enjeksiyon için gentamisin 20 ul içerir. Not: Genellikle, 80-120 mg / kg uygun olabilir, 40 mg / kg kadar düşük iyi sonuçlar fakat dozlar elde edin. Gentamisin ayrıca laboratuvar personeline tehlikeli maruziyeti en aza indirmek için çözelti içinde satın alınabilir. NOT: Yüksek dozlarda Gentamisin toksik olabilir. Eldiven giyin ve toz ağırlığında zaman maske. </li><li> Balık anestezi için% 0.016 tricaine 100 ml su hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C de pH = 7 ve saklamak için ayarlama steril MiliQ suyu içinde çözülmüş tricaine (4 g / 1 L) içindeki bir 25x stok hazırlayın. 4 m seyreltin0.016% bir çalışma konsantrasyonu balık, 100 ml su içinde l. NOT: işlerken Tricaine bir anestezik ve cildi tahriş olduğunu eldiven giyin. </li><li> Bir balık, bir kepçe şekline ampul kesme ve suyun tahliye edilmesi alt 2 yuva keserek plastik bir transfer pipet dışarı kepçe olun. Hazırlanan gentamisin çözeltisi (10 ul geçişleri ile) Yük 1ml şırınga ve bir 30½ G iğne takılır. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Iğne ucu açılı dönük ve şırınga işaretleri ileri ve okunabilir karşı karşıya olduğundan emin olmak için şırınga iğne bükün. Kontrol enjeksiyonları için steril PBS ile bir şırınga ve iğne hazırlar. </li><li> Temiz bir yüzeye sahip bir ölçek hazırlayın ya da balık kurutma ve enjeksiyon için balık tutmak için tekne yanı sıra kağıt havlu tartın. </li><li> Gözlem gecede sonrası enjeksiyon için balık tutmak için kapaklı bireysel küçük yarım litrelik kapları hazırlayın. Küçük şeffaf plastik birleşme kafesleri, bu amaç için yararlıdır. Bunlarkonteynerler beyaz olmamalı - balık döken beyaz epitel yayınları siyah tezgah üstünde görülebilir, böylece ideal onlar açık olmalıdır. Balık rahat yüzmek için yeterli balık suyu ile her doldurun. </li></ol> Gentamisin 2. intraperitoneal enjeksiyon <ol><li> Balık su içinde% 0.016 tricaine çözeltisi içinde balık anestezisi. Yavaş solungaç havalandırma oranı ve artık dokunmak yanıt balık bekleyin. </li><li> Solungaçları veya yüzgeçleri zarar önlemek için kuyruk doğru baş hareket, balık kepçe kullanarak balık kadar Scoop. Yan yavaşça balık çevirerek fazla suyu emer ve kepçe aşırı su sıyrılmaya kağıt havlu üzerine balık yerleştirin. </li><li> Yine balık kadar kepçe ve sıfırlanmış ölçekte tartmak tekne yerleştirin ve balık tartın. En yakın 0.25 g Yuvarlak ve enjekte etmek gentamisin uygun miktarda hesaplar. NOT: 0.5 gr balık için 8 de bir 20 ul enjeksiyon kullanın0 mg / kg doz. </li><li> Yine balık kadar kepçe ve kuru katlanmış kağıt havlu üzerine koyun. Sağ elini kullanan enjekte ise, sol elinde kağıt havlu tutun ve karın kolayca erişilebilir olan balığın baş, solu gösteren yerleştirin. </li><li> Kloakanın için karın cildine, anterior 45 ° açıyla iğne ile şırınga tutun. Derinin hemen altında iğneyi itin, ardından açıyı azaltmak ve iç organları kaçınarak, deri altında ileri iğne kaydırın. Daha sonra iğneyi geri çekme, hiçbir sıvı iğne etrafında geliyor emin olmak için duraklatmak, dalgıç uygun miktarda basınız. Balık sabit tutan bir sorun varsa, gövde karşı ayracı dirsekler, onları stabilize etmek. NOT: gentamisin çözüm tutarken eldiven giyin. </li><li> Bağımsız bir kabın her bir balık bırakın. Balık gözlemlemek ve anestezi onun kurtarma sağlamak. 28.5 ° C balık gecede tutun. NOT: Balık hemen canlandırmak etmezse, plastik trans kullanınkendi solungaçları onu canlandırmak genelinde ferin pipet su sulamak için. </li><li> Gentamisin aynı dozda çok balık enjekte ederken, aynı şırınga ve iğne kullanın. Uygun biohazard kesici kabına kullanılan şırınga ve iğne atınız. </li></ol> Yaralanma 3. Mesaj Enjeksiyon Gözlem <ol><li> Ertesi gün (1 gün sonrası yaralanma), karanlık bir yüzeyde kendi kabında enjekte balık yerleştirin. Yaralı balıklar tarafından atılır ölü epitel doku Beyaz yayınları görünür olmalıdır. (- H Şekil 1E bakınız). Hiçbir yayınları, yoksa her iki balık gentamisin enjeksiyonu ile yaralanan olmadı (doz ya da çok düşük, ya da enjeksiyon işlemi sırasında sızan gentamisin bazı) veya balık ciddi üreterler ve kloakanın tam tıkanma sonucu yaralandı sloughed doku ile. NOT: Balık genellikle 2-3 gün içinde ölecek olan vücuttan atmalarını temizlemek değiştiremiyor ve uzun süre bu nedenle kullanılamaz isetahlilleri. Hiçbir yayınları görünmüyorsa, solungaç hareketi durduktan sonra en az 10 dakika süreyle daldırarak tricaine suda balık euthanize. </li><li> Beyaz doku yayınları görünür durumdaysa, bir kenara balık ayarlamak ve diğer balık denetimi devam edin. Gentamisin Uygun bir doz kullanılabilir olan balık% 80-90 neden olur. Yaralı balık havuzu ve daha sonra istenirse farklı tedavi grupları bölebilirsiniz. </li></ol> Kurtarma Balık 4. Bakım <ol><li> Temiz su ve uncrowded ortamda balık tutmak. Kirli su ve kalabalık enfeksiyonları ve istenmeyen ölüme yol açacaktır. Mümkünse günlük su en fazla 6 balık / balık suyu 500 ml tutmak ve değiştirmeye çalışın. NOT: Bu alan korunması için ya da araştırmacı pahalı ilaç tedavileri kullanarak deneyler yapmak isterse asgari birimdir. </li><li> 3 gün yaralanma sonrası kadar balık yem etmeyin. Kurtarma balıklar ilk yemek olmaz ve tank içinde herhangi bir gıda ayrıştırmak ve bakteri gr teşvik edeceğizowth. 3 gün sonra, hasardan başlayarak, günde bir kez az miktarda beslenir. </li></ol> Yaralı Böbrekler 5. Analizi <ol><li> Lhx1a mRNA ifadesi için in situ hibridizasyon için, böbrekler istenilen zaman noktalarında balık hasat edilebilir. Gill hareketi duruncaya kadar buz üzerinde tricaine su içinde en az 10 dakika balık Euthanize, daha sonra, bir tıraş bıçağı ile baş kaldırmak ve vücut boşluğu açmak ve forseps ile iç organları çıkarın. </li><li> Yer (dorsal vücut duvara bağlı pigmentli organı) olarak böbrek bırakın ve geceleme PBS içinde% 4 paraformaldehid balık düzeltin. Böbrek 15 inceleyin ve in situ hibridizasyon standart devam edin. <ol><li> Kısaca, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile PBST içinde proteinaz K (10 ug / ml) ile geçirgen PBST (Fosfat tamponlu tuzlu su,% 0.5 Tween 20) ile, böbrekler yıkayın. % 4 paraformaldehid ile Post-düzeltmek ve PBST ile tekrar yıkanır. </li><li> Sonra 68 gece boyunca böbrekleri öncesi melezleşmeHibridizasyon tamponu (% 50 formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml tRNA,% 0.1 Tween20, pH 6.0) ° C&#39;dir. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde digoksigenin işaretli prob ile inkübe edin, daha sonra 68 ° C&#39;de,% 100,% 75,% 50,% 25 hibritleme tamponu ile 5-10 dakika süreyle, her yıkama, daha sonra oda sıcaklığına kadar taşınır ve 30 dakika ile iki kez yıkayın 2x% 0.1 Tween20 ile SSC ve% 0.1 Tween20 ile 0.2X SSC ile 30 dakika boyunca iki kez yıkanır. </li><li> MAB örnek 3x 5 dk (0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) ve% 10 keçi serumu ile MAB 4 ° C&#39;de gece boyunca bloke dengelenmesi. Sonra, anti-digoksijenin-AP Fab 1 gecede örnekleri inkübe: 5,000 MAB. </li><li> MAB 1 saat boyunca Örnek 5x yıkayın ve NTMT 15 dakika boyunca (0.1 M Tris pH 9.5, 0.05 M MgCI2, 0.01 M NaCI, 50 ul Tween 20) için 3 kez dengelenmesi. </li><li> Ardından sinyali tespit etmek NBT / BCIP ile böbreklerin davranın. % 4 paraformaldehit ile böbrekler düzeltmek ve remo dimetilformamid kuluçkalanmıştıriyonu giderilmiş su içinde gece boyunca ağartılmış NBT / BCIP, fazla ve. Böbrekler yıkanır ve daha sonra bir lamel altında% 50 gliserol ile PBST içinde fotoğraf. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+proximal+tubule+does+not+involve+specialized+progenitors.">Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).</li><li>Guo, J. K., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+maintenance+and+repair+of+the+kidney.">Cellular maintenance and repair of the kidney.</a> Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).</li><li>Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration:+common+themes+from+the+embryo+to+the+adult.">Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult.</a> Pediatr Nephrol. , (2013).</li><li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell.">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li><li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development.">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Dev Biol. 320, 161-174 (2008).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish.">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day.">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li><li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

zebra balığı yetişkin mezonefrik böbrek 6 dahil olmak üzere yetişkinlerdeki organların rejenerasyonu çalışmak için idealdir. Son çalışmalar daha nefron rejenerasyon sırasında meydana gelen adımları tanımlamak için moleküler belirteçlerin ve yeni transgenik muhabiri hatları avantaj almış ve 7,12 sorumlu neler hücreler olabilir. Idrar atmalarını Gözlem insanlarda 16 böbrek hastalığı teşhis etmek için bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Burada gentamisin enjeksiyondan sonra akut böbrek hasarının ölçüde bir, kolay invaziv olmayan ve erken göstergesi olarak atmalarını varlığı kullanın. Biz yayınları ya sadece hafif yaralanan üretemezler (ve yeni nefron oluşturmayan) kurtarmak için ya da çok yaralı ve genellikle ilk 3 gün içinde öldüğünü balık gözlemlemek. Bu nedenle, protokolün içinde kritik bir adımdır yaralanma sonrası balık bireysel gözlem ve üriner varlığı doğru yaralanma seviyeleri bir göstergesi olarak atmalarını. Biz de lhx1a ifadesini bakınızagrega yaralanma sonrası 4 gün başlayan. Bu yaralanmadan sonra ilk 3 gün kurtarma için çok önemli bir dönem olduğunu göstermektedir. Balık çok sayıda yaralanmamış olan ya da çok fazla balık deney sırasında ölen varsa, periton enjeksiyonlar düzgün yapılıyor emin olmak için kontrol edin. Enjeksiyon sırasında herhangi bir sızıntıyı görselleştirmek için gentamisin çözeltisine fenol kırmızı gibi, toksik olmayan bir boya eklemek için yardımcı olabilir. Kalıcı bir işaretleyici veya ucundan bant 2 mm bir parça ile iğne İşaretleme balık içine çok iğne iterek önlemek için bir rehber olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, gentamisin dozaj ayarlanması gerekebilir. Gentamisin dozlar aralığı ile balık enjekte edilir ve in situ hibridizasyon veya nicel RT-PCR ya göre lhx1a mRNA ekspresyonu için böbrekler test edin. Bu tekniğin bir sınırlama gece boyunca balık yaralı seçilerek önce konut, bireysel balık gerektirirdeney. Balık hatta bireysel gözlem döneminde sürekli deneysel tedavi altına gerekebilir (yaralanma sonrası ilk 24 saat içinde) rejenerasyon çok erken olayları incelemek. ilaç tek tek balık tedavi maliyeti, örneğin, çok yüksek olabilir. Araştırmacı noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak aykırı ortadan kaldırmak için izin verir, çünkü bizim teknik, gentamisin kullanarak akut böbrek hasarı mevcut yöntemine bir gelişmedir. Bu, sağlam üniforma ve tekrarlanabilir yaralanma modeli artık etkili bir yetişkin zebrafish böbrek rejenerasyon ile ilgili hipotezleri test etmek için kullanılabilir. Biz rejenerasyon (burada gösterilen tüm veri kadın vardır) hem erkek hem de dişi zebrabalıkları gerçekleşmesine rağmen, erkeklerde gentamisin enjeksiyonuna yanıt yenilenmesi çok daha değişken olduğu görülmektedir. Kadın çok daha büyük bir b varken vücutları, uzun, ince ve daha kaslı olduğu için bu, teknik nedenlerden dolayı olabilirkolay enjeksiyon ve sızıntı olmadan enjeksiyon hacimleri karşılamak için daha büyük bir periton boşluğuna izin gevşek, ince deri ile elly. Alternatif bir olasılık erkekler tarafından üretilen androjenler rejenerasyon işlemi 17 bir etkiye sahip olmasıdır. Nachtrab ve ark. Androjenlerin etkisi genetik arka plan androjen düzeylerini modüle olabileceğini belirten, zorlanma bağımlı olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmada kullanılan TuAB balık genetik arka hafif varyasyonlar erkeklerde görülen değişkenliğin açıklayabilir, ancak muhtemelen androjenler yaralanmaya yanıt olarak heterojenlik katkıda bulunabilir varyasyon ve diğer genetik lokus tek bir yöntem değildir. Ayrıca zebrabalıkları farklı transjenik gentamisin yaralanma farklı yanıt bulmuşlardır. Örneğin, Tg (Lhx1a GFP) Elimizdeki 12 hattı hasarının etkili bir indüksiyon için 120 mg / kg gerekir (veri gösterilmemiştir). Bu gözlemler, aynı cinsiyetten SIB kullanmanın önemini vurgulamakling deneysel değişkenliği en aza indirmek için yaralanma çalışmalarında kontrol eder. Birçok zebrabalıkları transjenik bir transjenin ekspresyonunu başlatmak için bir araç olarak, bir ısı şoku duyarlı bir promoter kullanılır. Zebra balığı poikilothermic ve kendi vücut ısılarını olmadığından, onların çevre sıcaklığında fizyolojik işlevleri gerçekleştirmek zorunda kalıyor. Yenilenmesi yanıtını modüle baskın transgenleri ifade hsp70 promotör kullanılarak deneyler bağlamda, beklenmedik bir şekilde yenilenmesi yanıtı daha yüksek bir sıcaklıkta hızlandırıldı görülmektedir. Bu nedenle, belirli bir sistem içinde yenilenmesi tepkisi üzerine sıcaklığın etkisini belirlemek deneyler zamanlamasını (örneğin yenilenmesi yanıtının tepe yakalama) planlaması için çok önemli hale gelir ve sorunlu, normal sıcaklıklarda rejenerasyonuna karşılaştırma yapar. Transgen indüksiyonu için örnek CreERT kullanılarak ve tamoksifen Diğer uyarılabilir sistemler daha uygun T olabilirYetişkin böbrek rejenerasyon o çalışmaları. Benzer şekilde, olası deneylerin aralığını genişletmek olacaktır bakteriyel nitroredüktaz / metronidazol 18,19 kullanarak bu tür toksik transgenlere veya uyarılabilir yaralanma CreERT aktivasyonu olarak yaralanma indüksiyon yeni genetik yöntemlerin daha iyi neonephrogenesis ve böbrek rejenerasyon anlamak için.

Böbrek vücuttan akışkan homeostazı, kan basıncı düzenleme ve atık, süzme için gereklidir. Memeliler yaralanma farklılaşmış epitel hücreleri 1-4 kullandıktan sonra mevcut nefron onarmak için mümkün olsa da, ayrılmış kök hücrelerin 5 havuzu eksikliği gibi görünüyor ve yeni nefron de novo oluşturmak mümkün değildir. Memelilerde aksine, yetişkin balık yaralanma 6,7 balık büyümesini ve karşılık olarak desteklemek için yetişkin yaşam boyunca yeni nefron oluşturabildiği. Zebra balığı, Danio rerio, organ rejenerasyonu 8-10 çalışma için paha biçilmez bir model organizmadır ve insan böbrekler onarımı mühendislik uygulamaları içine güçlü anlayışlar sağlama potansiyeline sahiptir. Tg (Lhx1a: EGFP) transgen Bununla birlikte, 11, yetişkin zebrabalıkları böbrek 12 yaralanma R + hücrelerinin lhx1a tepkisini kontrol eden mekanizmaların nefron progenitör hücrelerin bir havuz etiket gösterilmiştirbelirsiz Emain. aminoglikozid gentamisin insanlarda 13 bilinen nefrotoksik ve ototoksik etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin intraperitoneal enjeksiyon balık 6 akut böbrek hasarı uyaran bir yöntemdir. Balık taklit Bu yaralanma tübüler epitel ve doz aşımı 14 gentamisin sonra insanlarda meydana glomerül yara kaybı. Gentamisin enjeksiyonu ile Zebra balığı yaralanma uyaran üretilen birçok yeni nefron ile güçlü, senkron rejenerasyon yanıtı uyaran ve aynı zamanda oluşumu, çoğalma ve farklılaşma aşamalarından geçerek geçmeden uygun bir yoldur. Bu protokol aykırı aza indirmek için noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak yetişkin zebrafish böbrek sağlam ve tekrarlanabilir yaralanma için yöntem ayrıntıları. Biz gentamisin ile yaralanma epitel böbrek dokusu ve biçimi ölümüne yol açtığı gerçeğini yararlanmakDaha sonra mezonefrik kanalları ve cloaca kitleler halinde birikir renal tübüler atmalarını, ion. Bu balıklar tarafından iletilir ve su içinde görsel olarak gözlenebilir. Bu bize daha sonra deneyler için toplanmış olabilir güçlü ölümcül olmayan yaralanma ile balık ekrana verir. Onlar deneyin bitiş daha düzgün ve verimli veri toplama ve analizi yol açar ulaşmadan önce ölmek yaralanmamış balık ya da balık sayıları en aza indirilmesi. Buna ek olarak, özel cihazlar veya reaktif akademik veya öğretim ortamında kullanılmak üzere bu yöntem maliyet-etkin ve uygun hale gereklidir. Bizim yöntemi kullanarak, burada böbrek rejenerasyonu üzerine gentamisin dozu artan etkileri yanı sıra artan sıcaklığın etkisini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>gentamicin sodium sulfate</td><td>Sigma</td><td>G1264</td><td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td></tr><tr><td>plastic transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Norm-Ject syringes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72520</td><td>green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately</td></tr><tr><td>30 G1/2 needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>IRRITANT</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Make 4% in 1x PBS for working solution</td></tr></tbody></table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Gentamisin yaralanma suda böbrek epitel atmalarını gözlem (Şekil 1) ile görsel teyit edilebilir. Gentamisin farklı dozajlar rejenere böbrekte lhx1a + hücre agregatları (- D Şekil 1 A) artan sayıları ıle elde edilen yetişkin vahşi tipli TuAB zebrafish zarar için kullanılmıştır. Beyaz yayınları kolayca yaralanma sonrası su 1 gün (- H Şekil 1E) görülebilir. Yüksek dozlarda balık olan atmalarını (Şekil 1I)% 75 üzerinde sonuçlandı ise gentamisin düşük doz, hiçbir yayınları olan çoğu balık sonuçlandı. Tüm gruplarda, atmalarını ile balık seçerken daha yüksek bir ortalama yaralanma seviyesinin (Şekil 1J) sonuçlandı. Yaralanma görsel onaydan sonra, balıklar havuza edilebilir ve daha sonra deneyler (Şekil 2) için kontrol ve tedavi gruplarına ayrıldı. Vahşitip TuAB yetişkin zebrabalıkları bir 80 ile yaralandımg / gentamisin kg doz. Yaralanma bir gün sonra, alçı balık, seçilen bir araya toplanmış ve daha sonra, ısı şoku ve bir ısı şoku gruba ayrılmıştır. Isı şok balık 16 gecede saat ve 28.5 ° C, her gün bir 8 saatlik dinlenme süresi boyunca 37 ° C&#39;de maruz bırakıldı. 4 gün ve 7 gün sonrası yaralanma balıklara in situ hibridizasyon bütün montaj için tespit edildi ve yaralanma seviyesi lhx1a + agrega yoğunluğu ile değerlendirildi. Isı şoku yalnız bir yaralanma yanıt (Şekil 2A, D) üretmek değil, ama ısı şoku hiçbir ısı şoku kontrolleri (Şekil 2B, C, G) ile karşılaştırıldığında yaralı balıklarda yanıtı hızlandırır. 7 gün yaralanma sonrası yaralı gruplar (Şekil E, F, H) arasında anlamlı bir fark artık yoktu. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/51912/51912fig1highres.jpg" /> &lt;strong&gt; Şekil 1: gentamisin ile akut böbrek hasarına yanıt olarak Rejenerasyon doza bağlı (A - D) LHX 1 mRNA ifadesi yeni nefron atalarıdır hücresel agrega, işaretler.. (A) Kontrol ip enjeksiyonu, vahşi tipli TuAB yetişkin zebrabalıkları 7 gün sonra, normal olarak 0-2 LHX 1a + bütün böbrek hücre agregatları sahiptir. (B - D) 7 gün gentamisin enjeksiyon balık ekran birçok LHX 1a + hücresel agrega sonra, sağlam neonephrogenesis.This yanıtı gösteren daha LHX 1 + kümeler halinde ortaya çıkan gentamisin yüksek konsantrasyonlu, doza bağlı. (E - H) gentamisin enjeksiyonundan sonra 1 gün, balık böbrekler ölü epitel dokudan oluşan beyaz atmalarını salgılamak. (E) çeşitli gösteren 12 balık toplam atmalarını koleksiyonuşekil ve boyutlarda. Kırmızımsı-turuncu sindirilmiş tuzlu su karidesi kıyasla yaralanma gösteren beyaz atmalarını arasındaki farka dikkat edin. (F - H), yerleşmek için tanktaki su sağlayan çökeltileri dışarı pipetle ve mikroskop altında gözlemleyerek 1 gün yaralanma sonrası bireysel balık toplanan atmalarını örnekleri. 40 mg / kg dozu ile muamele edilmiş bir balıktan bir yaralanma gösteren bir kalıba (F) dışkı. (G) Orta 60 mg / kg dozu ile muamele edilmiş bir balıktan yaralanma gösteren döküntülerinin boyuttadır. (H) ek sloughed doku 80 mg / kg dozu ile tedavi edilen bir balık yaralanma belirtilerek Büyük kalıplar. (I) çarpıtmalarını yaralandı balık oranı 60 mg / kg ile 80 mg / kg artar. 7 gün sonra (J), balık yaralanma değerlendirmek için in situ hibridizasyon bütün montaj için işlendi enjekte etti. Lhx1a + agrega geniş po alınan tek 5x resimde sayıldıHer böbrek ve böbrek alanının int ImageJ kullanılarak ölçüldü. Agregaların ortalama sayısı / mm 2 &#39;, her bir doz için gösterilmiştir. Her iki durumda da, alçı balık Her bir doz toplam grubundan daha yüksek bir ortalama vardı. 80 mg / kg ile karşılaştırıldığında p &lt;0.5 40 mg / kg&#39;dır. AD = 0.2 mm Ölçek çubuğu, E = 1 mm, FH = 2mm. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51912/51912fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Atmalarını ile sıcaklık bağımlı rejenerasyon gentamisin enjeksiyondan sonra 24 saat, yaralı vahşi tip TuAB yetişkin zebrabalıkları toplanmış ve daha sonra bir ısı şoku grubu ve bir ısı şoku gruba ayrıldı. Balık, her gün boyunca 28.5 ° C&#39;de 16 saatlik bir gece boyunca 37 ° C&#39;de daha sonra 8 saat dinlenme periyodu ile her gece tutuldu. (A, D) Kontrol ısı şokundan sonra lhx1a ifade vermedi balık yara almadan kurtuldu. (B, C) ​​ısı SHock fazla kümeler zaten yaralı ısı şoku olmadan balık (p &lt;0.5, Student t-testi) ile karşılaştırıldığında yaralanma sonrası 4 gün görünen ile rejenerasyon yanıtı, hızlandırır. 7 gün sonra (E, F), ısı şoku ve ısı şoku ile tedavi yaralı balıklar arasında önemli bir fark yoktur. Mm2 başına lhx1a + agrega sayılarak yaralanma (G, H) belirlenmesi. Her nokta tek bir balık temsil eder. Balık ve ortalama cevap sayısı, her grup, yukarıda belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 0.2 mm.

Watch this Scientific Journal Video about Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury at JoVE.com

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Video: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Gelişim Biyolojisi

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Nörobilim

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biyoloji

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Rejeneratif Kapasitenin Karşılaştırmalı Analizi için Zebra Balığı ve Medaka Kullanan Yetişkin Optik Tektumunun Bıçak Yarası Yaralanma Modeli

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...