This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

NOT: Etik Beyanı: Bütün deneyler, araştırmada hayvan kullanımı için Massachusetts General Hastanesi esaslara uygun olarak yapılmıştır. 1. Ön Hazırlık <ol><li> Kaç yetişkin zebrabalıkları 6-12 aylık yaralama belirleyin. Plan gerekli olacak% 10-20 daha fazla balık yaralama. Değişkenliği en aza indirmek için, kullanımı yaşı kabaca aynı boyutta ve daha az genetik değişkenlik için, aynı tankın birlikte yetiştirilen eş balık eşleşti. Kadın balık nedeniyle karnın geniş kapasiteli, erkek balıkların göre enjekte çok daha kolay. Ancak, erkekler ve dişiler benzer sonuçlar verir. </li><li> İlk kez deney yaparken, balık belirli bir suş için uygun olan gentamisin dozajı belirlemek için bir doz eğri çizilir. Gentamisin saflık partiden partiye değişiklik beri deneylerde kullanılmadan önce gentamisin her yeni toplu test edin. Uygun bir dozaj expressi değerlendirerek belirlenmelidirBöyle lhx1a olarak yaralanma belirteçlerin üzerinde. (- D Şekil 1A bakınız). </li><li> Gentamisin çözüm hazırlayın. Gentamisin stok çözeltisi, -20 ° C&#39;de saklanır ve daha sonraki kullanım için çözülmüş olabilir. Örneğin, 0.5 g ağırlığındaki bir balık, bir 80 mg / kg dozda (vücut ağırlığı 80 mg gentamisin / kg) için, uygun bir çalışma çözeltisi olarak fosfat tamponlu tuzlu su içinde gentamisin 2 mg / ml hazırlar. Bu balıklara intraperitonal enjeksiyon için gentamisin 20 ul içerir. Not: Genellikle, 80-120 mg / kg uygun olabilir, 40 mg / kg kadar düşük iyi sonuçlar fakat dozlar elde edin. Gentamisin ayrıca laboratuvar personeline tehlikeli maruziyeti en aza indirmek için çözelti içinde satın alınabilir. NOT: Yüksek dozlarda Gentamisin toksik olabilir. Eldiven giyin ve toz ağırlığında zaman maske. </li><li> Balık anestezi için% 0.016 tricaine 100 ml su hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C de pH = 7 ve saklamak için ayarlama steril MiliQ suyu içinde çözülmüş tricaine (4 g / 1 L) içindeki bir 25x stok hazırlayın. 4 m seyreltin0.016% bir çalışma konsantrasyonu balık, 100 ml su içinde l. NOT: işlerken Tricaine bir anestezik ve cildi tahriş olduğunu eldiven giyin. </li><li> Bir balık, bir kepçe şekline ampul kesme ve suyun tahliye edilmesi alt 2 yuva keserek plastik bir transfer pipet dışarı kepçe olun. Hazırlanan gentamisin çözeltisi (10 ul geçişleri ile) Yük 1ml şırınga ve bir 30½ G iğne takılır. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Iğne ucu açılı dönük ve şırınga işaretleri ileri ve okunabilir karşı karşıya olduğundan emin olmak için şırınga iğne bükün. Kontrol enjeksiyonları için steril PBS ile bir şırınga ve iğne hazırlar. </li><li> Temiz bir yüzeye sahip bir ölçek hazırlayın ya da balık kurutma ve enjeksiyon için balık tutmak için tekne yanı sıra kağıt havlu tartın. </li><li> Gözlem gecede sonrası enjeksiyon için balık tutmak için kapaklı bireysel küçük yarım litrelik kapları hazırlayın. Küçük şeffaf plastik birleşme kafesleri, bu amaç için yararlıdır. Bunlarkonteynerler beyaz olmamalı - balık döken beyaz epitel yayınları siyah tezgah üstünde görülebilir, böylece ideal onlar açık olmalıdır. Balık rahat yüzmek için yeterli balık suyu ile her doldurun. </li></ol> Gentamisin 2. intraperitoneal enjeksiyon <ol><li> Balık su içinde% 0.016 tricaine çözeltisi içinde balık anestezisi. Yavaş solungaç havalandırma oranı ve artık dokunmak yanıt balık bekleyin. </li><li> Solungaçları veya yüzgeçleri zarar önlemek için kuyruk doğru baş hareket, balık kepçe kullanarak balık kadar Scoop. Yan yavaşça balık çevirerek fazla suyu emer ve kepçe aşırı su sıyrılmaya kağıt havlu üzerine balık yerleştirin. </li><li> Yine balık kadar kepçe ve sıfırlanmış ölçekte tartmak tekne yerleştirin ve balık tartın. En yakın 0.25 g Yuvarlak ve enjekte etmek gentamisin uygun miktarda hesaplar. NOT: 0.5 gr balık için 8 de bir 20 ul enjeksiyon kullanın0 mg / kg doz. </li><li> Yine balık kadar kepçe ve kuru katlanmış kağıt havlu üzerine koyun. Sağ elini kullanan enjekte ise, sol elinde kağıt havlu tutun ve karın kolayca erişilebilir olan balığın baş, solu gösteren yerleştirin. </li><li> Kloakanın için karın cildine, anterior 45 ° açıyla iğne ile şırınga tutun. Derinin hemen altında iğneyi itin, ardından açıyı azaltmak ve iç organları kaçınarak, deri altında ileri iğne kaydırın. Daha sonra iğneyi geri çekme, hiçbir sıvı iğne etrafında geliyor emin olmak için duraklatmak, dalgıç uygun miktarda basınız. Balık sabit tutan bir sorun varsa, gövde karşı ayracı dirsekler, onları stabilize etmek. NOT: gentamisin çözüm tutarken eldiven giyin. </li><li> Bağımsız bir kabın her bir balık bırakın. Balık gözlemlemek ve anestezi onun kurtarma sağlamak. 28.5 ° C balık gecede tutun. NOT: Balık hemen canlandırmak etmezse, plastik trans kullanınkendi solungaçları onu canlandırmak genelinde ferin pipet su sulamak için. </li><li> Gentamisin aynı dozda çok balık enjekte ederken, aynı şırınga ve iğne kullanın. Uygun biohazard kesici kabına kullanılan şırınga ve iğne atınız. </li></ol> Yaralanma 3. Mesaj Enjeksiyon Gözlem <ol><li> Ertesi gün (1 gün sonrası yaralanma), karanlık bir yüzeyde kendi kabında enjekte balık yerleştirin. Yaralı balıklar tarafından atılır ölü epitel doku Beyaz yayınları görünür olmalıdır. (- H Şekil 1E bakınız). Hiçbir yayınları, yoksa her iki balık gentamisin enjeksiyonu ile yaralanan olmadı (doz ya da çok düşük, ya da enjeksiyon işlemi sırasında sızan gentamisin bazı) veya balık ciddi üreterler ve kloakanın tam tıkanma sonucu yaralandı sloughed doku ile. NOT: Balık genellikle 2-3 gün içinde ölecek olan vücuttan atmalarını temizlemek değiştiremiyor ve uzun süre bu nedenle kullanılamaz isetahlilleri. Hiçbir yayınları görünmüyorsa, solungaç hareketi durduktan sonra en az 10 dakika süreyle daldırarak tricaine suda balık euthanize. </li><li> Beyaz doku yayınları görünür durumdaysa, bir kenara balık ayarlamak ve diğer balık denetimi devam edin. Gentamisin Uygun bir doz kullanılabilir olan balık% 80-90 neden olur. Yaralı balık havuzu ve daha sonra istenirse farklı tedavi grupları bölebilirsiniz. </li></ol> Kurtarma Balık 4. Bakım <ol><li> Temiz su ve uncrowded ortamda balık tutmak. Kirli su ve kalabalık enfeksiyonları ve istenmeyen ölüme yol açacaktır. Mümkünse günlük su en fazla 6 balık / balık suyu 500 ml tutmak ve değiştirmeye çalışın. NOT: Bu alan korunması için ya da araştırmacı pahalı ilaç tedavileri kullanarak deneyler yapmak isterse asgari birimdir. </li><li> 3 gün yaralanma sonrası kadar balık yem etmeyin. Kurtarma balıklar ilk yemek olmaz ve tank içinde herhangi bir gıda ayrıştırmak ve bakteri gr teşvik edeceğizowth. 3 gün sonra, hasardan başlayarak, günde bir kez az miktarda beslenir. </li></ol> Yaralı Böbrekler 5. Analizi <ol><li> Lhx1a mRNA ifadesi için in situ hibridizasyon için, böbrekler istenilen zaman noktalarında balık hasat edilebilir. Gill hareketi duruncaya kadar buz üzerinde tricaine su içinde en az 10 dakika balık Euthanize, daha sonra, bir tıraş bıçağı ile baş kaldırmak ve vücut boşluğu açmak ve forseps ile iç organları çıkarın. </li><li> Yer (dorsal vücut duvara bağlı pigmentli organı) olarak böbrek bırakın ve geceleme PBS içinde% 4 paraformaldehid balık düzeltin. Böbrek 15 inceleyin ve in situ hibridizasyon standart devam edin. <ol><li> Kısaca, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile PBST içinde proteinaz K (10 ug / ml) ile geçirgen PBST (Fosfat tamponlu tuzlu su,% 0.5 Tween 20) ile, böbrekler yıkayın. % 4 paraformaldehid ile Post-düzeltmek ve PBST ile tekrar yıkanır. </li><li> Sonra 68 gece boyunca böbrekleri öncesi melezleşmeHibridizasyon tamponu (% 50 formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml tRNA,% 0.1 Tween20, pH 6.0) ° C&#39;dir. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde digoksigenin işaretli prob ile inkübe edin, daha sonra 68 ° C&#39;de,% 100,% 75,% 50,% 25 hibritleme tamponu ile 5-10 dakika süreyle, her yıkama, daha sonra oda sıcaklığına kadar taşınır ve 30 dakika ile iki kez yıkayın 2x% 0.1 Tween20 ile SSC ve% 0.1 Tween20 ile 0.2X SSC ile 30 dakika boyunca iki kez yıkanır. </li><li> MAB örnek 3x 5 dk (0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) ve% 10 keçi serumu ile MAB 4 ° C&#39;de gece boyunca bloke dengelenmesi. Sonra, anti-digoksijenin-AP Fab 1 gecede örnekleri inkübe: 5,000 MAB. </li><li> MAB 1 saat boyunca Örnek 5x yıkayın ve NTMT 15 dakika boyunca (0.1 M Tris pH 9.5, 0.05 M MgCI2, 0.01 M NaCI, 50 ul Tween 20) için 3 kez dengelenmesi. </li><li> Ardından sinyali tespit etmek NBT / BCIP ile böbreklerin davranın. % 4 paraformaldehit ile böbrekler düzeltmek ve remo dimetilformamid kuluçkalanmıştıriyonu giderilmiş su içinde gece boyunca ağartılmış NBT / BCIP, fazla ve. Böbrekler yıkanır ve daha sonra bir lamel altında% 50 gliserol ile PBST içinde fotoğraf. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+proximal+tubule+does+not+involve+specialized+progenitors.">Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).</li><li>Guo, J. K., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+maintenance+and+repair+of+the+kidney.">Cellular maintenance and repair of the kidney.</a> Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).</li><li>Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration:+common+themes+from+the+embryo+to+the+adult.">Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult.</a> Pediatr Nephrol. , (2013).</li><li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell.">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li><li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development.">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Dev Biol. 320, 161-174 (2008).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish.">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day.">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li><li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

zebra balığı yetişkin mezonefrik böbrek 6 dahil olmak üzere yetişkinlerdeki organların rejenerasyonu çalışmak için idealdir. Son çalışmalar daha nefron rejenerasyon sırasında meydana gelen adımları tanımlamak için moleküler belirteçlerin ve yeni transgenik muhabiri hatları avantaj almış ve 7,12 sorumlu neler hücreler olabilir. Idrar atmalarını Gözlem insanlarda 16 böbrek hastalığı teşhis etmek için bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Bu...

Böbrek vücuttan akışkan homeostazı, kan basıncı düzenleme ve atık, süzme için gereklidir. Memeliler yaralanma farklılaşmış epitel hücreleri 1-4 kullandıktan sonra mevcut nefron onarmak için mümkün olsa da, ayrılmış kök hücrelerin 5 havuzu eksikliği gibi görünüyor ve yeni nefron de novo oluşturmak mümkün değildir. Memelilerde aksine, yetişkin balık yaralanma 6,7 balık büyümesini ve karşılık olarak desteklemek için yetişkin yaşam boyunca yeni nefron oluşturabildiği. Zebra balığı, Danio rerio, organ rejenerasyonu 8-10 çalışma için paha biçilmez bir model organizmadır ve insan böbrekler onarımı mühendislik uygulamaları içine güçlü anlayışlar sağlama potansiyeline sahiptir. Tg (Lhx1a: EGFP) transgen Bununla birlikte, 11, yetişkin zebrabalıkları böbrek 12 yaralanma R + hücrelerinin lhx1a tepkisini kontrol eden mekanizmaların nefron progenitör hücrelerin bir havuz etiket gösterilmiştirbelirsiz Emain. aminoglikozid gentamisin insanlarda 13 bilinen nefrotoksik ve ototoksik etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin intraperitoneal enjeksiyon balık 6 akut böbrek hasarı uyaran bir yöntemdir. Balık taklit Bu yaralanma tübüler epitel ve doz aşımı 14 gentamisin sonra insanlarda meydana glomerül yara kaybı. Gentamisin enjeksiyonu ile Zebra balığı yaralanma uyaran üretilen birçok yeni nefron ile güçlü, senkron rejenerasyon yanıtı uyaran ve aynı zamanda oluşumu, çoğalma ve farklılaşma aşamalarından geçerek geçmeden uygun bir yoldur. Bu protokol aykırı aza indirmek için noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak yetişkin zebrafish böbrek sağlam ve tekrarlanabilir yaralanma için yöntem ayrıntıları. Biz gentamisin ile yaralanma epitel böbrek dokusu ve biçimi ölümüne yol açtığı gerçeğini yararlanmakDaha sonra mezonefrik kanalları ve cloaca kitleler halinde birikir renal tübüler atmalarını, ion. Bu balıklar tarafından iletilir ve su içinde görsel olarak gözlenebilir. Bu bize daha sonra deneyler için toplanmış olabilir güçlü ölümcül olmayan yaralanma ile balık ekrana verir. Onlar deneyin bitiş daha düzgün ve verimli veri toplama ve analizi yol açar ulaşmadan önce ölmek yaralanmamış balık ya da balık sayıları en aza indirilmesi. Buna ek olarak, özel cihazlar veya reaktif akademik veya öğretim ortamında kullanılmak üzere bu yöntem maliyet-etkin ve uygun hale gereklidir. Bizim yöntemi kullanarak, burada böbrek rejenerasyonu üzerine gentamisin dozu artan etkileri yanı sıra artan sıcaklığın etkisini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin sodium sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1264</td>
			<td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic transfer pipets</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 ml Norm-Ject syringes</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72520</td>
			<td>green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30G1/2 needles</td>
			<td style="width:101px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td>Make 4% in 1xPBS for working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Gentamisin yaralanma suda böbrek epitel atmalarını gözlem (Şekil 1) ile görsel teyit edilebilir. Gentamisin farklı dozajlar rejenere böbrekte lhx1a + hücre agregatları (- D Şekil 1 A) artan sayıları ıle elde edilen yetişkin vahşi tipli TuAB zebrafish zarar için kullanılmıştır. Beyaz yayınları kolayca yaralanma sonrası su 1 gün (- H Şekil 1E) görülebilir. Yüksek dozlarda balık olan atmalarını (Şekil 1I)% 75 üzer...

Watch this Scientific Journal Video about Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury at JoVE.com

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Video: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Gelişim Biyolojisi

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...