Biz, onun metilselüloz tarifi paylaşımı için yararlı AKI biyoloji ve zebrafish teknikleri tartışmaları ve C. Diep için Wingert laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca, Zebra balığı koloni için mükemmel devam eden hayvancılık bakım sağlamak için Zebra balığı Araştırma Notre Dame Merkezi personeli için şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz. Notre Dame Üniversitesi&#39;nden start-up finansman NIH-NIDDK hibe DK083512 ve cömert bir laboratuar, fon, bu çalışmaları destekledi.

1. Mikroenjeksiyon işlemi zebrafish etiket proksimal tübül epitel pronephros Bu işlem için, biz olduğu bir hava kompresörü (Haz-Air, Model 6-4) ve mikromanipülatör aparat (Narishege parçalar MN151, IP3 ve GJI) tarafından sağlanan basınçlı hava ile mikroenjeksiyon sistemi (Harvard Appartus, PLI90) üreticinin talimatına göre stereomikroskopta istasyonu (Nikon SMZ-Zoom 645) toplandı. Dextran&#39;ın konjugatları kolayca bu epitel hücre nüfusu 9 tercihli etiketleme sağlayarak, nefron proksimal tübül endocytosed. <ol><li> Metilen mavisi maruz kalma yolk kesesi otofloresans önemle ve nefron görselleştirme, daha zor tübüller hale getirir. </li><li> 28.5 döllenmiş embriyolar kaldırın ° C 48-55 saat sonra döllenme (hpf) arasında bir gelişim timepoint. Bu intramüsküler mikroenjeksiyon yapılabilir hangi kolaylığı nedeniyle larva microinjections gerçekleştirmek için ideal bir aşamasıdır ve böbrek fonksiyon çünkü şu anda başlar. </li><li> Bir çift güzel forseps kullanarak herhangi bir çıkmamış zebrafish koryon çıkarın. Koryon enkaz petri ve dolum tabak modifiye E3 çözüm 30 mL ile durulayın. </li><li> Embriyoların bir enjeksiyon tepsi hazırlayın. Bizim tercih enjeksiyon kalıp, üçgen depresyonlar embriyo enjeksiyon için içine yerleştirilmiş olabilir oluşan,% 1.5 &#39;agarose/E3 yapılır. Enjeksiyon kalıp yapmak için,% 1.5 agaroz bir taban ile dolu bir Petri kabındaki kama şeklinde çıkıntılar (daha önce 11 ayrıntılı olarak açıklanmıştır) ile plastik kalıp süzülüyor. </li><li> Zebra balığı Kitap 10 açıklandığı gibi, bir iğne çektirmesi ile kılcal tüpler çekerek cam mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın. Kısacası, kılcal cam tüpler daha sonra stereomicroscope altında iğne ucu izlerken mikroenjeksiyon iğne ucu sivri bir ucu ince metal kesmek için forseps kullanabilir çekin. Petri kaplı kesme ve kesme kenarı korumak ve toz birikmesini önlemek için kil modelleme üzerinde konumlandırılmış iğneler saklayın. </li><li> Proksimal tübül etiket enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Distile su içinde 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon 40 kD dekstran-floresein konjuge (Invitrogen, D1845) eritin. </li><li> Balık uyutmak için% 0.2 Tricaine pH 7,0 5 mL, 30 mL E3 Zebra balığı larvaları içeren petri ekleyin. Artık dokunmatik tepki gösterirler, balık anestezi. Bu balıklar tamamen anestezi ya da enjekte çalışırken üzerine seğirme hayati önem taşımaktadır. </li><li> Anestezi balık, plastik transferi pipetlemeyin kullanarak bir enjeksiyon kalıp tepsiye aktarın. Iyi ve iyi açılı yan gövde boyunca dinlenme olduğu gibi yan üçgen depresyon en derin kısmında baş hayvan yerleştirin. </li><li> Intramüsküler mikroenjeksiyon gerçekleştirin. Dekstran floresein 2-3 mcL bir kesim iğne yerleştirin ve çözüm yaklaşık 1 nL bir gövde hücre gruplarının hayvan enjekte. Amaç, hücre gruplarının üst kısmı için ve yolk sac uzatma kaçının. Bu nefron tübüller mekanik mikroenjeksiyon işlemi tarafından kesintiye olduğunu sağlar. </li><li> Enjekte zebrafish temiz bir petri kabına aktarın ve modifiye E3 çözüm ekleyin. Tricaine tüm izlerini kaldırmak için taze E3 hayvanlar 3 kez durulayın. Dekstran ışık koruma sağlar ve bir gecede 28 ° C inkübatör hayvanların dönmek için alüminyum folyo ile petri kapağını örtün. </li></ol> 2. Proksimal tübül hücrelerinin Hedeflenen lazer ablasyon Bu işlem için, Epifloresans ile stereomikroskopta dekstran floresein parlak etiketli proksimal tübüller hayvan skoru ve lazer ablasyon için bu seçmek için kullanın. Sonra, bir bileşik mikroskop (Nikon Eclipse 80i epifluorescent eki ile) bağlı kullanımı için üreticinin talimatına göre kalibre, nefron hücre ablasyon gerçekleştirmek olmuştur darbeli micropoint lazer sistemi (Fotonik Instruments, Inc.) Kullanın . Biz aydınlık ışık altında floresan tübül bölgeleri görmek için araştırmacı sağlayan bir FITC filtresi kullanarak hücre ablasyonu en başarılı oldu. Bu prosedür öncesinde,% 1,5% 0,02 tricaine/E3 metilselüloz eriterek ablasyon için immobilizasyon medya hazırlar. Oda sıcaklığında hemen kullanımı için metilselüloz Mağaza bölüntülerin veya 4 ° C, uzun süreli depolama için. <ol><li> E3 30 mL Zebra balığı larvaları içeren petri 5 mL% 0.2 Tricaine pH 7.0 ekleyerek 72 hpf zebrafish anestezisi. Artık dokunmatik tepki gösterirler, balık anestezi. Bu balıklar tamamen anestezi ya da lazer ablasyon gerçekleştirmek için çalışırken üzerine seğirme hayati önem taşımaktadır. </li&gt; <li> Enjekte edilen hayvanların uygun floresan ayarı altında inceleyin ve kolayca proksimal tübüller görselleştirmek hangi hayvanlar seçin. </li><li> Tricaine içeren ayrı bir çanak seçilen embriyolar transfer. 30 dakika kadar hücre ablasyon gerçekleştirmeden önce Hayvanlar anestezi olabilir. &gt; 15 hayvanların puan, her bir hücre ablasyon birkaç dakika sürer gibi ablasyon beklerken taze değiştirilmiş E3 içeren ayrı bir kapta bu dönün. </li><li> Ablasyon gerçekleştirmek için, immobilizasyon medya embriyo yıkamak için 2 dakika süreyle% 1.5 methylcellulose/0.02% tricaine içeren küçük bir petri bir anestezi zebrafish aktarın. </li><li> Sonra, bir damla% 1.5 methylcellulose/0.02% tricaine içeren bir cam depresyon slayt embriyo transferi. Ventral tarafta slayt ve dorsal yüzü yukarı bakacak karşı karşıya olduğu gibi ince bir sonda ile hayvan yavaşça yerleştirin. </li><li> Bitişik mikroskop sahnede slayt yerleştirin ve hayvan dorsal tarafına odaklanmak. Ayak pedalına basılarak odak altında nefron hücrelerinin ablasyon gerçekleştirin. Renal epitel hücreleri (Şekil 1A) ablasyon olarak floresan dağılma göreceksiniz. </li><li> Yavaşça sonraki kültür için 12 iyi yemek, iyi bir ablasyon hayvan transfer. Metilselüloz yıkayacak E3 2-3 kez durulayın. </li><li> Enjeksiyondan sonra, istenilen timepoint hayvan yükseltmek ve genç zebrafish embriyolar (Şekil 2) için kurulan histolojik ve moleküler teknikler başına istediğiniz gibi analiz,. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları: Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi veri ablasyon timecourse göstermektedir. Dekstran-konjugatları ile intramüsküler enjeksiyondan sonra, proksimal tübül tercihen etiketlenir. Dekstran-FITC enjeksiyon, lazer ablasyon için böbrek etiketlemek için kullanılmış ve ablasyon hayvanlar proksimal tübül nüfus Reimage bir ek timepoint aşağıdaki ablasyon dekstran-rodamin reinjected. İfade analiz teknikleri, in situ hibridizasyon gibi Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi hücre ablasyon tek timepoints değişiklikler, sabit örnekleri analiz etmek için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Lazer ablasyon tübül epitel hızlı rejenerasyon (AA) sırasında hücresel değişikliklerin Timecourse ve ablasyon (3. gün, panel A) Zebra balığı larva proksimal tübüller lazer ablasyon sonraki ya da bir veya üç. gün ablasyon (günde 4 B, panel, gün 7, panel C). (Üst) şemadaki dekstran-FITC (yeşil) ve dekstran-rodamin (kırmızı), nefron konumu ve (alt) kontrolü ve lazer ablasyon (LA) nefron canlı görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: lazer ablasyon gen ekspresyon analizi 3 gün lazer ablasyon sonra, embriyolar Nefron proksimal tübül segmentinde işareti dolambaçlı slc20a1a, transkript algılamak için sabit ve in situ hibridizasyon bütün montaj tarafından işlendi. (A) lazer ablasyon tabi değildi kontrol embriyo, (B) tübül epitel büyük bir streç ablasyon, ve (C) olan bir embriyo tübül epitel kısa bir zaman aralığı ablasyon edildiği bir embriyo. Siyah çizgi referans sağlamak için proksimal tübül miktarını gösteren, mavi çizgiler panelleri M.Ö. lazer ablasyon ölçüde göstermektedir * (ablasyon) kontrol panelleri M.Ö. kontralateral nefron gösterir.

<ol>
	<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure.">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+kidney+development.">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li><li>Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li><li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li><li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair.">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li><li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury.">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Zebra balığı pek çok bilim yönleriyle boyunca yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır, uygulamalar 6 büyüyor. AKI gibi böbrek hastalıkları çalışmada zebrafish model sistem istihdam önemli gözlemler yol açmıştır ve böbrek yaralanması 7,8 incelemek için iyi bir model olmaya devam edecektir. Bir sıralı olmuştur genom ve yerine birçok moleküler protokolleri ile, transgenik modelleri, gen demonte ve misexpression çalışmaları kullanan sofistike zebrafish araştırma gerçekleştirmek için giderek daha kolay hale gelmiştir. Zebra balığı, büyük üretim boyutları ve iyi tanımlanmış bir gelişim evreleri ile kısa bir yaşam döngüsü vardır. Ayrıca, organizmanın diseksiyonu olmadan zebrafish embriyonik ve larva aşamaları görüntüleme çalışmaları mümkün kılan büyük ölçüde şeffaf. Embriyonik ve larva aşamaları boyunca, Zebra balığı, bu gelişim timepoints sırasında görünür kalmasını iki nefron, oluşan bir pronephric böbrek vardır. Zebra balığı pronephric nefron 4,5 akut böbrek yetmezliği çalışmaları için iyi bir model, memeli meslektaşları yapısı ve fonksiyonu ile benzerdir. Böbrek, vücut sıvı metabolik atıkların temizler organı olarak hizmet veren, insan ve diğer omurgalıların hayatta kalması için çok önemlidir. Bu temizlik fonksiyonu, böbrek nefron kan filtre ve sonra süzüntü değiştirmek salgılanması için azotlu atıkları toplamak ve aynı anda sıvı ve elektrolit dengesini korumak yeteneğine dayanmaktadır. Nefron bir kanal içine kan filtresi, epitel tübül ve drenaj oluşmaktadır. Üç parça yapısal ve işlevsel bütünlüğü nefron fonksiyon ayrılmaz bir parçasıdır. Nephrotoxins maruz kalma, iskemi veya idrar çıkış yolları tıkanıklığı da dahil olmak üzere böbrek çeşitli hakaretler, AKI 1 neden olabilir. AKI, patoloji genellikle akut tübüler nekroz 1,2 ile ilişkilidir. Klinik çalışmalar, takip eden böbrek yetmezliği, böbrek yetmezliği nedeni ve bağlam bağlı olarak,% 7-80 yerden arasında olabilir bir ölüm oranına sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, AKI altında yatan neden hızlı tanı ve ters gittikçe nekrotik nefron tübüller rejenerasyon yoluyla kurtarma ile ilişkilidir. Son kaderi haritalama çalışmaları, hasar nefron tübüller doldurur büyük hücre popülasyonu bitişik, yaralanmamış bir şekilde alanlarda 12 kaynaklanan epitel hücreleri olduğunu göstermiştir . Bu bulgular, böbrek kök / progenitör hücrelerin sürecine katılmak ihtimalini ortadan kalkmaz ve bağımsız raporlar kemik iliği kökenli hücreler böbrek rejenerasyon 13 katkıda bulunabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bu, devam eden soruşturma renal epitelyal rejenerasyon hücresel kaynakları daha iyi çözmek için gerekli olduğu açıktır. Nefron yenilenme ve geliştirme payı mezenkimal ve epitelyal fenotipleri arasındaki hücresel devlet anahtarları fenomen. Nefron gelişimi sırasında, mezenkimal progenitör hücreler bazal membran bağlama, tübüler epitelyum 3 oluşturmak için sabit bir fenotip farklılaşırlar. Akut böbrek yetmezliği epitel hücreleri speküle göç fenomeni mezenkimal fenotip içine dediferansiyonunu gerektirir. İlginçtir, son yıllarda yapılan çalışmalarda, hasarlı böbreklerde mezenkimal hücreler, mezenkimal hücre gelişimi 14 sırasında benzer bir ifade profil sergileyen öneririz. Çeşitli raporlar, hücre adezyon molekülleri, matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinleri değişiklikler tespit ettik. Epitel geçiş için önerilen mezenkimal hücreler bazal membran yenilemek ve tübüler epitel faaliyetleri yeniden başlatmak. Bu süreçte önemli olan genlerin belirlenmesi, laboratuar ve diğerleri için bir araştırma konusu olmaya devam ediyor. Bu süreçte en önemli faktörlerden aydınlatmak için çalışma yapılacak kalır, ancak bu alanda önemli bir ilerleme gentamisin etkilerini çalışma habercisi olmuştur. Gentamisin tarafından neden AKI ve böbrek yetmezliği, 15 tıp içinde kullanılan nefrotoksik bileşiklerin yaygınlığı dikkate alındığında, ilgili . Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonlar için bir tedavi olarak kullanılır, aminoglikozidler idaresi olguların% 10-25 oranında akut yaralanma açar. Ilaç birlikte birçok tübüler hücrelerde apoptozis veya nekroz ile sonuçlanan bir bolluk, negatif hücresel etkileri neden olur. Çalışmalar megalin ve endositoz yer. Cubulin oluşturduğu karmaşık bir tercihen bağlamak için ilaç bulduk. Bu moleküller, bu hücrelerin ifade sınırlı olmadığı halde, proksimal tübül epitel hücrelerinde bol miktarda bulunur. Indüksiyon oksidatif stres, vazokonstriktörlere serbest bırakılması, hücresel ATP, hipoksi tükenmesi, fosfolipaz inhibisyonu sonucu hücresel sinyal sayesinde, gentamisin ve benzeri antibiyotikler nedenepitel hücrelerinde apoptozis ve nekroz. Ayrıca, antibiyotikler, glomerüler filtrasyon hızı bir düşüş nefron kan filtresi (glomerulus) mezanjiyal daralma tetikler ve kan dolaşımına filtre böbrek yeteneğini olumsuz yönde değiştirerek. Reaktif oksijen türleri, immünostimulan moleküller ve fosfolipaz aktivasyonu üretim, akut böbrek yetmezliğine yol açan bir felaket patoloji oluşturmak nefron diffüz etkileri vardır. Gentamisin ve benzer antibiyotik çalışmalar var ve böbrek rejenerasyon araştırma için önemli bir araç olmaya devam ederken, bazı sorulara yanıt yararlı olabilir hassas bir eksikliği. Sistemimiz, bu protokolü açıklanan bir lazer ablasyon yöntemi ile birlikte zebrafish kullanarak, böyle kesin bir araştırma aracı ihtiyaca cevap vermektedir. Lazer ablasyon araştırmacılar arasında değişen odak alanlarda böbrek tübül hücre yıkımını uyarmaz, küçük bir rakipsiz hassasiyet ile büyük (50-100) nüfus, (2-3). Bu protokol, tercihen proksimal tübül epitel popülasyonları etiket dekstran-konjugatları maruz kalma, daha önce geliştirilmiş bir yöntem kullanmaktadır. Alternatif olarak, bir veya daha fazla tübül bölgelerde yeşil flüoresan protein ifade transgenik zebrafish hatları kullanılabilir. Örneğin, cadherin17: eGFP transgenik zebrafish (proksimal popülasyonları da olsa zayıf) distal tübül bölgelerde güçlü floresan sergi ve diğer tübül segmentlerinde rejenerasyon çalışmaları 16 için değerli olabilir. Nefron görünürlüğü zaman içinde hücresel değişiklikler zaman atlamalı video kayıt sağlayacaktır. In situ hibridizasyon veya immünohistokimya bütün montaj gibi gen ekspresyon çalışmaları ile birleştiğinde, araştırmacılar zamanla nefron moleküler değişiklikler tespit edebilir. Birlikte ele alındığında, bu tür stratejiler böbrek epitel hücreleri yok edilir sızmak olayların daha dinamik bir anlayış formüle etmeye başlayabilirsiniz. Lazer ablasyon modelinin en önemli uyarı, insan AKI sızmak fizyolojik şartlar kısmi yönlerini özetlemek olabilir. Ani fiziksel hasar ile indüklenen hücre ölümünü farklı hücrelerde nekroz yol açan olayların çağlayan, ve bu farklı mikroçevrelerde gibi humoral faktörler aynı olmayabilir gibi. Ayrıca, böbrek hasarı sırasında apopitozu kanıt var ve bu sonuçları bir lazer ile aşağıdaki hakaret sızmak olmadığını bilinmemektedir. Ancak, sadece hücre kültürü gibi bazı iyi cevaplar son derece kontrollü bir ortamda gerektiren sorular, lazer ablasyon AKI in vivo modelde son derece kontrollü olarak hizmet edeceği bir araçtır . Gibi anlayışlar, büyük olasılıkla diğer renal yaralanmalar hakkında soruşturma uygulanan ve büyük olasılıkla, insanlar daha iyi teşhis oluşturmak için kullanılan temel anlayışlar keşfi teşvik edecek zebrafish böbrek epitel ablasyon çalışmaları topladı.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Embriyo yemekleri </td><td> Şahin </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Enjeksiyon iğne </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrasaf agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (kD) Dextran&#39;ın-floresein </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Plastik transferi pipetlemeyin </td><td> Samco Bilimsel Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilselüloz </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depresyon slayt </td><td> Balıkçı </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-kuyu çanak </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Akut böbrek hasarı (AKI), böbrek fonksiyonunun bozulması, böbrek yetmezliği 1 doruğa saat veya gün bir süre içinde yüksek mortalite oranları ile karakterize edilir. AKI iskemi, ilaç toksisitesi veya obstrüktif yaralanma 1 de dahil olmak üzere bir dizi faktörlerin neden olabilir. Bu sonuçlar sıvı ve elektrolit homeostazı korumak için bir yetersizlik. AKI on yıllar boyunca gözlenen olsa da, etkili klinik tedaviler henüz geliştirilecek. İlgi çekici bir zaman, sadece rudimentally 1,2 karakterize edilmiştir gizemli bir fenomen üzerinde, AKI olan bazı hastalarda böbrek fonksiyonları iyileşir. AKI memeli modelleri kullanarak araştırmalar, iskemik ya da nephrotoxin-yaralanan böbrekler nefron tübüller 1,2, epitel hücre tipleri 3 uzman bölgelerde bir dizi (segment) yapılan böbrek fonksiyonel birimleri epitel hücre ölümü deneyim göstermiştir . Nefron içinde proksimal tübül hücrelerinde, epitelyal hücre ölümü en yüksek düzeydedir. Hücre yıkım dediferansiyonunu, yayılması ve tamamen 1,2 nefron yeniden epitel hücreleri, Çevre göç olduğunu göstermektedir kanıt yoktur. Ancak, yaralanan böbrekler yeniden yetenek insanlar arasında geniş bir varyasyon nedenleri bu olaylar modüle sinyaller arasında değişen renal epitelyal rejenerasyon mekanizmaları hakkında birçok cevapsız sorular var. Larva zebrafish pronephric böbrek 4,5 memeliler dahil olmak üzere yüksek omurgalıların korunmuş nefron oluşan olarak böbrek epitel rejenerasyonu incelemek için mükemmel bir model sağlar. Zebra balığı larvalarının nefron çünkü genç zebrafish 6 göreli şeffaflık floresans teknikleri ile görüntülendi. Böbrekler, hayvan içinde içselleştirilmiş karmaşık sistemlerin yapısal, çünkü bu nefron erişilemez memeli modellerin aksine görüntü hücre ve moleküler değişiklikler, gerçek zamanlı olarak eşsiz bir fırsat sunuyor. Son çalışmalar, aminoglikozid gentamisin AKI ve sonraki böbrek yetmezliği çalışması için toksik bir etken ajan olarak istihdam var: gentamisin ve diğer antibiyotiklere AKI insanlarda neden olduğu gösterilmiştir, ve araştırmacılar zebrafish 7 böbrek hasarı tetiklemek için bu aracı kullanmak için yöntemler formüle sahip , 8. Ancak, Zebra balığı larvaları aminoglikozid toksisitesi etkileri felaket ve öldürücü olan epitelyal rejenerasyon ve fonksiyonu, zaman içinde okuyan bir zorluk sunuyor. Bizim metodumuz zebrafish epitel yaralanma çalışma için yeni bir aracı olarak kullanılması hedeflenen hücre ablasyon sunar. Lazer ablasyon araştırmacılar, hücrelerin sınırlı bir nüfus hücre ölümüne neden yeteneği verir. Hücre Değişen alanları morfolojik konumu, fonksiyonu, hatta belirli bir hücre fenotipi ifade dayanan hedeflenmiş olabilir. Böylece, lazer ablasyon araştırmacıları, çalışma özgüllüğü artacak ve renal epitelyal rejenerasyon mekanizmalarının ışık tutacak yeni ve güçlü bir yaklaşım olabilir. Bu protokol, geniş ilgi bağlamlarda herhangi bir sayıda yaralanma ve rejenerasyon çalışması için zebrafish embriyo diğer organlarda hücre popülasyonlarının hedef uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile ilişkili<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu fenomenin rehberlik mekanizmaları ve sınırlamalar yeterince anlaşılamamıştır rağmen epitel hücre yıkılmasının ardından, nefron, yenilemek için sınırlı bir yeteneği var. Bu video makalede, zebrafish embriyo böbrek böbrek nefron hücrelerinin hedeflenen lazer ablasyon, veya pronephros için bizim teknik açıklar. AKI nefrotoksisite-kaynaklı modelleri tamamlıyor ve böbrek nefron epitel rejenerasyonu ile ilişkili olan hücre ve moleküler değişiklikler yüksek çözünürlüklü bir anlayış kazanmak için yeni bir yöntem kullanılabilir.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

laser-ablation-zebrafish-pronephros-to-study-renal-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Görüntüleme.  University of Notre Dame. Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile ilişkili 1. Bu fenomenin rehberlik mekanizmaları ve sınırlamalar yeterince anlaşılamamıştır rağmen epitel hücre yıkılmasının ardından, nefron, yenilemek için sınırlı bir yeteneği var. Bu video makalede, zebrafish embriyo böbrek böbrek nefron hücrel...

Video: Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikal nöron: Hücre Tabanlı Tedaviler Laboratuvar gelişmeler geçiş

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murin Böbrek Nakli Prosedürü

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...