Biz Sayın Hajime Ichijo yararlı tavsiyelerde video kayıt ve video düzenleme için teşekkür ederim. Ayrıca video kayıt için türlü yardımcısı Drs.Yuji Tsunekawa ve Kaichi Yoshizaki teşekkür ederim. Bu çalışma Genç Bilimci B ve Japonya MEXT öncelik Alanları Moleküler Beyin Bilimi KAKENHI tarafından desteklenmektedir. Biz destek kabul Küresel COE Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu (JST) Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu Evrimsel Bilim ve Teknoloji Japonya MEXT Programı &quot;Küresel Beyin Bilim Temel ve Translasyonel Araştırma Merkezi&quot; ve Çekirdek Araştırma (CREST) .

1. WEC sistemi kurmak <ol><li> Ortak WEC sistemi içinde giriş silikon tüp filtre 0.22 mikron membran). </li><li> O 2 (% 95) ve CO 2 (% 5) içeren bir gaz silindir valfini açın. Otoklava su içeren köpürme şişe ile davul içine gaz karışımı akış. </li><li> Gaz karışımı akışını hacmi 50 cc ayarlayın. </li><li> Dışında bir su şişesi içine silikon tüp izin ve gaz karışımı akışını kontrol yerleştirin. </li><li> 20 dev / dak hızında davul döndürün. </li></ol> 2. Kültür ortamı hazırlanması <ol><li> 37.0 çözülme sıçan hemen santrifüje (IC) serum ° C b). Otoklavlanmış 100 ml beher çözülmüş serum içine ekleyin D-glukoz (2 mg / ml). Kültür orta birincil kültür seviyesi (örneğin, bir başlık kullanarak) hazırlanmalıdır. </li><li> 400 seyreltme: 1 ile serum antibiyotik antimikotik (100X) sıvı ekleyin. </li><li> Kalan izofluran buharlaşacak (sıçanlarda kan toplama sırasında anestezi nedeniyle), oda sıcaklığında (RT) c) 20 dakika serum . </li><li> 0.45 mikron membran filtre kullanılarak kültür ortamı sterilize edin. </li><li> Her kültürün şişe, orta 3,0 ml dökün ve alüminyum folyo kaplı bir silikon fişi ile her şişe üst, mühür (ref 14) d). </li><li> Tyrode en tuzlu e içeren üç ya da dört bertaraf Petri kapları hazırlayın). </li></ol> 3. Anestezi, rahim sıçan ve izolasyon <ol><li> Parenteral veya inhalasyon anesteziklerin derinden zamanlanmış bir gebe sıçan anestezisi. </li><li> % 70 etanol ile anestezi gebe sıçan karın bölgesini temizleyin. </li><li> Forseps ile cilde Pick up ve) büyük makasla f cilt keserek karın duvarı exteriorize. </li><li> Forseps bir çift ile karın duvarı Pick up) torasik düzeyde g büyük makas ile karın duvarı U-şekilli büyük uzunlamasına insizyonlar makyaj. </li><li> Forseps bir çift ile sol tarafına uzak Bear bağırsak ve rahim, yumurtalık bağlı bir ucunu göstermek. </li><li> Forseps bir çift rahim sonuna Pick up ve büyük makas ile rahim ve yumurtalık arasındaki konumunu kesmek. </li><li> Gebe sıçan rahim, rahim diğer sonuna kadar rahim çevresindeki yağ keserek çıkartın. </li><li> Tyrode Kullanıcı tuzlu su içeren Petri rahim aktarın. </li><li> Rahim çıkardıktan sonra anesteziklerin aşırı idaresi veya servikal dislokasyon sıçan Euthanize. </li></ol> 4. Embriyolar rahim çıkarılması <ol><li> Kısaca yıkayın ve Tyrode Kullanıcı salin rahim), ince forseps h bir çift ile ikinci Petri kabı transfer . </li><li> Binoküler mikroskop altında, ince forseps bir çift rahim duvarına pick up ve oftalmik düz makas kullanarak kan damarları ile bağlantı mesometrium karşı tarafında rahim duvarına kesmek. </li><li> Rahim duvarı ve desidua arasında uzaya oftalmik düz makas ucu takın. Rahim duvarına boydan boya antimesometrial kenarı boyunca kesin. </li><li> Mesometrial tarafında desidua ve ince forseps i) iki çift rahim ayrı conceptuses tutam. </li><li> Uygun bir çapa sahip bir steril cam pipet ile üçüncü Petri kabı conceptuses aktarın. </li></ol> 5. Rat embriyoları diseksiyonu <ol><li> Desidua microforceps bir ucu takın ve iki çift forseps ile konseptus etrafında desidua enine bir kesi yapmak. </li><li> Plasenta tarafında desidua forseps ipuçları takın ve üst için desidua iki uzunlamasına insizyonlar yapmak. </li><li> Bu iki çift forseps ile ripping tarafından plasenta tarafında desidua çıkarın. Iki çift forseps ile kalan desidua çıkarın. </li><li> Reichert membranı Alış üzerinde yatay bir kesi yapmak ve anti-plasenta tarafında konseptus membran ayrı. </li><li> Forseps iki çifti ile yolk kesesi embriyo kafa yakın küçük bir delik açın ve oftalmik kavisli makas bir çift ile yolk sac kesme. Büyük kan damarlarının zarar vermemek için çok önemlidir. </li><li> Embriyo başının etrafında yerinde iki çift ince forseps amniyon Pick up ve hafifçe), amniyon h yırtılma yolk kesesi embriyo çekin . Embriyonun vücut midgestation aşamada embriyo için oksijen kaynağı artırmak için yumurta sarısı kesesi dışarı çekilmelidir. </li></ol> 6. Tüm embriyo kültürü <ol><li> Plasenta, yolk kesesi, kalp dayak ve kan dolaşımı durumu zararlar kontrol edin. </li><li> Göbek kordonu uzanan farkında olmak, transfer, steril bir cam pipet ile bir kültür şişe embriyo. Tyrode Kullanıcı tuzlu su kültürü şişeleri üzerinde taşır, mümkün olduğunca az olmalıdır. </li><li> Rotator davul delik olmayan bir silikon fişini çıkartın. WEC sistemi rotator davul dik bir deliği olan bir eklenti ile kültür şişe bağlayın. Rotator davul çok ince bir ekipman olduğundan olumsuz yönde davul tarihinde yürürlüğe koymak için dikkatli olun. Disseke embriyo içeren şişeler tek kültür tek aktarılır; kuluçka ön kapının açılması) kuluçka sıcaklığı önlemek için j azalma minimize edilmelidir. </li><li> Kültür 10 saat sonra, 24 saat sonra (Tablo 1) gaz karışımı akış hacmi 75 cc ve 100 cc kadar varan artış. </li><li> Kültür ortamı, yeni bir kültür ortamı ile taze hazırlanmış şişeye kültürlü embriyo transfer ederek 24 saat etrafında değiştirilmesi gerekir. 34 saat sonra 125 cc akış hacmini artırmak ve 48 saat sonra 150 cc (Tablo 1) </li><li> Bazen, kalp atışı hızı (yani, 120-150/min optimum) sayarak ve kan dolaşımını gözlemleyerek kültürlü embriyoların durumunu kontrol edin. Gerekirse Tyrode Kullanıcı salin embriyoların büyüme yargılamak için Somitlerin sayısını. Normal bir gelişme olarak, bir iki saat hücre gruplarının eklenir. </li><li> WEC bittiğinde, gaz karışımı kaynağı durdurmak ve giriş borusu ve köpürme şişe giriş tüpe geri akışı önlemek için filtre membran kesmek. </li></ol> 7. Notlar <ol class="lalpha"><li> WEC sistem içinde sıcaklığı sürekli 37,0-37,5 ° C tutulur </li><li> Sıçan ve fare embriyoları WEC% 100 sıçan IC serum rutin olarak kullanılan ve kullanımdan önce -20 ° C&#39;de muhafaza edilir. </li><li> Biz sıçan IC serum, izofluran anestezisi sıçan toplanan satın alın. </li><li> Tek kullanımlık şişe Ikemoto Rika da mevcuttur. Şişeler ve silikon fişler otoklava olmalıdır. </li><li> Diseksiyon sırasında embriyoların düşük ya da yüksek ısıda muhafaza WEC sonraki gelişimini etkileyebilir, çünkü embriyo Diseksiyon RT yapılmalıdır. </li><li> Diseksiyon için Araçlar kuru ısı ile sterilize edilir. </li><li> Deri ve karın duvarı, mümkün olduğunca bir çanak içine kılların bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı kesilmesi gerekir. Biz deri kestiğiniz zaman onlara yeni bir çift ile bir çift büyük makas ve forseps değiştirmek ve sırasıyla rahim izole. </li><li> Ipuçları ince forseps kullanılması kesinlikle dokuları incelemek için çok önemlidir. Biz bir taş ve makine yağı ile elle forseps ipuçları keskinleştirmek. </li><li> Biz embriyoların aşırı basıncı önlemek için forseps bir tarafında bir bıçak gibi kullanın. </li><li> WEC sistemi içindeki sıcaklık, tekrar tekrar kapıyı açarak düştüğünde, ışığı açmak için sistem içinde sıcaklıkta tutmaya devam ediyor. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 1, rat embriyo ve kültürlü sıçan embriyolar diseksiyon prosedürleri gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 E12.5 rat embriyo Tüm embriyo kültürü. (A) konseptus gebe sıçan rahim disseke. (B) plasenta tarafında desidua kaldırılması. Reichert membranı (C) Kaldırma. (D) yolk kesesi açılması. (E) WEC başından sonra 6 saat süreyle şişe rat embriyo kültür. (F) sıçan 42 saat için embriyo kültür. d desidua; R Reichert Kullanıcı membran, p, plasenta, ys, yolk kesesi, e, embriyo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 saat </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td><td> 36 saat </td><td> 48 saat </td></tr><tr><td> E12.5 rat embriyo </td><td> % 95, 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 saat) </td><td> % 95 100 cc </td><td> % 95 125 cc (34 saat) </td><td> % 95 150 cc </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Optimal oksijen durumu.

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6::EGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization.">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

Kemirgen WEC başarısı için iki önemli adım vardır. İlk olarak, diseksiyon prosedür değil zarar embriyolar, özellikle kan damarları doğru olmalıdır. İkincisi, oksijen ve besin artık rahim izolasyon sonra plasenta yoluyla sağlanan çünkü prosedürü mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. Bu büyük embriyoları için kritik öneme sahiptir. E12.5 sonra sıçan WEC durumda, biz 30 dakika içinde disseke embriyoların kültürü şişeleri içine aktarmanız gerekir. Biz, h?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td colspan="5"> WEC ayarlama </td></tr><tr><td> WEC sistemi (10-0310) </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Başka bir küçük modeli de mevcuttur. </td></tr><tr><td> Deliksiz Silikon fişi </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz karışımı silindir </td><td> Araç </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> % 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit içeren. Özel sipariş edin. </td></tr><tr><td> Gaz regülatör </td><td> Araç </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 mikron filtre Millex GS </td><td> Araç </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestezi ve rahim izolasyonu </td></tr><tr><td> Büyük makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Bertaraf Petri kabı (90 mm x 15 mm) </td><td> Araç </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Derin tipi bulaşık diseksiyon için iyi. </td></tr><tr><td> İsofluranın </td><td> Reaktif </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Anestezi için </td></tr><tr><td> Pentobarbital sodyum </td><td> Reaktif </td><td> Schering-Plough Hayvan Sağlığı </td><td> - </td><td> Anestezi için </td></tr><tr><td> Tyrode en tuzlu </td><td> Reaktif </td><td> - </td><td> - </td><td> Ref protokole göre. 2. 4 Kaydet ° C </td></tr><tr><td> Zamanlı gebe Sprague-Dawley sıçan </td><td> Hayvan </td><td> Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Kültür ortamı hazırlanması </td></tr><tr><td> Kültür cam şişe </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Bertaraf kültür şişesi </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon fiş ile delik </td><td> Araç </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Alüminyum folyo </td><td> Araç </td><td> Herhangi bir şirket </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Kültürü şişeleri için </td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Silikon fişler </td></tr><tr><td> 0.45 mikron filtre Millex HA </td><td> Araç </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik tüp </td><td> Araç </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml beher </td><td> Araç </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC Serum </td><td> Reaktif </td><td> Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya </td><td> - </td><td> Bakın: Sayın Kunihiko Morisaki TEL: +81- (0) 45-474-9336 Faks: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D-Glukoz (+) </td><td> Reaktif </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-antimyotic sıvı </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Embriyoların diseksiyonu </td></tr><tr><td> Oftalmik düz makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Rahim duvarına kesim için </td></tr><tr><td> Oftalmik kavisli makas </td><td> Araç </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Yolk sac kesim için </td></tr><tr><td> Forseps # 5 </td&gt; <td> Araç </td><td> Dinçlik </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps # 5F </td><td> Araç </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Cam pipet </td><td> Araç </td><td> - </td><td> - </td><td> Pasteur pipeti kullanarak el ile yapılmıştır. </td></tr><tr><td> Otoklav torbası </td><td> Araç </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Cam pipetler </td></tr><tr><td> Binoküler mikroskop </td><td> Araç </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Işık </td><td> Araç </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Petrol taş </td><td> Araç </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Forseps keskinleşmesi için </td></tr><tr><td> Makine yağı </td><td> Araç </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Forseps keskinleşmesi için </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

Tüm embriyo kültürü (WEC) tekniği, Yeni ve arkadaşları tarafından 1950&#39;li yıllarda geliştirilmiş ve gelişim biyolojisi 1 için uygulanan olmuştur . Memeli embriyolarının gelişim ve büyüme plasentanın fonksiyonu üzerine eleştirel bağımlı olmasına rağmen, WEC teknik embriyonik gün (E) 6.5-E12.5 sırasında midgestation aşamalarına karşılık gelen sınırlı dönemlerde kültür fare ve sıçan embriyolar ex vivo durumu sağlar fare veya sıçan 2, 3, 4 E8.5-E14.5. Embriyoların mikroskop altında manipüle edilebilir, çünkü WEC, ince cam kapilerleri kullanarak embriyo alanlarda doğrudan istenen hedef yapabilirsiniz. Bu nedenle, biz postimplanted memeli embriyolarının dinamik gelişim süreçlerini incelemek için istediğiniz zaman kemirgen WEC çok yararlı bir tekniktir. Bugüne kadar, çeşitli WEC sistemleri 1 geliştirilmiştir. Bunların arasında, sırasıyla 1, fare ve sıçan E9.5 ve E11.5, sonra rotator tip şişe kültür sistemi, en popüler ve en uzun vadeli midgestation, yani embriyoların kültürü için uygundur . Bu video protokolde, Yeni ve Cockroft 5, 6 tarafından tasarlanmış orijinal rotator sistemi, zarif bir model kullanılarak E12.5 sonra sıçan WEC standart prosedürler göstermek ve memeli gelişim çalışmaları için WEC tekniğin çeşitli uygulamalarını tanıtmak biyolojisi.

Watch this Scientific Journal Video about The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System at JoVE.com

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin verir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Midgestation aşamaları ile ilgili sınırlı dönemlerinde durum. Bu video protokolde, E12.5 rotator tip şişe kültür sistemi kullanarak sonra sıçan tüm embriyo kültürü standart prosedürleri göstermektedir.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Görüntüleme.  Tohoku University Graduate School of Medicine. Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin verir Ex vivo Midgestation aşamaları ile ilgili sınırlı dönemlerinde durum. Bu video protokolde, E12.5 rotator tip şişe kültür sistemi kullanarak sonra sıçan tüm embriyo kültürü standart prosedürleri göstermektedir.

Video: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Fare Embriyonik Akciğer Kültür, Dallanma Moleküler Mekanizmalar değerlendirin Bir Sistem

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.