Biz Foxp1 için antikorların tür hediye için birçok anlayışlı tartışmalar ve B. Novitch için Sharon övünme teşekkür etmek istiyorum. KCT için Wellcome Trust bir öğrencilik ve Wellcome Trust SRP (Hibe referans numarası 094399/B/10/Z) bir proje hibe tarafından finanse edilen bu çalışma.

1. Gerekli Çözümleri Yap <ol><li> 1 M Fosfat tamponu:. 109.4 g Na 2 HPO 4 ve 32 g NaH 2 PO 4 tartılır H 2 0, karıştırın ve 1 litre toplam hacmi için suda çözülür. </li><li> Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış: 0.1 M Fosfat tamponu, 0.15 M NaCl hazırlayın. PBS 100 ml 10 embriyolardan dilim işlenmesi için yeterli olmalıdır. </li><li> Agaroz: etrafında 70 Isı PBS çözeltisi ° C ve katı düşük ergime sıcaklığına agaroz ekleyin yavaş sürekli karıştırarak ilave ediniz. % 4 arasında bir nihai konsantrasyona (w / v) agaroz için çözelti edin. Bu çözelti 50 ml bir stok edin. Gerekli ° C kadar 48 tutulur bir su banyosunda bu çözümü bırakın. Deneyden sonra kullanılmayan herhangi agaroz çözüm birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Antikor blok çözeltisi: Bir nihai concentr fetal buzağı serumu ve Triton X-100 ekleme% 1 tirme (v / v) fetal buzağı serumu,% 0.1 (v / v) Triton PBS içerisinde X-100. Blok çözelti 10 ml kriyostat bölümlere 5 slaytların immun için yeterli olacaktır. </li><li> Sabitleme: 0.75 mm NaOH,% 4 (w / v) paraformaldehid (DİKKAT) hazırlayın. 70 ile su arasında sabitleştirici ısı gerekli miktar hazırlamak için ° C, istenilen nihai konsantrasyon için konsantre NaOH eklemek katı çözülene kadar paraformaldehid ve karıştırılır. 4 ° C&#39;ye kadar buz üzerinde serin Bu çözeltiye 10 ml embriyo dilimlerin 20 kuyu için yeterli olacaktır. </li><li> Sakaroz Çözüm: 0.1 M fosfat tampon maddesi ihtiva eden bir% 30 (w / v) sakaroz çözeltisi 10 ml hazırlayın. Bu çözeltiye 10 ml embriyo dilimlerin 10 kuyu için yeterli olacaktır. </li><li> % 70 (v / v) etanol. 30 ml su ile birlikte mutlak etanol, 70 ml seyreltin. </li><li> Kültür Ortamı:% 1 tavuk embriyo ekstresi,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.35 L-glutamin,% 0.1 2-mercaptoeth eden bir çözelti hazırlayınanol,% 4 tavuk serumu,% 2 B27 eki ve 100 ng / ml ciliaryneurotrophic büyüme faktörü (CNTF) neurobasal ortam içinde seyreltilmiş tüm; buz üzerinde hazırlanmış ve aynı gün kullanılabilir. Kültür aracı maddesi 10 ml embriyo dilimlerin 20 kuyu için gereklidir. </li></ol> 2. Civciv Embriyo Hazırlık <ol><li> Sıra onlar 15 24 sahnelemeye geliştirmek ° C kadar 38 bir cebri kuvöz yatay uzun tarafı ile tavuklar yumurta döllenmiş. Bu, genellikle inkübasyon yaklaşık 4 gün gerektirir. </li><li> Inkübasyonun ikinci gününde,% 70 etanole batırılmış bir kağıt mendil ile silerek yumurta kabuğu sterilize. Dikkatlice delip 5 ml enjektöre bağlanmış ve albümin 5 ml kaldırmak için 21 gauge iğne kullanılarak yumurta kabuğu düz ucunu. Kabuk açıldığında embriyonun zarar görmemesi Bu uzak kabuk embriyo düşürür. Kuluçka için yumurta dönün ve bir daha 2 gün boyunca bunları tasarlamak. </li><li> Küntleşmiş dumont # 5 forseps c Kullanmaarefully delmek kabuğun üst orta ve kabuk 9 cm yaklaşık 2 çıkarın. Embriyo etrafında kesin ve dikkatli disseksiyon sırasında HBSS içinde embriyo ve yerde çıkarın. Embriyolar Hamburger ve Hamilton (1992), 15 e uygun aşamalı olmalıdır. Kullanılan tüm embriyolar aşama 24 yakın olmalıdır. Anormallik belirtisi gösteren herhangi bir embriyo atılmalıdır. </li><li> Amniyon membran, Chorio-allantoik membranından, kafa ve iki dumont # 5 forseps kullanarak allantoisi çıkarın. Tüm iç organları kaldırmak için embriyo canı çıksın. Bunu yapmak için, mikro diseksiyon makas ile embriyonun ventral orta hat kesip forseps bir çift ile rostral gövde bölgenin etrafında embriyo tutun, bağırsak ve kalp rostral parçası kapmak ve kaudal çekin. Bu temiz bir şekilde yapılır ki önemlidir. Sen embriyo net Somitlerin görmek gerekir. Enine torasik vücut Döşeme alt ve üst ekstremite buds.Now arasında ikiye embriyo Cutmikrodisseksiyon makas kullanarak duvar. </li></ol> 3. Embriyo Dilim Hazırlama <ol><li> Su banyosundan agaroz çözüm çıkarın. Bir tek kullanımlık plastik 3 ml Pasteur pipet sol 5 cm kesilir. </li><li> Hafifçe kuru bir Petri kabındaki diseksiyon çözüm ve yer beşiği embriyo dışarı iki forseps kullanarak disseke embriyonun lomber yarısını kaldırın. Pasteur pipeti kullanarak, embriyonun üstünde, agaroz 2 ml civarında pipet yaklaşık 0.5 ml kaldırmak ve sonra pipet içine embriyo dilim kadar emmek. Uzaklıkta plastik kalıp agaroz herhangi kabarcıkları tanıtmak için özen bir soyma embriyo ve agaroz aktarın. Yavaşça aşağı bakacak göğüs bölümü ile plastik kalıp agaroz altına embriyo indirin. Embriyo düz bir 21 gauge iğne kullanıyor yerleştirilmelidir. Dilimler de gelişmekte olan uzvun içerecektir ve önemli olduğunu agar embriyonun yönünüose bu izin verecektir. Agaroz ayarlamak için buz üzerinde tekne yerleştirin. Embriyo bu dönemde (2 dakika civarında) sırasında yönünü değiştirmek değil dikkat edin. </li><li> Leica VT1000S vibratome (Hız 3, Frekans 4, 400 mikron kalınlığında dilimler) HBSS ile dolu dilimleme odası ile kurmak ve buz gibi soğuk su ile çevrili olmalıdır. Agaroz blok sonra süper yapıştırıcı ile vibratome platforma sıkıştı. Agaroz blok çevresindeki agaroz 1-3 mm embriyo parça bırakmak için bir jilet ile kesilmiş. Açık apikal ektodermal rigde ekstremite tomurcuğu bölümleri yer dilimler seçilir ve bu dilimleri ardından HBSS yerleştirilir. Genel olarak, embriyo başına sadece 1-2 uygun dilim vardır. Yavaşça iki iğne kullanılarak doku dilim etrafında agaroz çıkarın. Bu iyice ve dikkatlice yapılması esastır. </li></ol> 4. Ekimi Embriyo Dilimleri <ol><li> Gerektirmeyen için kültür çözeltisi, 500 ml (yukarıda açıklandığı gibi) ekleyin24-iyi ultra düşük eki tedavi doku kültürü plaka kuyu ed sayısı. Kuyuya HBSS çözüm dikkatlice dilimleri aktarın. Genel olarak, biz her iyi iki üç dilim var çalışın. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka yerleştirin. </li></ol> 5. Immün için Dilimler Kesit <ol><li> Kültür döneminin ardından, embriyo dilim her kuyucuğa tamponsuz düzeltmenin 500 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. Toplam çözelti daha sonra dikkatli bir şekilde çıkarılır ve PBS üç yıkamadan 5 dakika aralıklarla ile yerine getirilmektedir. Dilimler daha sonra 6 saat, yaklaşık dilimleri lavabo kadar, 4 ° C de sakaroz çözelti içinde kalır, ancak (örneğin gece boyunca) daha uzun bir süre bırakılabilir. </li><li> 20 ° C&#39;de ilave sakaroz çözeltisini kapalı dilimleri ve dab çıkarın ve yaklaşık 5 dk için yaklaşık 1 ml OCT muvazene Bir uzak soyma OCT-dolu plastik kalıp her dilim düz monte edin.Cihaz monte edildikten sonra, katılaşmaya kuru buz üzerinde dikey kalıpları yerleştirin. </li><li> Kriyostat OCT içine monte blokları ve yaklaşık 20 dakika boyunca -24 ° C&#39;de dengeye blok. Superfrost-Plus slayt üzerine monte 15 mm bölümleri ile her dilim kesin. Ihtiyaç duyulan ° C &#39;ye kadar Slaytlar -80 saklanabilir. </li></ol> 6. İmmünofloresan <ol><li> Odanın alt (biz otoklav bandı ile sabitlenir 1 veya 2 ml plastik pipetler kullanın) kaldırdı slaytlar ile nemlendirilmiş bir odasında düzenlenen yatay slaytlar PBS pipetle 1-2 ml. 20 5 dakika için PBS içinde bölümler inkübe ° C fazla OCT slayttan PBS çözeltisi çıkarın ve bölümleri üzerinden blok çözelti, 500 mL, 20 az 30 dakika inkübe edilir ve çıkarmak için ° C. Blok çözüm çıkarın ve hemen seyreltilmiş primer antikor 500 ml ekleyin ° C 18-22 saat boyunca 4 de inkübe slaytlar ekledi. </li><li> Primer antikor çözüm çıkarın ve hemen oldusaat 20 5 dakika için üç kez 1 ml PBS ile slaytlar ° fazla birincil antikor çözeltisi kaldırmak için C. Bölümler üzerinde seyreltilmiş sekonder antikor, 500 ml ilave edilir. Slaytlar daha sonra 30 dakika boyunca 20 ° C&#39;de bırakılır. İkincil antikor çözeltisi daha sonra çıkarılır ve sürgülü kapağı 20 ° C&#39;de 3 kere PBS ile 5 dakika yıkanır </li><li> Bu yıkamadan sonra, son PBS yıkama, dab aşırı PBS kaldırmak için slayt kenar kaldırmak, slaytlar vectashield iki damla ekleyin ve hafifçe kabarcık oluşumunu engeller, bölümler üzerinde bir cam lamel yatıyordu. Görüntüleme öncesi slayt kenarından blotting tarafından aşırı Vectashield çıkarın. </li></ol> 7. Görüntüleme <ol><li> Görüntü immunohistokimyasal bölümleri. Biz Hamammatsu ORCA ER dijital kamera ve 10 X 20X ve 40 X objektif lens ile donatılmış Nikon Eclipse E80i floresan mikroskop kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+Inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes.</a> Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).</li><li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+Of+Motoneurons+Supplying+Chick+Hind+Limb+Muscles.">Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles.</a> Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).</li><li>Romanes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+motor+pools+of+the+spinal+cord.">The motor pools of the spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).</li><li>Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+repertoires+for+motor+neuron+diversity+and+connectivity+gated+by+a+single+accessory+factor,+FoxP1.">Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1.</a> Cell. 134 (2), 304-316 (2008).</li><li>Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+actions+of+the+forkhead+protein+Foxp1+and+Hox+proteins+in+the+columnar+organization+of+spinal+motor+neurons.">Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons.</a> Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor-neurons+defined+by+expression+of+limhomeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+roles+for+LIM+homeobox+genes+in+directing+the+dorsoventral+trajectory+of+motor+axons+in+the+vertebrate+limb.">Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb.</a> Cell. 102 (2), 161-173 (2000).</li><li>Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins.">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109 (2), 205-216 (2002).</li><li>Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Neuron+Position+and+Topographic+Order+Imposed+by+&#946;-+and+&#947;-Catenin+Activities.">Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by &#946;- and &#947;-Catenin Activities.</a> Cell. 147 (3), 641-652 (2011).</li><li>Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catenin-Dependent+Cadherin+Function+Drives+Divisional+Segregation+of+Spinal+Motor+Neurons.">Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).</li><li>Haase, G., Dessaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+acts+through+PEA3+to+regulate+cell+body+positioning+and+muscle+innervation+of+specific+motor+neuron+pools.">GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).</li><li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices.">Embryo slices.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).</li><li>Hotary, K. B., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+that+guide+sensory+and+motor+neurites+identified+in+an+embryo+slice+preparation.">Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation.</a> Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).</li><li>Krull, C. E., Tosney, K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices+and+strips:+Guidance+and+adhesion+assays+in+the+avian+embryo.">Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo.</a> Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. 87, 97-113 (2008).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+(Reprinted+From+Journal+Of+Morphology,+Vol.+88,+1951).">A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951).</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+progress+in+corticoneurogenesis:+From+silver+impregnation+to+genetic+engineering.">A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering.</a> Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).</li><li>Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+mediate+motor+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).</li><li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse.">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).</li><li>Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Live+Imaging+of+Cell+Behavior+in+the+Developing+Neuroepithelium.">High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium.</a> J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).</li><li>Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-7+and+cadherin-6B+differentially+regulate+the+growth,+branching+and+guidance+of+cranial+motor+axons.">Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons.</a> Development. 137 (5), 805-814 (2010).</li></ol>

Yazarların hiçbiri ilgi veya çıkar çatışması rakip var.

Burada açıklanan protokol, bir tavuk embriyo dilim motor nöronların canlı kalmasını sağlar ve kültür dönemi sırasında göç etmeye devam ederken, birden fazla gün için inkübe edilmesini sağlar. Motor nöronlar canlı tutmak için şartları aydınlatılmasına, biz gerekli bazı temel özellikleri belirledik. O kadar 4% civciv serum motor nöronlar ve farklı türlerden serum ile onun yerine hayatta kalması için kritiktir tolere değil gibi görünüyor. İlginçtir, biz serum yüksek konsantrasyonlarda varlığı, dilim şeklinde brüt bozulmalara yol açan doku büyümesi olarak terfi dilimleri için zararlı olduğunu bulmuşlardır. Daha da önemlisi, cilliary nörotrofik faktörün varlığı da önemli rol oynadı. Bu dilimler hatta omuriliğe duyusal afferent girdi görselleştirme sağlayan, sadece 24 saat çok daha uzun süre kültüre edilmesi mümkün olabilir o ayrı bir olasılık kalıyor. Buna ek olarak, kültürBurada Ture koşulları da gelişmekte olan beyin sapı ve orta beyin / beyincik kültürleri dilim yararlı olabilir. Belki de bu dilim kültür koşullarında kullanımında büyük potansiyel yararı da kalbi olarak embriyo geri kalanı üzerinde olumsuz etkiler, potansiyeli en aza indirgerken, protein fonksiyonu farmakolojik manipülasyon imkanı kolaylaştırmak olduğunu. Farklı sinyal yolunun inhibitörleri ve agonistleri çok sayıda farklı spinal nöronların alt göçü, ayrıca, gelişme sırasında lokal spinal devre oluşumu etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür siRNA&#39;lar ve morfolino oligonükleotid kullanımı yaptığınız gibi protein ekspresyonu bazı genetik tedirginlikler, sadece erken gelişme olarak tanıtılan (ovo elektroporasyon işlemlerinde kısıtlamalar nedeniyle) ve için etkileri sadece son gerçeği muzdarip tim kısa bir süree (genellikle bir gün). Bizim dilim kültürü ileriki aşamalarında başladı ve dilim kültür döneminde etkilerini görmek için dilimleme aşamada sonraki gelişimi bu teknolojiyi kullanma imkanı tanıyor. Kesit kültürü protokolü de hem spinal motor nöron yanı sıra zaman atlamalı video mikroskobu aracılığıyla gerçek zamanlı olarak dorsal interneuron göç görselleştirme izin verebilir. Bu beyaz ışık altında ya da floresan görüntüleme kullanımı ile faz kontrast mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. İkinci teknik sonra kullanılacak olursa floresan etiketler getirilmesi gereklidir. Bu ventrikülden veya nöronların bir alt kümesi içinde floresan proteinleri sürücü yapıları ovo elektroporasyon içinde uzuv veya anterograd etiketlemeden retrograd etiketleme ya üzerinden bu tür Dii veya Dio olarak floresan boyalar tanıtılması yoluyla elde edilebilir.

Normal embriyo gelişimi sırasında, birçok farklı hücre tipleri geldikleri noktadan onlar sonunda olgun organizmada işleyecektir nereye göç gereken oluşturulur. Gelişmekte olan spinal kord içinde, öncü hücreler orta hatta ventriküler bölgesinde bulunan ve duyusal işleme ve motor çıkışları 1 için gerekli işlevsel nöral devrelerin entegre geçirmek gerekir postmitotik nöronlar ve glial hücrelerin birçok alt tipi oluşturmak vardır. Ekstremite kaslarının kasılması kontrol Spinal motor nöronlar kapsamlı araştırmalar yapılmış ve çok onların farklı alt oluşumunu tahrik molekülleri ve mekanizmaları bilinmektedir. Ancak, daha az motor nöronlar, göç ayırma ve sinaptik girişleri almak hangi mekanizmaların bilinmektedir. Motor nöron alt kimlik hiyerarşik bir biçimde gelişimi sırasında elde edilir. Motor nöron alt kabaca i kabul edilebilirnto farklı sütunlar, onların akson projeksiyonları tarafından tanımlanır bölünmeler ve havuzlar. Eksenel, visseral veya ekstremite kasları birine Motor sütunları projesi aksonlar. Motor bölünmeler ventral veya dorsal kaslara 2 projelendirme bu içine yanal motorlu sütun (LMC) ve motor nöronları projelendirme uzuv ayırabiliriz. Bölünmeler içinde, motor nöron kümeleri ekstremite 2, 3 bireysel kasları için motor havuzu projesi adlandırılır. Bölünmüş kimlik Homeodomain transkripsiyon faktörleri Islet-1 (ventral öngörülmesi) ya da LHX-1 (dorsal olarak çıkıntı) 6 ifade ile karakterizedir Bacak verme motor nöronları, transkripsiyon faktörü Foxp1 4, 5 onların ifade ile tanımlanır. Gerçekten de, LHX-1 ekspresyonu, motor nöronlarının 7 uygun dorsal projeksiyonlar için gereklidir. Bu ayrımlardan Her omurilik içinde farklı mevkilere; ventral çıkıntılı motor nöronlar dorsal projecti medial ikamet gelmekng motor nöronlar. LMC Bu sonuçlar sözde LMCmedial (LMCm) ve LMClateral (LMCl) bölüme ayrılmış olan. Tümen ve motor havuzu organizasyonu iki aşamada 8 kazanılır. İlk aşamada, tümen segregasyon yanal moda medial karakteristik motor nöronların bir göç yoluyla elde edilir. LMCl hücreler LMCl nihai oturması konumu elde etmek için LMCm boyunca göç böylece LMCm hücreleri ve sonra üretilir. İkinci aşamada motor nöronların bir dorsal-ventral sıralama yoluyla, muhtemelen motor nöron havuzlarında bir bölünme ve kümeler içlerindeki motor nöronları alır. Katenin bağımlı klasik kaderin ailesinin üyeleri motor nöron organizasyonu 8-10 her iki aşamasında çok önemli olduğu gösterilmiştir. Ancak, kaderin işlevi hücre hareketi nasıl kontrol tam anlaşılamamıştır. Kolumnar, tümen ve havuz kimliklerin edinimi ekstrinsik sinyalleri gerektirir desen intrinsitranskripsiyon faktörleri 11 c ifadesi. Ayrıca, tüm motor nöronların yaklaşık% 50 oranda motor nöron sağkalımı nörotrofik desteği sayesinde, daldan ekstrinsik sinyallerin gerektiren bir süreçtir, normal gelişim sırasında apoptozis ile ölürler. Böylece, motor nöron gelişme nispeten uzun bir timecourse üzerinde muhafaza edilmesi için uygun ortam gerektirir. Bu nedenle, motor nöron hayatta kalma korumak için omurilik kesit kültürlerinde üretme pratik uygun kültür koşulları açıklama gerektirmez. Önceki embriyo kesit kültürlerinde nöronal popülasyonları 12-14 dışsal ilave saflaştırılmış davranış takip için kullanılmıştır. Ancak, dilim kendi içinde in situ motor nöron sağkalım ve göç kolaylaştırmak bizim bilgi kültür koşullarına yayınlanmış değil. Biz saflaştırılmış sağkalım kolaylaştıran bir standart kültür koşulu değiştirilmiş, disosiye kranial motor nöronlar m kolaylaştırmak içinbir embriyo dilim kültürü sistemi içinde otor nöron gelişimi. Biz de kalan motor nöron konumlandırma izlenmekte ve motor nöron bölünmeler çoğunlukla normal pozisyonları kültür dönemi süresince edinilen olduğunu göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Yumurta </td><td> Henry Stewart Çiftlik, İngiltere </td><td></td><td> Döllenmiş Kahverengi Bovan Altın Tavuk yumurtası (Henry Stewart Çiftlikler, UK), 14 ° C&#39;de depolanan kadar inkübasyon </td></tr><tr><td> 21 Gauge iğnesi </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml şırınga </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont forseps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro Diseksiyon makas </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (Düz, 3,5) </td></tr><tr><td> Embriyo gömme kalıpları: Peel away kalıpları </td><td> Bilimsel Agar </td><td> G3764 </td><td> Piramidal şekilli 22 mm ile 12 mm </td></tr><tr><td> Süper yapıştırıcı </td><td></td><td></td><td> Güç Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Di-sodyum hidrojen fosfat, mono-hidrat </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Di sodyum hidrojen fosfat mono </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük ergime sıcaklığına agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Hidroksit </td><td> Fluka </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik tek Pasteur pipetler </td><td> ELKAY Hassas laboratuvar sarf </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml </td></tr><tr><td> Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidrojen karbonat </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Tavuk embriyo Özü </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin çözümü </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin çözümü </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Güney Grubu Laboratuvarları </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal orta </td><td> Gibco </td><td> Kedi ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic faktörü (CNTF) </td><td> R ve D Sistemleri </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Chick Serum </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Primer antikor </td><td></td><td></td><td> UCLA Bennett Novitch bir tür hediye olduğunu anti-foxP1 antikorların hariç, Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, satın alındı. Primer antikor dilüsyonları tavşan anti-FoxP1 (1/32000) Fare anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). Idi Tüm antikorlar 4 ° C&#39;de muhafaza edildi </td></tr><tr><td> Sekonder antikorlar </td><td></td><td></td><td> Eşek anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) Jackson Immunoreseach Laboratories Inc Donkey anti-Fare (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donk satıney anti-Tavşan (Alexa Fluor 594) (1:1000) Invitrogen satın Tüm antikorlar 4 ° C&#39;de muhafaza edildi </td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Corning COSTAR </td><td> 3473 </td><td> ultra eki 24-plaka </td></tr><tr><td> Ekim </td><td> Doku Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Optimum Kesme Sıcaklık </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield floresan montaj orta </td></tr><tr><td> Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> Superfrost-Artı pozitif yüklü slaytlar, 25 x 75 x 1.0 mm </td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25X60 mm </td></tr><tr><td> Taslak inkübatör Zorla: </td><td> Lyon Elektrik Şirketi </td><td></td><td> 38 ° C&#39;de muhafaza her zaman yeterli su seviyeleri sağlayarak nemli tutulması </td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Brite, Huntingdon, İngiltere </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Doku Kültürü İnkübatör </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C,% 5 CO2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i floresan mikroskop </td></tr><tr><td> Dijital Kamera </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M ve Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

Dilim kültürleri hem farmakolojik ve gen manipülasyonu yoluyla embriyo gelişiminin manipülasyon kolaylaştırabilir. Bu düşük sistem olarak, sistemik ilaç uygulamaları nedeniyle potansiyel öldürücü yan etkilerin önüne alınabilir. Ancak, kültür koşulları dilim azaltılmış ortamında normal gelişimini devam sağlamalıdır. Biz özellikle spinal motor nöronların olduğunu, omurilik gelişimi üzerine odaklanmıştır. Biz sistematik en spinal motor nöronlarda doğmuştu hangi noktadan tavuk embriyo dilim kültür koşulları değişmiştir. In vivo kıyasla kültür periyodu ve bu motor nöronların hayatta pozisyon sırasında motor nöron sayısı ve türü ölçüldü. Serum türü ve nörotrofik faktörler kültür döneminde istendi bulundu ve en az 24 saat süreyle motor nöronların canlı tutmak ve bu motor nöronlar uygun pozisyonları göç etmelerine izin başardıkomurilik. Biz bu kültürü koşulları ve agaroz gömülü parçalanmış tavuk embriyoları kullanılarak embriyo dilim kültürü hazırlama metodolojisi sunmak ve vibratome kullanarak dilimlenmiş.

Interneuron ve projeksiyon nöronları gelişimini takip etmek kültürlü dilimlerin kullanımını korteks 16 içindeki örgütlenmenin nesil anlayışımızı ilerlemesinde etkili olmuştur. Spinal kord, motor nöron gelişiminde bütün zebrafish embriyo kültürleri 17 kullanılarak takip edilmiştir. Ancak, zebrafish spinal motor nöron organizasyonu (balık büyük ekstremite kas eksikliği nedeniyle) nispeten basittir. Yüksek omurgalıların gelişimi sırasında spinal motor nöron örgüt hiyerarşisine sürücü moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Yüksek omurgalılarda embriyo dilim kültürlerde nöron hayatta kalması ve hücre gövdesi göç kolaylaştırmak Kültür koşulları dolayısıyla gereklidir. Şu anda, yüksek omurgalılar omurilik dilim kültürleri dilimleri 12-14 üstüne tohum disosiye nöronlar için kullanılmış, dilim periferinde floresan etiketli aksonlar araştırmak18, veya erken spinal kord geliştirme 19 progenitör hücre davranış. Özellikle daha sonra omurilik, motor nöron gelişimi eksik korumak olanlar için kültür koşullarını dilimleyin. Spinal motor nöron, biz motor nöron sağkalım ve nöronların yanal göç yoluyla motorun organizasyonda ilk siparişin edinimi teşvik olabilir çeşitli kültür koşulları araştırılmıştır özellikle o, spinal nöronal gelişimi takip teşebbüs etmek. 20 civciv embriyo omurilik dilimleri aşamadan 18 kullanılarak gerçekleştirilen ilk çalışmalar sonuçsuz kaldı, biz birkaç saat daha uzun motor nöronların hayatta tutmak mümkün değildi ve kültür periyodu (veriler üzerinde LMCl hücrelerinin önemli sayıda üretimi göstermek koyamadık ) gösterilmemiştir. Bu nedenle sahne dilim kültürleri 24 embriyolar, LMCl ve LMCm nöronların çoğunluğu elde edilmiş bir timepoint araştırıldı, ancak LMCl nöron göçü kendi i hala olduğundanfancy (Şekil 1a-c). LMCl nöronların Bu yanal göçü sonra 24 ila 36 saat (Şekil 1 df) etrafında, sahne 27 tarafından büyük ölçüde tamamlandı. Bizim test böylece nöronlar canlı tutmak ve ventral boynuz yanal göç kolaylaştırmak için güçlü olmak için basitleştirilmiş olabilir. Biz veya tavuk serumu veya tavuk embriyo özü olmadan sadece Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi içeren nispeten basit kültür koşulları ile deneyler başladı. Bu dilim içinde LMC nöronlar korumak mümkün olsa da, tüm durumlarda, bu LMCl nöronların muhafaza edilme az sayıda kanıt bulundu (en az LHX-1 ifadesi ile). Ayrıca, bu tür dorsal spinal kord HB9 gibi genlerin uygunsuz ekspresyonu in vivo (veriler gösterilmemiştir) meydana asla bir durum bulundu. Böylece, bu basit kültür koşullarında motor nöron örgütün edinimi soruşturma için uygun değildir. Biz böylece daha karmaşık conditio dışarı aradıns ve bir baz disosiye embriyonik tavuk kranial motor nöronların hayatta kolaylaştırmak için yayınlanmış olan bir formül kullanılır gibi. Bu durum, 20 (neurobasal ortam içinde% 1 piliç embriyo ekstresi,% 1 Pen Strep,% 0.35 L-glutamin,% 0.1 2-merkaptoetanol,% 2 at serumu,% 2 B27 eki ve 50 ng / ml ciliaryneurotrophic büyüme faktörü (CNTF) (burada Guthrie orta denir) daha basit ortamından daha canlı daha motor nöronları tutmak yaptı. Ayrıca, dorsal spinal kord transkripsiyon faktörlerinin sahte ifadesi yol açmamıştır. Ancak, LMCl nöron sağkalım (Şekil 1 gi, zayıftı s). Bu nedenle biz Guthrie, orta, serum kaynaklı yani hayvan serum konsantrasyonu ve ortam içinde CNTF konsantrasyonu önemli etkenler olarak düşünülen arasında değişmektedir. bulduk ki at serumu gelen serum değişen Civciv serum ve 50 ng / ml ila 100 CNTF konsantrasyonunda bir artışa ng / ml esasen t artmışo LMCl ve LMCm hücrelerinin hayatta kalma ve aynı zamanda kültür koşulları 24 saat (Şekil 1 jl, s) üzerinde ventral boynuz geçişini izin verilir. Motor nöronlar, LMCl ve LMCm oranı toplam sayısı, gerçekten de ventral boynuz içine LMCl hücre göçü (Şekil in ovo ziyade, kesit kültürü gelişmesine izin edilmiş embriyoların bölümleri oldukça benzerdir 1 ko, p). Böylece, bu transkripsiyon faktörü ekspresyonu, hücre sayısı ve motor nöronların konumuna dayalı, bizim dilim kültür koşullarında en az 24 saat boyunca normal bir spinal motor nöron gelişimini özetlemek inanıyorum. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Şekil 1. a - c. LMC nesil Durumu (in Foxp1 boyamab) ve LMCl (evre 24. a) LHX-1 boyanması. c İki kanal bir birleştirme olduğunu. Orta hatta bir ve D bir noktalı çizgi olarak gösterilir, V omurilik dorsoventral (D, V) ekseninin yönünü gösterir d -. F. . LMC (d Foxp1 boyanma) ve LMCl (e LHX-1 boyanması) aşamasında 27 de organizasyon Durum f iki kanal bir birleştirme olduğunu g -. I. LHX-1 (g) ve Foxp1 (h) (Guthrie, orta, bizim &quot;başlangıçta orta&quot; referans 20) kranial motor nöron hücre sağkalım destekleyen bir ortamda kültüre bir dilim bölümlerde ifade. Foxp1 ifade ile kanıtlandığı LMC bazı hücrelerin hayatta kalma olmasına rağmen LHX-1 artık, motor nöronlar olarak ifade edilir. (G) içinde D, V, omuriliğin dorsoventral (D, V) ekseninin yönünü göstermektedir. ML s mediyolateral (M, L) ekseni yönü göstermektedirPinal kablosu j - l. LMCl hücreleri (j ventral boynuz içinde LHX-1) ve genel olarak LMC (k Foxp1)% 4 civciv serum ve 100 ng / ml CNTF içeren medyumda kültüre dilimler halinde görülmektedir. Bazı LMCl hücreleri ventral boynuz bir lateral pozisyonda bulunan unutmayın. De ok (j) LMCl Bazı hücrelerin yanal konumu gösterir. (L) iki kanal bir birleştirme olduğu m -. O. L - LHX-1 (m) ve j gösterilen embriyonun dilim kültürü sırasında ovo tutulur bir embriyo bölümlerinde Foxp1 (n) ifadesi durumu. (O) iki kanal bir birleştirme olduğunu. S. LMCl yüzdesi (Foxp1 + ve / Lhx1 + ve) LMC karşı hücreleri (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) farklı koşullar altında kesit kültürlerinde bulunan hücrelerin kantitasyonu covo (ki% 100 temsil) tutulur embriyoların kontrol etmek ompared. Student t-testi *** p &lt;0.01 temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol at JoVE.com

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K Görüntüleme.  University College London. Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.

Video: Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

Sıçanlarda Açık Omurilik Yaralanmalarını Modellemek için Minimal İnvaziv, Hızlı Omurilik Lateral Hemikesim Tekniği

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...