Bu çalışma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri (K25HD097288, R21HD112663) tarafından desteklenmektedir.

Protokol, Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Deneysel hazırlık
<ol><li>Makas ve cımbızı temizlemek ve sterilize etmek için %70 etanol solüsyonu kullanın. Ayrıca, tek kullanımlık pipetler ve bir şırınga hazırlayın.</li>
	<li>495 mL deiyonize suya 3.595 g NaCl ekleyerek bir yıkama ortamı hazırlayın. Daha sonra ortama 5 ml Penisilin-Streptomisin (5 U/mL) ekleyin. 100 mm'lik bir Petri kabını yıkama ortamıyla doldurun ve 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Genel konfigürasyonu gösteren Şekil 1'e göre kültür kapları hazırlayın.<ol><li>Bir parça filtre kağıdı hazırlayın, yaklaşık 17 mm × 20 mm dikdörtgen şeklinde kesin ve dört köşesini çıkarın. Embriyoyu sabitlemek için filtre kağıdında yaklaşık 7 mm × 10 mm boyutlarında içi boş bir merkez oluşturun (Şekil 1, solda). NOT: Embriyoların toplanması 2. adımda açıklanmıştır.</li>
		<li>Esnek bir film (yani parafin filmi) tabakası ile piyasada bulunan bir halkayı (Φ = 1 inç, Malzeme Tablosuna bakın) takın ve esnek filmin de içi boş bir merkeze sahip olduğundan emin olun. Filmli bu halka, filtre kağıdını embriyo ile tutmak için kullanılacaktır.</li>
		<li>Son olarak, hazırlanan halkayı 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1, sağda). NOT: Filtre kağıdı, filtre kağıdını zarın üzerine yerleştirerek ve embriyoyu ortadaki oyuk alanda bırakarak (2. adımda detaylandırılacaktır) ekstrakte edilen embriyoyu sabitlemek ve tutmak içindir. Dört köşe, dış halkanın boyutuna uyacak şekilde kesilmiştir (önceden takılıysa gerekli değildir). Daha iyi lazer ışını yayılımı için 35 mm'lik bir cam tabanlı kültür kabı kullanılır. Çanak, ex ovo kültür için albümin ile doldurulabilen bir iç kuyuya (Φ = 23 mm) sahiptir. Halkanın çapı, iç kuyunun çapından daha büyük olmalıdır, böylece kuyu halka üzerindeki esnek film ile kaplanabilir (Şekil 1, ek). Filtre kağıdının boyutu sınırlı değildir ve seçilen halkanın ve kültür kabının boyutuna göre değiştirilebilir. Alternatif olarak, çanağın tabanı bir agaroz tabakası (kalınlık: ~1 mm) ile önceden kaplanabilir. Bir bıçak kullanarak tabakanın merkezinden agarozu çıkararak, albümin yüklemek için esnek filmin içi boş merkezine benzer bir şekle sahip bir kuyu oluşturulabilir. Kritik bir nokta, içi boş filtre kağıdının dört tarafının, embriyonun tutunmasını sağlamak için yeterli genişliğe (> 5 mm) sahip olması gerektiğidir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tavuk embriyosunun ekstraksiyonu ve ex ovo kültürü
NOT: Bu adım, daha önce yayınlanmış40,41 raporlarından değiştirilmiştir.
<ol><li>Ön kültürden sonra, yumurtayı kuluçka makinesinden alın ve yumurta kartonu tepsisine uzun ekseni üzerine yerleştirin. Yumurta kabuğunu %70 etanol ile temizleyin, tüm yüzeyi kaplayacak şekilde temizleyin ve ardından 15 dakika dinlendirin.</li>
	<li>Yumurtayı kısa ekseninde tutun ve dibinden kırın. Şekil 2'de gösterildiği gibi, içeriğini çıkarmak için yumurtayı 100 mm'lik temiz bir Petri kabının üzerinde açın. Yumurtayı tutarken ve kırarken döndürmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, yaklaşık 10 mL ince albümini (yani sıvı albümin42) ex ovo kültür kullanımı için 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve toplayın. Kültür kabının orta kuyusunu, Şekil 3'te gösterildiği gibi toplanan ince albümin (yaklaşık 0.9 mL) ile doldurun. Doldurma işlemi yavaş olmalı ve kuyu içinde herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemelidir. Albüminli kültür kabının 37 °C'ye ısıtıldığından emin olun. NOT: Bu çanak embriyoyu ex ovo kültürlemek için kullanılacaktır. Brillouin görüntüleme sırasında yıkama ortamı ile doldurulmuş yeni kültür kapları kullanılacaktır (bkz. adım 3).</li>
	<li>Kağıt mendil kullanarak, Şekil 4'te gösterildiği gibi, albümini vitellin zarından dikkatlice ayırarak embriyoya bağlı kalın albümini (yani viskoz albümini) nazikçe çıkarın. Vitellin membranı ile doğrudan temastan kaçının.</li>
	<li>Tüm kalın albümini çıkardıktan sonra, filtre kağıdını vitellin membranına dikkatlice yapıştırın. Embriyonun gövde ekseninin, filtre kağıdındaki merkez dikdörtgenin uzun ekseni ile hizalandığından emin olun. Filtre kağıdını çevreleyen zarı kesmek için makas kullanın.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, izole edilmiş filtre kağıdını yumurta sarısından eğik bir yönde yavaşça çekin. Embriyoyu sırt tarafı aşağı bakacak şekilde konumlandırmak için filtre kağıdını ters çevirin (ters mikroskop konfigürasyonu için). Tüm filtre kağıdını uzun eksenin bir tarafından dikkatlice 100 mm'lik Petri kabına yıkama ortamı eğik bir şekilde daldırın.</li>
	<li>Temiz bir pipet kullanarak yıkama ortamını filtre kağıdına paralel olarak hafifçe püskürterek kalan sarıyı yıkayın. Yıkama ortamını doğrudan membranın üzerine püskürtmekten kaçının.</li>
	<li>Tüm sarıyı temizledikten sonra, filtre kağıdını yıkama ortamından dikkatlice çıkarın ve kenarlardaki fazla ortamı emmek için kağıt mendil kullanın. Ardından, Şekil 5'te gösterildiği gibi, embriyonun sırt tarafının aşağı baktığından emin olarak embriyo ile birlikte filtre kağıdını kültür kabına yerleştirin. Nemi korumak için, tabağa nemli bir kağıt mendil yerleştirin.</li>
	<li>Kültür kabını ex ovo kültür için sahnedeki inkübatöre aktarın.</li>
</ol>3. Embriyonun Brillouin ölçümü
<ol><li>Başka bir kültür kabı seti hazırlayın ve bunları yıkama ortamıyla doldurun. Yıkama ortamının 37 °C'ye ısıtıldığından emin olun.</li>
	<li>Embriyo istenen gelişim aşamasına ulaştığında, filtre kağıdını embriyo ile birlikte yıkama ortamı ile doldurulmuş kültür kabına aktarın. Kültür çanağını Brillouin mikroskobunun sahnedeki inkübatörüne yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).<ol><li>Brillouin ölçümünü yapmadan önce, referans için tüm embriyonun parlak alan görüntüsünü kaydedin. Brillouin mikroskobunun ayrıntılı konfigürasyonu daha önce30 açıklanmıştır ve Sonuçlar bölümünde özetlenmiştir (Şekil 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrasyon işlemi için 4. adımda kullanılacak olan su ve metanolün Brillouin sinyalini ölçün.</li>
	<li>En az 10.000 Brillouin sinyali sayısı elde etmek için gelen lazer gücünü ve elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz (EMCCD, Malzeme Tablosuna bakın) kamera pozlama süresini ayarlayın. Parlak alan görüntüsünü kılavuz olarak kullanarak, tarama aralığını ve adım boyutunu ayarlayın. 2D translasyon aşaması kullanarak embriyoyu tarayarak ilgilenilen bölgenin bir Brillouin görüntüsünü elde edin. NOT: Yatay tarama aralığı, parlak alan görüntüsüne göre belirlenebilir ve dikey (yani derinlik) tarama aralığı, hızlı ve kaba bir taramadan elde edilen sinyal gücüne göre belirlenebilir. Embriyoya herhangi bir foto hasarı önlemek için, gelen gücü 25 mW ile sınırlayın ve EMCCD kameranın pozlama süresini 50 ms olarak ayarlayın. Görüntüleme kalitesini ve çekim süresini dengelemek için yatay yönde 2 μm ve dikey yönde 1 μm'lik bir adım boyutu seçin.</li>
	<li>Taramayı tamamladıktan sonra, filtre kağıdını embriyo ile dikkatlice çıkarın ve fazla yıkama ortamını emmek için kağıt mendil kullanın. Ardından, filtre kağıdını, sahnedeki inkübatörde sürekli kültürleme için ince albüminle dolu kültür kabına geri yerleştirin.</li>
	<li>Embriyo geliştikçe hızlandırılmış Brillouin görüntülerini yakalamak için düzenli zaman aralıklarında (örneğin, 1,5 saat) 3.2-3.5 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>4. adımı izleyerek 2D Brillouin görüntüsünü yeniden oluşturun.</li>
</ol>4. Brillouin görüntü rekonstrüksiyonu
<ol><li>Spektrometre30'un serbest spektral aralığını (FSR) ve piksel-frekans dönüşüm oranını (PR) hesaplamak için Brillouin su ve metanol sinyallerini kullanarak Brillouin spektrometresini kalibre edin. FSR ve PR'nin kalibre edilmiş değerleri, her pikselde embriyonun Brillouin kaymasını hesaplamak için kullanılacaktır. NOT: Şekil 7A , EMCCD kamera tarafından yakalanan ham Brillouin spektrumunu gösterir. Spektrumu dikey olarak toplayarak ve daha sonra bir Lorentz uydurması yaparak, iki noktanın tepe mesafesi Δd elde edilebilir (Şekil 7B). Su Δdsu ve metanol Δdmetanolün tepe mesafesini alarak, FSR ve PR denklemlere göre hesaplanabilir30: PR = 2· (ωmetanol-ω su)/(Δdsu- Δdmetanol) ve FSR = 2·ωsu + PR·Δdsu, suyun bilinen Brillouin kayması ile ωsu = 6.01 GHz ve metanol ωmetanol = 4.49 GHz, 660 nm'de.</li>
	<li>Numunenin her pikselinde Brillouin sinyalinin tepe mesafesini elde edin. Kalibre edilmiş FSR ve PR'ye dayalı olarak Brillouin kaymasını hesaplayın: ωnumune = 0.5 (FSR - PR x Δdnumunesi)30, burada ωnumune , numunenin Brillouin kaymasıdır ve Δdnumunesi , Brillouin sinyalinin tepe mesafesidir.</li>
	<li>2B Brillouin görüntüsünü, tüm piksellerin Brillouin kaymalarına göre yeniden oluşturun. NOT: Yerel analiz yapmak için, elde edilen Brillouin görüntüsünden ilgilenilen bir bölge (örneğin, nöral plaka) seçilebilir ve mekanik özellikleri ölçülebilir. Yaygın bir yaklaşım, seçilen bölgenin ortalama Brillouin kaymasını hesaplamaktır.</li>
</ol>

Civciv Embriyo Gelişiminde Nöral Plaka Mekaniğinin Boylamsal İzlenmesi

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Embriyonun erken gelişimi dış rahatsızlıklardan kolayca etkilenebilir. Bu nedenle, numune ekstraksiyonu ve transferi sırasında çok dikkatli olunmalıdır. Potansiyel bir sorun, embriyonun filtre kağıdından ayrılmasıdır, bu da vitellin zarının büzülmesine yol açabilir ve Brillouin görüntülemede nöral plakanın eğik bir artefaktına neden olabilir. Ayrıca, bu küçülme embriyonun gelişimini durdurabilir. Ayrılmayı önlemek için birkaç kritik adıma dikkat edilmelidir. İlk olarak, adım 2.4't...

Nöral tüp defektleri (NTD'ler), embriyonik gelişim sırasında nöral tüp kapanmasındaki (NTC) başarısızlıkların neden olduğu merkezi sinir sisteminin ciddi doğum kusurlarıdır1. NTD'lerin etiyolojisi karmaşıktır. Çalışmalar, NTC'nin yakınsak uzantı, nöral plakanın bükülmesi (örneğin, apikal daralma), nöral kıvrımın yükseltilmesi ve son olarak nöral kıvrımın yapışması dahil olmak üzere bir dizi morfogenetik süreci içerdiğini göstermiştir. Bu süreçler çoklu moleküler ve genetik mekanizmalar 2,3 tarafından düzenlenir ve bu süreçlerdeki herhangi bir arıza NTD'lere 4,5,6 neden olabilir. Artan kanıtlar, NTC 3,7,8,9,10,11 sırasında mekanik ipuçlarının da çok önemli roller oynadığını ve genler ile mekanik ipuçları 12,13,14 arasında ilişkiler bulunduğunu gösterdiğinden, nörülasyon sırasında doku biyomekaniğinin araştırılması zorunlu hale gelir.
Embriyonik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için lazer ablasyon (LA)15, doku diseksiyonu ve gevşemesi (TDR)16,17, mikropipet aspirasyonu (MA)18, Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) tabanlı nanoindentasyon19, mikroindenterler (MI) ve mikroplakalar (MP)20, optik/manyetik cımbızlı mikro reoloji (MR) 21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştirve damlacık tabanlı sensörler24. Mevcut yöntemler, hücre altından doku ölçeklerine kadar değişen uzamsal çözünürlüklerde mekanik özellikleri ölçebilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu invazivdir, çünkü numune ile temas (örneğin, MA, AFM, MI ve MP), harici malzeme enjeksiyonu (örneğin, MR ve damlacık tabanlı sensörler) veya doku diseksiyonu (örneğin, LA ve TDR). Sonuç olarak, mevcut yöntemlerin nöral plak dokusunun mekanik gelişimini in situ25 izlemesi zordur. Son zamanlarda, yankılanan optik koherens elastografi, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip temassız mekanik haritalama için umut vaat etmektedir26.
Konfokal Brillouin mikroskobu, subselüler çözünürlük 27,28,29,30 ile doku biyomekaniğinin temassız kantitalitesini sağlayan yeni bir optik modalitedir. Brillouin mikroskobu, gelen lazer ışığı ile malzeme içindeki termal dalgalanmaların neden olduğu akustik dalga arasındaki etkileşim olan spontan Brillouin ışık saçılımı ilkesine dayanır. Sonuç olarak, saçılan ışık, denklem31'i takiben Brillouin kayması ωR olarak bilinen bir frekans kayması yaşar:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Burada, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;"> malzemenin kırılma indisi, λ gelen ışığın dalga boyu, M' uzunlamasına modül, ρ kütle yoğunluğu ve θ gelen ışık ile saçılan ışık arasındaki açıdır. Aynı tip biyolojik materyaller için kırılma indisi ve yoğunluk <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;"> oranı yaklaşık olaraksabittir 28,32,33,34,35,36. Bu nedenle, Brillouin kayması, fizyolojik süreçlerdeki göreceli mekanik değişiklikleri tahmin etmek için doğrudan kullanılabilir. Brillouin mikroskobunun fizibilitesi çeşitli biyolojik örneklerde doğrulanmıştır 29,37,38. Son zamanlarda, canlı bir civciv embriyosunun hızlandırılmış mekanik görüntülemesi, bir Brillouin mikroskobu ile sahnede bir inkübasyon sistemi39 birleştirilerek gösterildi. Bu protokol, numune hazırlama, deney uygulaması ve veri işleme ve analizi hakkında ayrıntılı açıklamalar sağlar. Bu çabanın, embriyo gelişimi ve doğum kusurlarında biyomekanik düzenlemeyi incelemek için temassız Brillouin teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D motorized stage&#160;</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillouin Microscope with on-stage incubator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken eggs</td>
			<td>University of Connecticut</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CS2100M-USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>#2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for in ovo culture</td>
			<td>GQF Manufacturing Company Inc.&#160;</td>
			<td>GQF 1502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>Oko labs</td>
			<td>OKO-H301-PRIOR-H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Artman instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3pc Micro Scissors 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>DR Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microdissection Forceps Set&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo

Nöral tüp kapanması (NTC), embriyonik gelişim sırasında kritik bir süreçtir. Bu süreçteki başarısızlık, nöral tüp defektlerine yol açarak konjenital malformasyonlara ve hatta mortaliteye neden olabilir. NTC, genetik, moleküler ve mekanik seviyelerde bir dizi mekanizma içerir. Mekanik düzenleme son yıllarda giderek daha çekici bir konu haline gelse de, 3D embriyonik dokunun yerinde mekanik testini yapmak için uygun teknolojinin bulunmaması nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş durumda. Buna cevaben, tavuk embriyonik dokusunun mekanik özelliklerini temassız ve invaziv olmayan bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Bu, konfokal bir Brillouin mikroskobunun sahnede bir inkübasyon sistemi ile entegre edilmesiyle elde edilir. Doku mekaniğini araştırmak için, önceden kültürlenmiş bir embriyo toplanır ve ex ovo kültür için sahnedeki bir inkübatöre aktarılır. Eşzamanlı olarak, nöral plak dokusunun mekanik görüntüleri, gelişim sırasında farklı zaman noktalarında Brillouin mikroskobu tarafından elde edilir. Bu protokol, numune hazırlama, Brillouin mikroskobu deneylerinin uygulanması ve veri işleme sonrası ve analizinin ayrıntılı açıklamalarını içerir. Bu protokolü izleyerek, araştırmacılar gelişim sırasında embriyonik dokunun mekanik evrimini uzunlamasına inceleyebilirler.

Neural tube defects (NTDs) are severe birth defects of the central nervous system caused by failures in neural tube closure (NTC) during embryonic development1. The etiology of NTDs is complex. Studies have shown that NTC involves a sequence of morphogenetic processes, including convergent extension, bending of the neural plate (e.g., apical constriction), elevating the neural fold, and finally adhesion of the neural fold. These processes are regulated by multiple molecular and genetic mechanisms2,3, and any malfunction in these processes may result in NTDs4,5,6. As mounting evidence suggests that mechanical cues also play crucial roles during NTC3,7,8,9,10,11, and relationships have been found between genes and mechanical cues12,13,14, it becomes imperative to investigate the tissue biomechanics during neurulation.
Several techniques have been developed for measuring the mechanical properties of embryonic tissues, including laser ablation (LA)15, tissue dissection and relaxation (TDR)16,17, micropipette aspiration (MA)18, Atomic Force Microscopy (AFM)-based nanoindentation19, microindenters (MI)&#160;and microplates (MP)20, micro rheology (MR) with optical/magnetic tweezers21,22,23, and droplet-based sensors24. Existing methods can measure mechanical properties at spatial resolutions ranging from subcellular to tissue scales. However, most of these methods are invasive because they require contact with the sample (e.g., MA, AFM, MI, and MP), external material injection (e.g., MR and droplet-based sensors), or tissue dissection (e.g., LA and TDR). As a result, it is challenging for existing methods to monitor the mechanical evolution of neural plate tissue in situ25. Recently, reverberant optical coherence elastography has shown promise for non-contact mechanical mapping with high spatial resolution26.
Confocal Brillouin microscopy is an emerging optical modality that enables non-contact quantification of tissue biomechanics with subcellular resolution27,28,29,30. Brillouin microscopy is based on the principle of spontaneous Brillouin light scattering, which is the interaction between the incident laser light and the acoustic wave induced by thermal fluctuations within the material. Consequently, the scattered light experiences a frequency shift, known as the Brillouin shift &#969;R, following the equation31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (1)
Here, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;" /> is the refractive index of the material,&#160;&#955; is the wavelength of the incident light, M&#39; is the longitudinal modulus, &#961; is the mass density, and &#952; is the angle between the incident light and the scattered light. For the same type of biological materials, the ratio of refractive index and density <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;" /> is approximately constant28,32,33,34,35,36. Thus, the Brillouin shift can be directly used to estimate relative mechanical changes in physiological processes. The feasibility of Brillouin microscopy has been validated in various biological samples29,37,38. Recently, time-lapse mechanical imaging of a live chick embryo was demonstrated by combining a Brillouin microscope with an on-stage incubation system39. This protocol provides detailed descriptions of sample preparation, experiment implementation, and data post-processing and analysis. We hope this effort will facilitate the widespread adoption of non-contact Brillouin technology for studying biomechanical regulation in embryo development and birth defects.

Yazar Spotlight: Brillouin Mikroskobu Kullanılarak Canlı Civciv Embriyolarında Doku Mekaniğinin Temassız Ölçümü

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

The scope of this research is to develop a novel tool that can measure tissue mechanics of a live embryo. Using this tool, we want to understand how tissue mechanics evolves when the embryo is experiencing neuron tube closure. This can help us understand the mechanical regulations in embryonic development.To measure tissue stiffness, current methods such as atomic force microscopy, nanoidention, and micropipette aspiration need to contact sample physically and apply force to deform it. This is highly challenging for measuring tissue mechanics of live embryo in situ. Here, we employed an optical technology named Brillouin microscopy.Compared to other technologies, Brillouin microscopy only uses a focus beam to measure tissue mechanics. Thus, this is a non-contact and a noninvasive method and has some microspatial resolution. This allow us to capture time-lapse mechanical image of a live embryo in situ.In the future, we want to understand the role of tissue mechanics in embryonic development thoroughly. In specific, we want to study how genetic factors, biochemical signaling pathway, and tissue mechanics coordinate with each other in morphogenesis. This could provide us with new insight in the provision of birth disease such as neuron tube defects.

Şekil 6 , Brillouin mikroskobunun şemasını göstermektedir. Sistem, ışık kaynağı olarak 660 nm'lik bir lazer kullanır. Geri yansıyan ışığı reddetmek için lazer kafasının hemen arkasına bir izolatör yerleştirilir ve lazer gücünü ayarlamak için bir nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanılır. Lazer ışınını genişletmek için odak uzaklığı sırasıyla f1 = 16 mm ve f2 = 100 mm olan bir çift lens, L1 ve L2 kullanılır. Polarize ışın ayırıcıdan (PBS) sonra...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo at JoVE.com

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Bu araştırmanın kapsamı, canlı bir embriyonun doku mekaniğini ölçebilen yeni bir araç geliştirmektir. Bu aracı kullanarak, embriyo nöron tüpü kapanması yaşarken doku mekaniğinin nasıl geliştiğini anlamak istiyoruz. Bu, embriyonik gelişimdeki mekanik düzenlemeleri anlamamıza yardımcı olabilir.Doku sertliğini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobu, nanoidasyon ve mikropipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlerin numuneye fiziksel olarak temas etmesi ve deforme etmek için kuvvet uygulaması gerekir. Bu, canlı embriyonun doku mekaniğini yerinde ölçmek için oldukça zordur. Burada Brillouin mikroskobu adı verilen bir optik teknoloji kullandık.Diğer teknolojilerle karşılaştırıldığında, Brillouin mikroskobu doku mekaniğini ölçmek için yalnızca bir odak ışını kullanır. Bu nedenle, bu temassız ve invaziv olmayan bir yöntemdir ve bir miktar mikro-uzamsal çözünürlüğe sahiptir. Bu, canlı bir embriyonun yerinde hızlandırılmış mekanik görüntüsünü yakalamamızı sağlar.Gelecekte, doku mekaniğinin embriyonik gelişimdeki rolünü iyice anlamak istiyoruz. Spesifik olarak, genetik faktörlerin, biyokimyasal sinyal yolunun ve doku mekaniğinin morfogenezde birbirleriyle nasıl koordine olduğunu incelemek istiyoruz. Bu bize nöron tüpü defektleri gibi doğum hastalıklarının sağlanmasında yeni bir bakış açısı sağlayabilir.

monitoring-mechanical-evolution-tissue-during-neural-tube-closure

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

528 Görüntüleme.  Wayne State University. Bu araştırmanın kapsamı, canlı bir embriyonun doku mekaniğini ölçebilen yeni bir araç geliştirmektir. Bu aracı kullanarak, embriyo nöron tüpü kapanması yaşarken doku mekaniğinin nasıl geliştiğini anlamak istiyoruz. Bu, embriyonik gelişimdeki mekanik düzenlemeleri anlamamıza yardımcı olabilir.Doku sertliğini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobu, nanoidasyon ve mikropipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlerin numuneye fiziksel olarak temas etmesi ve deforme et...

Video: Yazar Spotlight: Brillouin Mikroskobu Kullanılarak Canlı Civciv Embriyolarında Doku Mekaniğinin Temassız Ölçümü

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Gelişim Biyolojisi

Experimental Preparation and Ex Ovo Culture of Chicken Embryo for Brillouin Microscopy

To begin, cut the filter paper into a rectangular shape of approximately 17 by 20 millimeters and remove the four corners. Then, create approximately seven by 10 millimeters of hollow center in the filter paper. Attach a commercially available ring to a flexible film layer and create a hollow center in the flexible film layer.Place a prepared ring into a 35-millimeter Petri dish. After pre-culturing, retrieve the egg from the incubator, and place it on its long axis on the egg carton tray. Clean the entire surface of the eggshell with 70%ethanol, and allow it to rest for 15 minutes.Hold the egg on its short axis and crack it at the bottom. Open the egg over a clean 100-millimeter Petri dish to extract its contents. Using a pipette, transfer approximately 10 milliliters of the thin albumin into a 15-milliliter tube for ex ovo culture.Fill the center well of the culture dish with thin albumin. Using tissue paper, gently remove the thick albumin attached to the vitelline membrane of the embryo. Now, carefully affix the filter paper to the vitelline membrane, ensuring the body axis of the embryo aligns with the center rectangle on the filter paper.Cut the membrane surrounding the filter paper with scissors. Using tweezers, gently pull the isolated filter paper away from the yoke in an oblique direction. Flip the filter paper upside down to position the embryo with its dorsal side down.Carefully immerse the entire filter paper from one side of the long axis into the 100-millimeter Petri dish containing wash medium. Using a clean pipette, gently spray the wash medium parallel to the filter paper to remove any residual yolk. Next, carefully remove the filter paper from the wash medium, and use tissue paper to absorb any excess medium from the edges of the embryo.Place the filter paper with the embryo onto the culture dish, ensuring that the dorsal side of the embryo is facing downward. Transfer the culture dish to the onstage incubator for ex ovo culture. Fill the culture dishes with a warm wash medium.When the embryo reaches a desired developmental stage, transfer the filter paper with the embryo to the culture dish filled with a wash medium. Place the culture dish into the onstage incubator of the Brillouin microscope. For the calibration process, measure the Brillouin signal of water.Then, measure the Brillouin signal of methanol. Under bright-field imaging with a four times objective lens, adjust the laser illumination point to the second pair of somites. Then, switch to a 40 times objective lens and perform fine adjustment of the laser point to the middle of the neural tube.Unblock the laser beam and adjust the focal plane. Scan the embryo using a two-dimensional translational stage and acquire a Brillouin image of the region of interest. After completing the scan, carefully remove the filter paper with the embryo.Use tissue paper to absorb any excess wash medium from the embryo. Place the embryo back into the culture dish filled with thin albumin for continuous culturing. For Brillouin image reconstruction, load the water and methanol signal data.Click set region and select the region with four dots for calculating calibration parameters. Save the calibration results. Load the embryo scanning data, and click start for the processing of the parameters.Finally, reconstruct the 2-D Brillouin image based on the Brillouin shifts of all pixels. Brillouin shift in the estimated longitudinal modulus of the neural plate against somite number and incubation time showed an increase in Brillouin shift of the tissue during neural tube closure.