A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Enstitüsü) ve L. Niswander (Colorado-Denver U) laboratuvar laboratuar Biz diseksiyonu ve kültür teknikleri ile yararlı öneriler için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, L. Niswander ve J. Nadeau (Sistem Biyolojisi Enstitüsü) ile işbirliği içinde MER&#39;e JDG ve RO1NS05897 NRSA NS059562 tarafından desteklenmektedir.

1. Kültür ortamının hazırlanması - Tüm reaktifler Tablo 1&#39;de yer alan <ol><li> 37 çözülme erkek sıçan serum ° C </li><li> 30 dakika için 55 sıçan serum Isı İnaktivasyon ° C </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 10K Santrifüj sıçan serum </li><li> Fenol-kırmızı ücretsiz DMEM w / Yüksek Glikoz supernatant ve karıştırın 50:50 çıkarın </li><li> 0.45 um şırınga filtresi kullanarak medya sterilize </li><li> Medya / embriyonun en az 1ml hazırlanmalıdır </li></ol> 2. Hamile baraj rahim izolasyonu <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış prosedürlerini kullanarak, hamile baraj ilk anestezi ve sonra servikal dislokasyon ile sakrifiye </li><li> Karın% 70 EtOH ile sterilize </li><li> Büyük forseps ile sadece meme çizgi üstü, orta hat boyunca küçük bir deri yolu sıkın ve büyük bir makas ile forseps altındaki karın açmak. Herhangi bir iç yapıya zarar vermemek için dikkatli oluns </li><li> Tüm karın açık olduğu için, farenin her iki tarafa doğru ilk açılışında yanal kesmek için makas kullanın. </li><li> Bağırsaklar ve aşırı yağ pedler genellikle rahim belirsiz olabilir ve bu rahim ve yumurtalıkların üst her iki tarafında görülebilir, böylece kenara hareket ettirilmelidir </li><li> Yumurtalıklar altında rahim üst sıkın ve rahim rahim bir ucundan diğer yumurtalık kesme, yağ ayırmak için makas kullanmak </li><li> Petri kabındaki tuzlu su ile forseps ve yeri ile rahim dışına kaldırın </li></ol> 3. Embriyolar rahim çıkarılması <ol><li> Herhangi bir aşırı kan kaldırmak ve dışarıdan herhangi bir aşırı yağ kırpmak için, tuzlu su ile rahim durulayın </li><li> Oda sıcaklığında temiz bir çanak aktarın. Görselleştirme artırmak için tuzlu Tyrodes </li><li> Bir stereomikroskopta kullanarak, dikkatli rahim dışında kabuğu, küçük bir makas ya da gerekli para cezası (# 5) forseps ya kullanarak her bir embriyo ayırın. </li> &lt;li&gt; delmek embriyo dikkatli olmak, rahim duvarı ve desidua arasındaki boşluğa ve rahim duvarına geri kabuğu ince forseps Ekle </li></ol> 4. Embriyolardan desidua kaldırılması <ol><li> Orient desidua karanlık bölümü (plasenta) size dönük olduğunu </li><li> Forseps ile hafif kısmı desidua karanlık bölümünü birbirinden ayıran hat boyunca bir kesi yapmak çok derin kesmek için dikkatli olmak, </li><li> Ectoplacental konisi (EPC) gözyaşı dikkatli olmak, yolk kesesi üst plasenta ayrılması tamamlayın. Bu noktada yolk kesesi Reicherts zarı görselleştirmek için gerekir </li><li> (Hafif kısmını) delmek sarısı kesesi dikkatli olmanın tüm desidua kaldırmak için devam edin </li><li> Yavaşça çimdik ve EPC uzak soyma tarafından Reicherts kaldırmak. EPC hasarlı veya yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal E8.5-E9.5 açmak için başarısız olur </li><liReicherts kaldırıldı&gt; ile embriyo yolk kesesi ile kolayca görülebilir ve sayma somities tarafından sahnelenen olabilir. </li></ol> 5. Kültür sistemi kurmak <ol><li> Bir embriyo, yolk kesesi zarar vermeden pipetlenebilir böylece açılması çapını artırmak için makas ile plastik bir transfer pipet ucu </li><li> Medya embriyo ortalama 1 ml temiz silindir şişe doldurun. 3-6 embriyo en fazla kullanılan silindir şişe türüne bağlı olarak, her bir şişe yüklenebilir. </li><li> Medya dolu silindir şişe kesim pipet kullanarak mümkün olduğunca az Tyrodes olarak üzerinde taşıyan embriyolar olarak medya sulandırmak için aktarma </li><li> Kauçuk, cam rulo şişe üst fişini takın (tapa) </li><li> Böylece sıkı bir mühür, fiş ve tambur arasında oluşan silindir kültür davul içine silindir şişe yerleştirin </li><li> Tüm şişeleri bir kez takıldıktan ve davul herhangi bir boş yuva w mühürlü edilmiştiri. lastik tıpa, rulo etkinleştirin </li><li> CO 2 ve O 2 tank açın ve böylece çıkış vanası saniyede bir kabarcık bırakmadan, yaklaşık 2 psi ayarlayabilirsiniz. E8.5-E10 embriyolar için,% 20 O 2 ve% 5 CO 2 kullanılmalıdır. </li><li> Inkübatör 37 ayarlanmış olduğundan emin olun ° C ve kapağı veya embriyolar ışıktan korumalı olduğu için inkübatör yakın. </li><li> Embriyolar, somities Ayrıca, ilerlemesi dönüm ve nöral tüp kapanması ölçüde onların gelişimini değerlendirmek için periyodik olarak kontrol edilmelidir </li><li> 2-3 saat sonra kültür, medya farmakolojik inhibitörleri ya da diğer tedaviler eklenebilir </li><li> Çalışmanın tasarımı, araç veya çalışma reaktifi inaktif analogları gibi kontroller, içermelidir. </li></ol> 6. Bütün embriyo kültür sonraki gelişimi değerlendirilmesi <ol><li> Gazı kapatın, rulo durdurmak, ve inkübatör şişe kaldırmak </li><li> Transferi embriyolar geri Tyrodestereomicroscope altında değerlendirilmesi için bir Petri kabındaki veya PBS </li><li> Yolk kesesi&gt; 120 dakika başına atışlarda ve dolaşım belirgin olmalı, bir kalp atışı görünür ve kalp hızı olmalı, balon gibi görünmelidir </li><li> Fotoğraf embriyolar önce yolk kesesi kaldırılması için gerekirse </li><li> EPC yakın bir delik kesme ve embriyonun baş ve kıç üzerine yumurta sarısı kesesi ve amniyon saygısız embriyo yolk kesesi çıkarın. </li><li> Yolk kesesi embriyo ayrı kesilmiş göbek kordonu ve yolk kesesi embriyo gerekirse genotipleme için kullanılabilir. </li><li> Hücre gruplarının sayısı ve açık kafatası kıvrımları, yüz ve / veya açık bir kaudal neuropore eksik kapatılması gibi nöral tüp defekti, embriyo inceleyin. Çok morfogenetik değişiklikleri Theiler sınıflandırma (göre sahnelenen Embriyolar olabilir <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">eMap / anasayfa.html http://www.emouseatlas.org/</a> Tekrar), fotoğrafik bir rekorembriyo gelişimi yararlıdır. </li></ol> 7. Notlar <ol><li> Herhangi bir nick veya yolk kesesi gözyaşları başarılı dönüm önlemek ve normal gelişimini engeller, çünkü yüksek kaliteli diseksiyonu esastır. EPC Reichert membran (RM) çıkarılması sırasında zarar ve EPC kısmen de olsa yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal gelişmez. Ancak, RM eksik kaldırma embriyolar veya RM hücreler kültür ortamında büyümek ve yolk kesesi genişlemesi, her ikisi de normal gelişimini önlemek sıkmak birbirine yapışmasına ve / neden olabilir. </li><li> Temiz ve keskin bir forseps, mat ya da katlanmasını forseps prosedür çok daha zor hale getirir, çünkü iyi bir diseksiyon almak için gizli. Enstrümanlar Protein yatakları, doku hasarına yol açacaktır. </li><li> Temiz, steril cam şişeler de embriyolar yan duvarına yapışmasını ve zarar görmesini önlemek için gereklidir. Deney başlamadan önce, şişeler scr olmalıdır, ubbed dH 2 O sabun ve su ile durulanır, ve her şişede su kaynar kadar küçük bir miktar su ile mikro. Şişeler, daha sonra% 70 EtOH ile durulanır ve kuru hava için izin verilir. </li><li> Embriyo kültür ortamları ne kadar erken transfer edilebilir ve 37 ° C daha iyi sağkalım geri ısındı çünkü, mümkün olduğunca çabuk çalışın. </li><li> Her embriyo zaman aynı miktar için herhangi bir embriyonun büyüme farklılıklar yaratarak önlemek için oda sıcaklığında, böylece silindir şişe herhangi bir embriyolar transfer olmadan önce tüm çöp diseksiyon tamamlayın </li><li> Kültürleri bakteriyel kontaminasyonu önlemek için steril bir ortam sağlama. Bizim kültür deneyler antibiyotik yapılır ama bakteri gelişimini engellemek için birçok laboratuvar medya antibiyotik eklemek var. Deneyin başında olduğu gibi orta deney sonunda net olarak görünür. Medya bulutlu haline gelmiştir veya görünür bir çökelti varsa, con muhtemeldir.kültür bulaşmış tamination. </li><li> Etkisiz gaz alışverişi embriyoların gelişimi geciktirebilir, bu nedenle sürekli olarak yayınlanmasını sağlayacak güvenilir bir düzenleyici olduğundan emin olabilirsiniz. </li><li> Embriyolar ex vivo kültür yaklaşık% 50 daha yavaş gelişir, bu nedenle deney tamamlanması için uygun gelişme aşamasına ulaşmış olmasını sağlamak için Somitlerin saymak esastır. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: Embriyoların görünümü öncesi ve sonrası rulo kültürü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Diseksiyon zamanda, embriyolar, kuyruk, baş kıvrımları arkasında bir bütün yolları yapılandırma (Şekil 1A, D) olmalıdır. Kültür ortamında 36 saat sonra, embriyolar kuyruk başın önünde (Şekil 1B, C, E, F) C-eğri, cenin pozisyonunda olduğunu dönüm tamamlanmış olması gerekir. Farmakolojik manipulasyon sırasında yakınsak uzantısı bilinen bir inhibitörü RhoA kinaz inhibitörü (Y-27.632)neurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), embriyo ve rostral-kaudal ekseni boyunca (Şekil 1E, F) kranial sinir kat kapatılması engeller bir kısalma sonuçları. Bizim verilerimiz, kademeli olarak artan dozlarda Y-27.632 kafatası kat kapatılması bozar (Şekil 2A) ve mansap RhoA kafatası neurulation ve yakınsak uzatma sinyali rolü ile tutarlı vücut ekseni (Şekil 2B) kısaltır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Şekil 1 farmakolojik inhibitörü Y-27.632 ile kültürler embriyoların ve manipülasyon görünümü. Önce (A, D) bütün embriyo kültürü E8.5 Dissected embriyolar (B, E) yolk sac rulo kültür 36hrs hala bozulmamış, sonraki E10 Embriyolar. (C, F) yolk kesesi, başarılı torna ve nöral tüp kapanması göstermek için kaldırıldı. Rho kinaz inhibitörü Y-27.632 (E, F) ile tedavi edildi Embriyolar geçmesi ve düzgün yakınsak uzatma göstermek için başarısız oldukısaltılmış bir vücut ekseni. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Şekil 2. kranial nöral tüp kapanması ve eksen uzama RhoA kinaz inhibitörü etkisi. (A) Y-27.632 doz yüzdesi (% NTC = yüzde nöral tüp kapanması) kafatası kıvrımları başarıyla kapatmak için mümkün olan embriyoların karşılaştırıldığında kültür ortamı ekledi. (B) otik vezikül ve ön ayakları arasındaki mesafe, artan dozlarda Y-27.632 (p &lt;.05) önemli ölçüde azalmıştır.

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Embriyo gelişimi sırasında içsel anne, intrauterin faktörler ayrı yetenek embriyogenez tüm aşamalarında eğitim için önemli bir araçtır. İşte biz böylece ilacın anne metabolizma değişken çıkarırken kafatası neurulation ex utero RhoA kinaz küçük bir moleküldür inhibitörü olan etkilerini analiz ettik. Bu farmakolojik manipülasyon, kafatası neurulation ve yakınsak uzantısı üzerinde derin bir etkisi vardır. Bu bileşiğin Duyarlılık farklı genetik fare mutantlar arasında mukayese edilebilir. Burada sunulan yöntem, diğer moleküler geliştirme yollarının çalışmalar, çeşitli reaktifleri kullanılarak embriyolar hücresel fonksiyonunun doğrudan manipülasyon izin de uygulanabilir olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Diseksiyon için stereomikroskopta </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Hassas İnkübatör </td><td> BTC Mühendisliği (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Döner Şişe Kültür Birimi </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Birimi Döner Cam Şişe </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Kauçuk Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Kauçuk Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Giriş Tuzak </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Tüp </td><td> TechAir </td><td></td><td> % 20 O 2,% 5 CO 2 </td></tr><tr><td> Gaz Regülatörü </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Erkek Rat Serum </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o fenol kırmızısı </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml Şırınga </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga Filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük Diseksiyon Makas (künt ucu) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Güzel Bonn Makas </td><td> Güzel Bilimsel İşlem Araçları (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forseps </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode Kullanıcı Tuzlu </td><td></td><td></td><td> Cockroft 1990 yılında açıklanan </td></tr><tr><td> 10 cm Tek Kullanımlık Petri Dish </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Genetik fare modelleri memeli nöral tüp kapanması çalışmada önemli bir araçtır (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Ancak, in utero çalışmada fare embriyo doğrudan farmakolojik ilgi reaktif anne metabolizma etkileri izolasyon embriyoların işlemek için yetersizlik ile sınırlıdır. Onları embriyo ulaşmasını engel olabilecek vücut savunma çeşitli diyet yoluyla ya da enjeksiyon yoluyla, küçük bir molekülü, rekombinant protein veya siRNA, bu maddelerin anneye teslim olsun bu kararsız bileşikler tabi olacaktır. Bütün embriyolar kültürlerini geliştirme içsel fetal etkilerinin anne ayrı soruşturmalar kullanılabilir. Burada, Diseksiyon sonra normal nöral tüp kapanması (Crockett, 1990) için izin veren bir rulo inkübatör cihazları zenginleştirilmiş medyayı kullanarak kültür fare embriyoları için bir yöntem sunuyoruz. Kültür, embriyolargeleneksel embriyoların hala in utero, aksi takdirde mümkün olmazdı in vitro teknikleri kullanarak manipüle edilebilir. Embriyo kardeşler (kranial ve kaudal kat neuropore sonuca E9.5-10 E7-7.5 oluşan neurulation (neurulation başlangıcından hemen önce nöral plak oluşumu,) farklı yönlerini incelemek için çeşitli zaman noktalarında toplanan olabilir kapatılması, Kaufman, 1992). Bu protokol, kranial neurulation çalışma için en uygun timepoints embriyolar diseksiyon yöntemi göstermektedir. Embriyolar, nöral tüp kapatma başladıktan sonra değil, öncesinde embriyo torna ve kranial sinir kat kapatılması, E8.5 (yaklaşık 10-12 somities) disseke ve E10 (26-28 somities) kadar kültürünü muhafaza olacak, kranial neurulation tamamlanmış olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture at JoVE.com

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Video: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Davranış Endokrinoloji ve Deneysel İktisat birleştiren: Testosteron ve Sosyal Karar Verme

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...