Bu araştırma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri, hibe R01 EB007594, Savunma Meme Kanseri Araştırma Programı Bölümü, öneri BCO74699P7 ve Susan G. Komen Vakfı Hibe 26152/98188972 tarafından finanse edildi.

1. Mikroendoskopa Meclisi Burada açıklanan (şekil 1a) yüksek çözünürlüklü mikroendoskop montaj ve uygulama mümkün çeşitli varyasyonlar ile bir temel yapılandırma olarak kabul edilmelidir. Biz burada ayrıntılı platform floresan bir kontrast madde olarak proflavine ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmış bir somut bir şekilde açıklamaktadır. Proflavine parlak bir nükleer sırasıyla 445 nm ve 515 nm absorpsiyon ve emisyon dalga boylarında pik ile leke. Diğer kontrast ajanların kullanımı, kullanıcı uyarma, emisyon ve dikroik filtreleri uygun seçmek için gerekecektir. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskop çeşitli unsurları genel ve birden çok tedarikçiden temin edilebilir. Örneğin, optomechanical konumlandırma bileşenleri, diğerleri arasında Thorlabs, Newport, Linos mevcuttur. Kompakt CCD kameralar Point Gri Araştırma, Prosilica ve Retiga dahil şirketler mevcuttur; kamera hassasiyeti kullanılmak üzere fluorofor parlaklık yanı sıra istenilen kare hızı dikkate alınarak seçilmelidir. Yüksek güçlü ışık yayan diyot (LED), diğerlerinin yanı sıra Luxeon, Cree, Nichia elde edilebilir. Fiber-optik demetleri, Sumitomo, Fujikura ve Schott mevcuttur. Belirli bir uygulama için bileşenler seçerken, kullanıcı, aydınlatma yoğunluğu, kamera hassasiyeti, kazanç ve maruz kalma süresi photobleaching, floresan mikroskopi fluorofor konsantrasyonu arasında yer doğasında olan ilişkileri göz önünde bulundurmalıdır. <ol><li> 7.5 bir çift oluşturmak için, kafes çubukları &quot;1.5 kafes çubukları&quot; 6 Bağlan &quot;uzun çubuklar kat ayna ünitesi biri yüzüne bu çubuklar Vidalı 0.5 Vida&quot; çubuklar ters yüzüne. Deliklerden düşük iki üzerinden, kafes kafes çubuklar üzerine küp kaydırın. Kafes küp (Şekil 1b) yan yüzüne 2 &quot;çubuklar vidalayın. </li><li> C-mount SM1 adaptörü kullanarak bir kafes plaka kamera takın. 0.5 &quot;kafes çubuklar kafes plaka Güvenli, yüz kat ayna ünitesi ile yıkayın. </li><li> 3 &quot;uzun objektif tüp içine yerleştirin ve&quot; boru &quot;lens lens istinat halka ile güvenli. Öngörülen zaman lensin odak uzaklığı fiber-optik paket çekirdek, en az iki piksel numune böyle seçilmelidir kamera üzerine, filtre üreticisi tarafından belirtilen yan içine lens tüp Vida ilk istinat halka üstüne tüpe Bırak emisyon filtresi ve filtre güvence altına almak için başka bir halka eklemek filtre yönlendirme kuralını dikkate alınmalıdır. kafes küp CCD kamera yakın Şekil 1c, bu objektif ve filtre netlik için 3 &quot;objektif tüpü olmadan gösterilmiştir. </li><li> Kamerayı bir bilgisayara bağlayın ve ekrandaki görüntüyü. Doğrudan uzak bir nesneye kafesinin montaj ve raylar boyunca kafes küp bir görüntü odak görünene kadar kaydırın. Bu yerde kafes küp kilitleyin. (Bu sonsuza düzeltilmiş objektif lens ile kombine edildiğinde tüp lens odaklanmış bir görüntü oluşturacaktır sağlanması basit bir yöntem). </li><li> Dikroik ayna kafes küp 45 ° &#39;de yer tutucu ve içine yerleştirin. </li><li> Tüp lens sahibinin karşısında kafes küp yüzüne, SM1 konu adaptörü RMS ve ayarlanabilir bir objektif tüpü ile, objektif lens vidalayın. A z-çevirmen, kolay odaklama için ayarlanabilir lens tüp yerine kullanılan olabilir. Bir kafes plaka içine bir SMA konnektör Vida ve yaklaşık objektif lens çalışma mesafesi, çubuklar bu monte. </li><li> Dağı bir 2 ucuna bir kafes plaka ve slayt LED &quot;çubuklar bir lens, 0.5&quot; bu tüp kafes küpün yan vidalanıyor olduğunda, LED bir görüntü oluşturacak şekilde lens tüp objektif lens arka diyafram doldurur. Bu (Kohler aydınlatma) yapılandırma fiber optik demet proksimal yüzü düzgün aydınlatılmış olmasını sağlayacaktır. 0.5 &quot;objektif tüp eksitasyon filtresi ekleyin ve istinat halkası (Şekil 1c) ile güvenli. </li><li> SMA konnektör, fiber-optik paket takın. SMA Konnektörlü paket kafes çubuklar üzerine monte SMA yuvasına vidalayın. Doğrudan paket distal ucunu geniş bantlı bir ışık kaynağı (floresan aydınlatma yeterli olacaktır) doğru ve CCD kamera paket proksimal yüz görüntü gözlemleyebilirsiniz. Elyaf demeti görüntüsü odak görünene kadar kafes küp vidalama veya objektif lens pozisyonu ayarlayın. Bireysel çekirdek (Şekil 2) açıkça görülebilir olmalıdır. </li></ol> 2. GRIN Lens montaj Mikroendoskop mekansal çözünürlükte bir mikro lens veya lens montaj elyaf demeti ucuna takarak artırılabilir. Bu optik ve böylece ışık-guid dayattığı uzamsal örnekleme frekansı artan doğrudan doku demeti ucu yerleştirme yerine, ucu demagnification ile doku yüzeyine imaged olduğu gibi yapılandırılmışelyaf demeti ing çekirdek. Demagnification derecesi orantılı bir alan görünümünde azalma mekansal çözünürlükte ve aynı zamanda artış, karşılık gelir. Gradient indeksi (GRIN) lens bileşenleri, fiber optik ile uyumlu ve diğerleri arasında GrinTech, NSG, Schott, mevcuttur, ve doğrudan bir elyaf demeti ucuna bağlanmış olabilir. <ol><li> Uygulamanız için istenen büyütme ve çalışma mesafesi ile GRIN objektif seçin. Objektif çapı ile çalışmayı planlıyoruz elyaf demeti daha fazla olduğundan emin olun. Biz elyaf demeti ve GRIN objektif bağı önce doğru uyum için düşük güçlü bir mikroskop veya Stereoskop altında, 3-eksen ayrı manuel konumlandırma aşamaları üzerine monte edilmesi önerilir. </li><li> Lens veya paket yüz ya da bir damla optik yapıştırıcı (örn. Norland UV yapıştırıcı) yerleştirin. Manuel pozisyoner ile temas iki bileşenden getirin. Üretici tarafından önerilen doz UV ışık arabirimi göstermelidir. </li><li> GRIN lens ve gümrüklü arayüzü, alüminyum kapiller tüp (Küçük Parça A.Ş.) kısa bir uzunluğu korumak için eklem içine kullanılabilir. Epoksi ile ortak ve güvenli üzerinden boru kaydırın. Isı shrink boru montaj bitirmek için kullanılabilir. </li></ol> 3. Mikroendoskopa Görüntüleme <ol><li> Yansıması veya doku hücreleri kontrast madde uygulayın. Proflavine (0.01 PBS içinde% w / v) ile in vitro kültür hücreleri görüntülemede kısa inkübasyon (&lt;1 dakika) ve kapsamlı durulama yapılabilir. Görüntüleme, ex vivo doku örneklerinin ya da in vivo dokularda boya mümkün aşağıdaki topikal uygulama. Proflavine alımını bu koşullar altında, bir kaç saniye ve birkaç dakika süren içinde mümkün görüntüleme, yakın anlık olarak tespit edilmiştir. </li><li> Fiber optik demet ışık yansıması için örnek ile temas halinde yerleştirin. Kültür veya ex vivo doku örnekleri görüntüleme hücreleri, görüntüleme sırasında istikrar için XYZ eksenleri manuel konumlandırma aşamaları ile güvenli bir fikstür elyaf demeti distal ucu montaj önerilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Doğru monte edildiğinde mikroendoskop, epi-floresan mikroskop, tutarlı bir fiber-optik paket üzerinden geçirilmesine olarak çalışacak. , En iyi görüntüleme sonuçları için üç temel koşulların yerine getirilmesini sağlamak için, dikkat dikkat edilmelidir: <ol><li> Sistemin tam çözünürlükte elde etmek için, lif demeti proksimal yüz bulanıklaştırma olmadan CCD kamera üzerine imaged olmalıdır. Şekil 2a, b, c, sırasıyla, yoksul odaklı görüntülü bir elyaf demeti kısmı, hafif bulanıklaştırma, ve iyi bir odak göstermektedir. Paket yüze göre objektif lens eksenel pozisyonunu ayarlayarak optimum odak bulundu. </li><li> Elyaf demeti proksimal yüzü düzgün tam çapı (alan görüş) üzerinden aydınlatılmış olmalıdır. Protokol Metin (1.7) de açıklandığı üzere, bu Kohler aydınlatma aydınlatma optik yapılandırarak elde edilir. Şekil 2d düzgün bir floresan örnek kritik aydınlatma altında ilgili sonuç gösteren Şekil 2e, bu tercih yapılandırmasında aydınlatılmış kazanılmış bir görüntü gösterir. İkinci durumda, LED yapısı, gerçek bir örnek yapısı üzerine bindirilmiş bu istenmeyen desen görünüm elyaf demeti yüzüne görüntülü. </li><li> Elyaf demeti proksimal ve distal yüzleri Her iki temiz ve çizik ve cips ücretsiz olmalıdır. Şekil 2f fiber çevre 05:00 küçük bir çip şeklinde hasar, paket yüz bağlı enkaz varlığını göstermektedir. Enkaz lens kağıt ve izopropanol, ya da standart fiber-optik temizleme araçları, geleneksel fiber optik konektörler gibi aynı şekilde temizlik yüzleri paket kaldırılabilir. Elyaf demeti her iki ucunda çizik veya yontulmuş, ya da paket uzunluğu boyunca bozulursa, yüz standart manuel veya mekanik parlatma teknikleri ile düz cilalı olabilir ise. 0.5-1.0 mikron kağıt üzerinde son bir cila ile, ilk bir kaba lehçe için kağıt alıştırma 12-15 mikron önerilir. </li></ol> Şekil 3a, etiketleme aşağıdaki örnek üzerinde çıplak elyaf demeti proflavine ve ışık yerleştirme, 1483 hücreleri in vitro görüntüleme göstermektedir . Şekil 3b mekansal çözünürlükte ve paket ucuna bağlanmış bir 2.5x GRIN lens tarafından sağlanan alan görüş azalma iyileşme göstermektedir. Film 1 meme yağ yastığı bir fare modelinde in vivo görüntüleme göstermektedir. Burada, 21-gauge iğne ile 0.5 mm dış çapı (330 mikron alan-view) ile bir elyaf demeti geçti ve doku içine gelişmiş. Yağ hücreleri, 15 yaşında bu satın alma belirgin kalp döngüsü nedeniyle hareket ile, açıkça görülebilir.saniye başına kare. Şekil 3c, sağlıklı bir insan gönüllü olarak oral mukoza görüntüleme, 1.5 mm dış çapı (1.4 mm alan görüş) kullanarak bu kez daha büyük bir elyaf demeti göstermektedir. Gösterilen tüm örnekler, proflavine nükleer bir etiketleme floresan kontrast madde olarak kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 yüksek çözünürlüklü mikroendoskop (HRME) birleştirmek. (A) HRME sisteminin şematik diyagramı. (B) Meclis ana optomechanical destek yapısı. (C) optik elemanlar eklenmesi, LED aydınlatma ve CCD kamera. 10 &quot;x 8&quot; x 2.5 &quot;muhafaza paketlenmiş HRME sistemi (d) Fotoğraf,. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 HRME ayarlama. (A) yoksul odak fiber-optik paket ile görüntüleme örnekleri, (b) iyi bir odak yakın, (c) ideal bir odak. (D), paket distal ucunda tek tip bir floresan hedef Kohler (uniform) aydınlatma altında görüntülenmiş. (E) tek tip bir floresan hedef nesne üzerinde belirgin kaynak yapısı ile, kritik bir aydınlatma altında görüntülenmiş. (F) gevşek doku ve hücrelerin, aynı zamanda kendi çevresindeki ufak çaplı hasara yatkın elyaf demeti yüz, sopa olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 HRME ile Görüntüleme. (A) 1483 hücreleri, in vitro proflavine% 0,01 (w / v) ile etiketleme aşağıdaki çıplak fiber paket (IGN-08/30) ile görüntülenmiş. (B) &#39;de gösterildiği gibi aynı 1483 hücre kültürü (a), 2.5x GRIN lens takılı bir lif demeti ile görüntülenmiş. Proflavine% 0.01 &#39;lik topikal uygulaması (w / v) aşağıdaki (c), in vivo olarak normal insan oral mukoza Görüntü, . Film 1 Görüntüleme meme dokusu içine geçirilen bir 21-gauge iğne lümeni içinde 450 mikron dış çapı elyaf demeti ekleme ile bir fare yağ yastığı. Proflavine% 0,01 (w / v) görüntüleme fiber yerleştirilmesinden önce, aynı iğne ile görüntüleme siteye teslim edildi <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">. videosunu izlemek için</a> tıklayın

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP ve DY ifşa etmek için bir şey var. RRK microendoscopic görüntüleme platformları ile ilgili patent sahibidir.

Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi tekniği, in situ hücresel detay görselleştirmek için, esnek, sağlam ve maliyet-etkin yöntemi ile temel biyomedikal ve klinik araştırma alanlarında araştırmacılar sağlar nitelendirdi. Görüntüleme sistemi montaj için bir protokol açıklanan ve in vitro hücre kültürü kullanımını gösterdi, ve in vivo hayvan ve insan dokuları var. Burada sunulan görüntüleme sonuçları floresan bir kontrast madde olarak kullanılan proflavine ederken, diğer gruplar, LED aydınlatma dalga boylarında ve filtreler ile 5-7 diğer boyaların uyarma / emisyon spektrumları maç için seçilen sistemi sürümleri göstermiştir . Çözünürlük ve görüş alanında başlangıçta çekirdek-çekirdek aralığı ve fiber-optik paket görüntüleme çapı belirlenir. Biz yaklaşık 4 mikron çekirdek çekirdek aralığı ve 330 mikron (1 film), 720 mm (Şekil 2, Şekil 3a, b), 1400 mm (Şekil 3c) görüntüleme çapı demetleri kullanılır. Küçük demetleri dar göstergesi iğne geçirilir ve büyük liflerin önemli ölçüde daha esnek olabilir. Biz ve diğerleri 8, bazı durumlarda, fiber otofloresans emisyonlarının görünümünü kendisi paket kaydetti. UV dalga boylarında fluorophores heyecanlandırmak, ya da kırmızı spektral aralıkta emisyon toplamak için çalışırken, dikkat elyaf demeti otofloresans genel ölçülen sinyal katkıda düzeyine dikkat edilmelidir. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi işin en güncel çıplak bir elyaf demeti kullanılır bildirilmiş olmasına rağmen, ek büyütme distal ucuna bağlanmış GRIN lenslerin kullanımı ile sağlanabilir. GRIN lensler, optik sapmaları ve sınırlı NA duyarlılık iyi tanınan olmasına rağmen, mekansal çözünürlüğü artırmak için basit ve ekonomik şekilde sunuyoruz. GRIN objektif performansı belirli bir uygulama, hibrid GRIN / küresel lens hedefleri 9 veya minyatür objektif lens meclisleri için yetersiz ise 10-11 istihdam edilebilir. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskop geniş bir alan epi-floresan mikroskop gibi çalışır aslında burada açıklandığı, bu nedenle herhangi bir optik kesit (konfokal veya doğrusal olmayan mikroskopi) beklenebilir. Bizim tecrübelerimize göre 455 nm uyarma ışık ve kontrast madde olarak topikal proflavine kullanarak, ışık, öncelikle bir kaç hücre tabakaları ile ilgili bir derinlik toplanır. Bu protokol, 10 kompakt bir ayak izi okuyucu ile, masa üstü &quot;x 8&quot; yüksek çözünürlüklü mikroendoskop monte sağlamak için gereken. Eğer istenirse, sistem bir kutu içinde kapalı ve elektrik bileşenleri (LED ve kamera) bir pil (Şekil 1d) tarafından desteklenmektedir. Birçok kompakt fotoğraf makineleri, IEEE-1394 (Firewire) ve ana bilgisayar USB portu tarafından desteklenmektedir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

Birçok biyolojik ve klinik çalışmalar, hücresel seviyede çözünürlük ile morfoloji ve fonksiyon uzunlamasına bir çalışma ve analiz gerektirir. Geleneksel olarak, birden fazla deneyler, ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi için sıralı zaman noktalarında çalışma kaldırılır bireysel örnekleri ile paralel olarak işletiliyor. Konfokal, multiphoton ile birkaç intravital teknikleri geliştirdi ve ikinci harmonik mikroskopi yerinde 1 görüntüleme için kullanılacak yeteneklerini gösteren edilmiştir. Ancak, bu sistemler, gerekli altyapı, lazer tarama sistemleri ve kompleks ışık kaynakları içeren karmaşık ve pahalı. Burada 5.000 ABD $ altında-raf kapalı bileşenleri kullanarak bir gün içinde inşa edilebilir, yüksek çözünürlüklü bir mikroendoskop tasarım ve montaj için bir protokol mevcut. Platformu görüntü çözünürlüğü açısından esneklik sunar, alan görüntüsü, ve işletim dalga boyu, ve biz bu parametreler son kullanıcının özel ihtiyaçlarını karşılamak için kolaylıkla değiştirilebilir nasıl açıklar. Biz ve diğerleri eksize 6 ve yaşayan hayvan dokularının 2,5, ve in vivo 2,7 insan dokularında yüksek çözünürlüklü mikroendoskop (HRME), in vitro hücre kültürü 2-5 incelemiş bulunuyoruz. Kullanıcılar proflavine 2-4, benzoporphyrin türev monoacid halkası (BPD-MA) 5, ve fluoroscein 6,7, tam almış olan, ya da FDA investigational onayı da dahil olmak üzere birçok farklı floresan kontrast ajanların kullanımı, bildirdin İnsan denekler üzerinde kullanmak için. Yüksek çözünürlüklü mikroendoskopi, burada açıklanan formu, temel ve klinik bilimleri alanında çalışan araştırmacıların geniş bir itiraz edebilir. Bu teknik, kullanıcıya yüksek çözünürlüklü, in situ uzunlamasına görüntüleme gerçekleştirmek için sağlayarak, geleneksel masa üstü mikroskopi tamamlar, etkin ve ekonomik bir yaklaşım sunuyor.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging at JoVE.com

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K Görüntüleme.  Rice University. Onlar kendi ana mikroçevresinin geliştikçe birçok biyolojik ve klinik durumlarda hücresel süreçleri incelemek için avantajlıdır. Burada montaj ve hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik hasta çalışmaları, gerçek zamanlı görüntüleme sağlayacak bir düşük maliyetli, fiber-optik mikroskop kullanımını tanımlamak.

Video: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Biyomühendislik

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Görüntüleme ve Non-invaziv için Spektroskopisi Fiber paket Mikroendoskopi Platformu,<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Analizi

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Uygun konumlandırma ve sıçan Hind riske odaklı yüksek kararlılık düşsel ve kemik mikro mimarisi kullanarak Vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi için kısıtlama

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

En iyi duruma getirilmiş kurulum ve manyetik etki alanı görüntüleme ile Situ histeresis ölçüm için iletişim kuralı

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...