Biz C57BL / 6 B1-8 GFP transgenik fareler sağlamak için çizgili-aydınlatma yaklaşımı, K. ve A. Rajewsky Haberman&#39;da gelişimi sırasında verimli tartışmalar için R. Heintzmann teşekkür ederim. Biz mali destek için Deutsche hibe NI1167/3-1 altında Forschungsgemeinschaft (RN), HA5354/4-1 ve SFB633, proje A15 (AEH için), hibe Rahel-Hirsch burs kapsamında Charite (RN) kabul. Biz özellikle verimli tartışmalar ve altyapı desteği için ağ Jimi kabul

Çizgili-aydınlatma TPLSM için Multi-ışın Kurulumu Burada kullanılan, daha önce Kur 6,20 tarif edildiği gibi, özel bir çoklu ışın iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu. Bu sistem, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Yaklaşımı, tek ışın tarama yapmak için tek sahip olsa bile, galvoscanner ayna hareketi ile senkronize makinesi satın mümkün olan diğer iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu, uygulanabilir . Bu durumda, standart dezavantaj PMT tabanlı TPLSM olarak satın alma hızına benzer, ancak bir alt tedarik hızı olacaktır. Kadar çözünürlük ve kontrast ile ilgili olarak en iyi kaliteyi elde etmek için, düşük ağartmanın ve fotohasar ve hızlı edinimi de, bu kurulum aşağıdaki ayarlama adımları dikkate tavsiye edilir: <ol><li> Tisa lazer lazer gücünü kontrol edin: orijinal fabrika değerlerine ve onceki ile karşılaştırmak,% 100 kontrolBize okumaları ve kendi aralığı 700-1,000 nm bir uyarım dalga boyu gerekli ise o olarak kullanabilirsiniz. </li><li> Ti için uzaktan kumanda göstergesi test: Sa ışın ayırıcı, yani% 0 kontrol ve% 100 ayarları. % 100 geri kalan Tisa kiriş, sonra orada kontrol ve step motor sıfır konumunu sıfırlayın. Ti: Sa ışın ayırıcı dik ışın yolları üzerinde dik olarak polarize lazer ışınlarını böler düşük düzen λ / 2 plaka ve bir polarize oluşur: bir uyarım için mikroskop içine yönlendirilir, diğer optik parametrik pompalamak için kullanılır osilatör (AFE). Otomatik olarak λ / 2 plaka, Ti sürekli bir ayarı döndürerek: Sa ve OPO güç sırasıyla elde edilir. </li><li> İstenilen dalga boyu OPO ayarlayın ve çıkış gücünü ölçmek. Gücü çok düşükse: pompalama dalgaboyu optimize etmek ve inci ayarlarını kontrol (Ti W 4 ile Sa lazer 800 nm, bir çevrede 1,050-1,100 nm OPO ışın W 0,8-1 almak gerekir)e ayna ve kristal akın etti. OPO istenen dalga boyu çıkışta yankı ve gücü artar kadar onların önerilen optimal çizelgeler veya grafik gibi genellikle mevcut değerleri ve daha sonra ince ayar onları seçin. <ol type="i"><li> Gücü hala düşükse, dört erişilebilir ayna ayarlama düğmeleri ile OPO iki erişilebilir aynaları ayarlayın. Çok yavaş ve çok küçük hareketlerde, ön ve uç aynalar arasında değişen bu adımı yapmak. </li></ol></li><li> Sa ve / veya OPO kirişler uygun, merkezi konumda giriş aynalar çarptı: Ti kontrol edin. <ol type="i"><li> Sa kirişler: beyaz bir kağıt (! Çok parlak veya yansıtıcı olmayan) bir parçası ve ışın OPO gözlemlemek için bir kızılötesi görüntüleyici ve yüksek dalga boyu Ti kullanın. <ol type="i"><li> NUR Ti ile çalışırken koruyucu gözlük: Sa kirişler (genellikle 720-750 nm kadar ortalama kişi için görünür). </li></ol></li><li> Mi şekilde hizalama işlemi için mümkün olduğunca düşük lazer güç (ler) Setpotansiyel göz hasarı nimize. </li><li> Gözbebekleri daralıp, böylece her zaman, ilgili odanın ortam ışık tutmak. </li><li> Sa ışın tarama kafası girer: lazer güç ince kontrollü Ti zaman henüz yürürlükte olmayan bir λ / 2 plakası ve polarize, dışarı oluşan zayıflatıcıların tarafından unutmayın! </li></ol></li><li> Giriş noktası diyafram Ti ortasında isabet olduğunu kontrol edin: Sa ve / veya OPO kiriş; değilse, lazer ışını tarama kafası girmeden önce, son iki ayna ayarlayın. <ol type="i"><li> IR görüntüleyici ve beyaz (yansıtıcı / ama parlak değil!) Küçük bir kağıt parçası kullanın. </li><li> Lazer ışını konumu daha kesin karar olabilir, böylece her zaman, mikroskop girdiği anda diyafram kapatın. Önemli: 6. adıma geçmeden önce diyaframı yeniden unutmayın! </li></ol></li><li> Buna göre mikroskop içine yansıtılan lazer ışını ışık yolunu ayarlayın. Küçük kesimleri bunu yapmak ve iteratif kiriş-wa gerçekleştirmeklking. <ol type="i"><li> Objektif lens gelen ışık çıkışı yeterli değilse, tüm ışık yolunu kontrol edin. </li><li> Cihaz uzun süre, büyük bir onarım, optik elemanların herhangi bir değişimi sonrası ilk kez sistemini kullanırken her zaman ışık yolunu kontrol ya da sorunlar çıkışı ile mevcut şüphesi varsa. </li></ol></li><li> Onlar tozsuz özellikle olduğunu, tüm aktif optik yüzeylerin temiz olduğundan emin olun! Yüzeyleri toz tabakası ile kaplı ise, dalga ön bile objektif lens girmeden önce bozuk ve elde edilen lazer ışını numunenin net bir görüntü sunmak asla! <ol type="i"><li> Eğer gerekli ise, etanol veya izopropanol ile nemlendirilmiş lens kağıt katlanmış parça ile aynalar temizleyin. </li></ol></li><li> Işın ışık yolu ayarlandıktan sonra, prizma tabanlı darbe kompresör sonunda doğrudan giriş ayna üzerinde bulunan aynaya geri geldiğinde kontrol edin. Buradan, ışın yansıtılır iışın çoklayıcı (BM) Nto. </li><li> Lazer ışını, bir geniş-bant% 50 ve% 50 aktarım yansıma gereksinimlerini uygun lazer ışınının polarizasyon değişen doğrudan λ / 2 levha önce, ışın çoklayıcı girişinde yer alan diyafram vurursa Giriş BM içinde. <ol type="i"><li> Birinci ışın pozisyonu daha kesin karar olabilir, böylece diyafram kapatın ve BM girişinde mikroskop ve diğer girmesinden da bir, yani, iki kiriş arasında diyafram yürüme gerçekleştirin. Diğer tek-ışınlı tarama mikroskopları için diyafram xy-tarayıcı içine girişinde yer almalıdır. </li><li> Kiriş kapalı aşağı açıklık merkezi isabet etmezse, BM giriş diyafram önce doğrudan yerleştirilir, yukarıda belirtilen ayna ayarlayın. Önemli: 10. adıma geçmeden önce diyaframı yeniden unutmayın. </li></ol></li><li> Diyafram açıldı ile lazer ışını BM aynalar vurur olmadığını kontrolonların orta-nokta. BM karmaşık ışık yollarının başka bir bölümünü bloke etmeyecek şekilde kağıt dar bir şerit kullanın! </li><li> Paralel polarizasyon için üst ayna &quot;P&quot;, dik polarizasyon &quot;S&quot; için alt ayna: ışın çıkış aynaların ortasında vurur olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, DM&#39;nin önce giriş ayna ayarlayın. </li><li> &quot;S&quot; ve &quot;P&quot; polarize ışın grupları polarize küp girin ve xy-tarayıcıya girdiği anda uygun örtüşme sağlar olmadığını kontrol edin. Durumda bu adımları tek-ışınlı tarama mikroskobu kullanılmaktadır atlayın. </li><li> Lazer ışığı merkezi tarama ve tüp lensler geçer ve objektif lens &#39;arka odak düzlemi ortasından alırsa edin. Önemli: Bu adım, bir park konumunda, orta konumda, lazer ışını ile yapılmalıdır! <ol type="i"><li> Bir amaçlayan bir araç (&quot;boğa gözü&quot;) ile objektif lens değiştirin ve lazer ışını ortasında hedef vurur olmadığını kontrol edin ve olsunaydınlatma çifttir. </li><li> Bu durumda gibi görünüyor, BM önce açıklığı kapatmak ve dairesel bir girişim deseni görünürse ortasında (parazit az) siyah bir daire ile kontrol edin. <ol type="i"><li> Turnayı gözünden merkezine göre önemli bir değişim var ise giriş aynayı ayarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> Şimdi 20X su daldırma lens ile örneğin bir objektif lens ile turnayı gözünden değiştirin. <ol type="i"><li> Beyaz bir kağıt parçası ile çıkış ışık alanını kontrol edin. Bu, parlak düzgün ve merkezi olarak yerleştirilmiş olmalıdır. </li><li> Çıkış gücü ölçün:% 100 Ti pompalama ile% 100 OPO at: Sa (4 W), bir yaklaşık almalısınız. (Burada kullanılan mikroskop) 1100 nm&#39;de lens sonra 100-150 mW. Alt lazer güçler çoklu ışın SI-TPLSM gerçekleştirmek için yeterli olmayacaktır. Tek-ışınlı tarama SI-TPLSM için, 5-10 mW yeterlidir. Lazer ışını scanne olmadan orta konumda kalmalıdırd! </li></ol></li><li> MB-SI-TPLSM performans aşağıdaki gibi, BM de aynalar align: <ol type="i"><li> Sahnede bir homojen floresanlama örnek, örneğin kırmızı floresan slayt, yerleştirin ve numune içine ancak (objektif lens &#39;ön yani yakın) üst yüzeye yakın lazer ışını odaklanır. </li><li> Çoklu ışın moduna ayarlayın ve mikroskop başında kirişlerin sayısı, tercihen tek bir ışın ve kutuplaşma, örneğin &quot;P&quot; seçin. <ol><li> Floresan slayt görüntüleme ile lazer ışınını bul: açık &quot;P&quot; çekim ayarlamak ve ışın odaklama iken sürekli CCD kamera çalıştırın. </li><li> Kiriş orta konumda olan ve tarayıcının kapalı olduğundan emin olun. Işın taranan değil emin olun! </li><li> Kamera çipi merkezine yakın bir parlak nokta bakarak ışınını bulun. </li><li> Nokta görüntü düzleminin, yani parlak ve keskin kadar ışın odaklamakmikroskop, kamera çipinin konumuna karşılık gelir; nokta doymuş değildir, böylece, lazer gücü azaltmak. Iyi hizalanmış sistemi ile bu lazer gücü bir ışın modunda (yaklaşık 0.6 mW lazer gücü çalışmalıdır) çalışırken yakın en az olmak zorunda olduğu anlamına gelir. </li><li> Nokta merkezine kapalı anlamlı ise, ön BM (veya tek-ışın tarama için tarayıcının) ayna ayarlayarak yakın merkezine doğru hareket ettirin. </li><li> Ayrıca, yani &quot;S&quot; kiriş diğer kutuplaşmayı hizalama zaman, şimdi, 2-ışın moduna &quot;S&quot; sürgüsünü açın ve sadece &quot;S&quot; obtüratör açık ise (sadece tek bir ışın görülebilir ışın konumunu kontrol .) </li><li> Bittiğinde, 4-ışın moduna geçmek ve &quot;P&quot; polarizasyon modu (&quot;P&quot; obtüratör açık) kullanın. Şimdi iki beamlets görünecektir. </li><li> İki beamlets mükemmel kameranın bakış alt kenarına paralel ve ayrı 2.8 mikron olarak bunları ayarlamak için düzenlemek. <ol type="i"&gt; <li> Düzgün hizada değilse, BM ilk aynayı ayarlayın. </li><li> İki kiriş um ayrı ve mükemmel bir şekilde yatay olarak düzenlenmiş 2,8 kadar yerine ayna hareket ettirmek için iki çevresel vida kullanarak, ortada vida hizalamak yok. </li></ol></li><li> Şimdi &quot;P&quot; kutuplaşma 8-ışın moduna ve 4 beamlets 2.8 um de eşit uzaklıkta olan ve görüntünün alt kenarına paralel düzenlenmiş kadar ikinci BM ayna (ayrıca kırmızı nokta olmadan) ayarlayın. </li><li> Sırasıyla, ve 32-ışın modu, 3. ve 4. BS aynasını ayarlama - 16 içinde tekrarlayın. SI-algoritmaları, basit min-max (HiLo) algoritması olan, bu varsayıma dayanmaktadır çünkü beamlets eşit uzaklıkta olması için önemlidir. </li></ol></li></ol></li><li> Bir heterojen olarak yapılandırılmış bir, örneğin çapraz-lekeli Convallaria kökleri ile homojen bir floresan örnek değiştirin. <ol type="i"><li> W, uyarım kirişin park konumuna githich genellikle tarayıcı koordinatları, örneğin (; 10,000 10,000) büyük değerleri yerleştirilir. </li><li> CCD kamera ile (multi-ışın) görüntüyü tarayın. Görüntü, keskin üniforma ve düz görünür olduğunu kontrol edin. </li><li> Görüntü döndürülmüş görünüyorsa kamerayı ayarlayın: Görüntü doğruldu kadar (! Nazik olun) elle eksenel düşey eksen etrafında kamera gövdesini bükün. </li></ol></li><li> Uyarım modeli, örneğin, bir görüntü oluşturmak için çizgili tarama işlemini kontrol etmek amacıyla xy-tarayıcı başlatın. <ol type="i"><li> Çoklu ışın tarama durumunda, yani y-tarayıcı ayna hareket eder. ikinci dereceden çizgili bir görüntü oluşturmak için böyle bir şekilde küçük ışın hattı diktir. </li><li> Aşama 17.1 &#39;de tarif edildiği gibi, görüş alanı elde edin. kiriş-let hattı ikiye katlandı ve beamlets tüm hat boyunca eşit uzaklıkta olmasını sağlamak bir konuma x-tarayıcı aynayı hareket ettirerek tarama rutin uzatmak, çok küçük. Tam hareketi tekrarlayınx-tarayıcı daha büyük olan ayna çizgili görüntü oluşturmak için taşınır y-tarayıcı ayna sonra. </li><li> İstenilen çizgili görüntü oluşturmak için - bilim adamı tarafından tanımlanan - tek ışın tarama durumunda, eşit pozisyonlarda defalarca x-tarayıcı ayna hareketi ile y-tarayıcı ayna hareketi alternatif. </li><li> Sabit hızda (azaltılmış hızlanma / yavaşlama) için y-tarayıcı ayna bir komut hareketi için ve maksimum hız (maksimum hızlanma / yavaşlama) de x-tarayıcı ayna biri için kullandığınızdan emin olun. </li></ol></li><li> Otomatik olarak kazanmak ve kamera (alan-dedektör) ile çizgili görüntü kaydetmek. Bu nedenle, tarayıcı ile kamera senkronize ve ana tetikleyicisi olarak tarayıcıyı kullanın. </li><li> Çizgili görüntüleri elde tekrarlayın aşağıdaki gibi farklı pozisyonlarda x-tarayıcı aynayı hareket ettirerek (Protokol 17 anlatılan tarama protokolü): <ol type="i"><li> Yeterince tekrarlama adımları arasındaki uygun adım uzunluğunu seçinbirbirini takip eden iki beamlets (bu durumda 2.8 um ve tarayıcı aynalar bir adım 25 nm eşittir) arasındaki mesafeyi kapatmak için birbirini takip eden iki şeritli görüntüleri; biraz üst üste izin vermek için uygun olabilir, ek 0.3-0.4 um, yani. </li><li> Verilen dalga uzunluğunda yanal çözünürlük limiti ile eşleşen bir değere x-shift ayarlayın. Bir örnek olarak, vardiya ve 12 veya 13 vardiya başına x-tarayıcı aynanın 10 adımları kullanarak yol iyi eksenel ve bu sistemde yanal çözünürlük sonuçları hem. Sayılar kullanılan sistemde iyi çalışacak bir yapılandırılmış slayt, örneğin Convallaria kökleri slayt, kontrol edin. </li><li> Convallaria görüntü keskin hale gelinceye kadar bu iki değer Optimize: hesaplanan SI görüntülerde çizgi profil aracını kullanın ve çizgi profillerinin (Convallaria hücre duvarlarından floresan sinyali olan) genişliğini karşılaştırın. </li><li> Tarayıcı hareketi ile senkronize her çizgili görüntü elde ayrı kaydedebilirsiniz, örneğin </em&gt; tiff veya ikili dosyaları gibi. </li></ol></li><li> Değerlendirme rutin matrisler, yani 3D matris gibi çizgili görüntü komple bir set açın ve yüksek çözünürlüklü SI-görüntünün bir 2D matris oluşturmak için min-max algoritması veya bir Fourier-transform algoritması kullanabilirsiniz. Bu algoritmalar, daha önce ayrıntılı 20&#39;de tarif edilmiştir. </li></ol> Intravital Görüntüleme için Fare aşılama ve hazırlanması Hayvan deneyleri hayvan refahı (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) için uygun eyalet komiteleri tarafından onaylanmış ve geçerli kurallara ve yönetmeliklere (hayvan deneyi lisans G0153/08) ile uygun olarak yapıldı. <ol start="21"><li> 4 daha önce anlatıldığı gibi popliteal lenf düğümü ve görüntüleme alanının hazırlanması için bir germinal merkez yanıtın başlatılması gerçekleştirilmiştir. Immünomanyetik dalaklarından B hücrelerinin saflaştırmak B1-8 + / + JK - / -ve B1-8 + / + JK B hücreleri - / - GFP + fareler. </li><li> - / - + / + JK ⅛ B1-8 ile&gt;% 95 bir saflığı olan damar 3 x 10 6 NP özgü B hücreleri enjekte GFP + ve ⅞ nonfluorescent B1-8 + / + JK - / - C57BL / 6 alıcılarda . </li><li> Hücre transferi, bir gün sonra NP-CGG sağ arka gıda yastığa Tam Freund katkı maddesi (CFA) içerisinde emülsifiye (nitrofenil-tavuk ɣ globulin) 10 ug ile alıcı bağışıklık kazandırır. </li><li> ATTO590-süksinimidil ester ile anti-CD21/CD35 antikorların Etiket Fab fragmanları. <ol type="i"><li> , In vivo olarak germinal merkezi içinde foliküler dendritik hücrelerin ağ (FDC) gelmek intravital analizi yapılmadan önce fareler, 12-24 saat sağ arka ayak tabanından florokrom etiketli Fab fragmanlarının 10 ug enjekte etmek. </li></ol></li></ol> Aşağıdaki adımlar conside olmalıdırintravital görüntüleme için popliteal lenf düğümü (gün 8-10 bağışıklık kazandırma işleminden sonra) bileşiğinin hazırlanması için kırmızı: <ol start="25"><li> Ketamin / ksilazin ip enjeksiyonu, kendi ağırlığına bağlı olarak miktarı ile fare anestezisi. </li><li> Bütün görüntüleme dönemde anestezi derinliği izlemek için refleksleri test edin. </li><li> Sırt bacak ve titiz farenizin sağ kanadını tıraş ve tamamen artık saç kaldırmak için kıllarını alıcı krem ​​kullanın. </li><li> Büyük sağ trokanteri Fix: parmakları ile kemik çip bulmak, bir küçük beyaz üçgen şeklindeki fasya görünene kadar makas ile küçük bir deri kesisi ayarlayın. </li><li> Süzgeç sivri cımbız ile bu fasya altında kemik çip kelepçe. </li><li> Dişli cımbız kullanarak lomber bölgede omurga düzeltmek. </li><li> Süzgeç sağ arka bacak düzeltmek ve vidayı sıkın. </li><li> Doğru pozisyonda bacak tutmak için bant kuyruk. </li><li> Uyluk kaudal tarafında, bölgedeki belirgin ve popliteal Ente olarak, deride bir insizyon oluşturmakrs doku, künt cımbız ile altta yatan doku cilt ayırmak ve distal proksimal popliteal ven izleyin. </li><li> Künt cımbız kullanarak lenf düğümü Açığa, (açığa sırasında PBS içinde lenf düğümü tutmak) ince lenf damarları korumak amacıyla kesme kaçınıyorum. </li><li> Lenf düğümünde etrafında vakum gres bir daire oluşturun, PBS ile bu su birikintisi doldurun. </li><li> Pozisyonunda kapak kayma koyun ve termometre-prob (aksi hücre hız önemli ölçüde değişir, 37 ° C&#39;de sıcaklığı tutmak) yerleştirin. </li><li> Kapak kayma üst kenarı boyunca vakum yağ bir daire ekleyin. </li><li> , Vakum yağ üzerindeki konumunda ısıtma bobini koyun daha önce olduğu gibi benzer bir şekilde bir yalıtım oluşturmak ve objektif içine daldırma için, cam kapak slip üzerinde su / PBS ilave edin. </li><li> Ölümcül dozda ketamin / ksilazin dozları artırırken görüntüleme sonra, fare servikal dislokasyon takiben, anestezi tutulur. </li></ol>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li><li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine.">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs.">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li><li>Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+two-photon+intravital+microscopy+to+the+infrared+by+means+of+optical+parametric+oscillator.">Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator.</a> Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).</li><li>Hell, S. W., Rittweger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy:+Light+from+the+dark.">Microscopy: Light from the dark.</a> Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).</li><li>Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraresolution+imaging+in+brain+slices+using+stimulated-emission+depletion+two-photon+laser+scanning+microscopy.">Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy.</a> Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).</li><li>Bianchini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-wavelength+two-photon+excitation+-+stimulated+emission+depletion+(SW2PE-STED)+super-resolution+imaging.">Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li><li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain.">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551 (2012).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced optical imaging. , (2001).</li><li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy.">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li><li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+in+microscopy.">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li><li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging.">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li><li>R&#252;ckel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing.">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li><li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique.">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li><li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues.">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation.">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li><li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intravital+microscopy.">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+structured-illumination.">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li></ol>

Volker Andresen Almanya LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, bir hissedar olduğunu. Diğer yazarların herhangi bir çatışmaları yok.

Intravital optik görüntüleme amacı dinamik ve fonksiyonel doku ve sağlık ve hastalık 5 organ işlevini anlamak amacıyla hücresel hareketliliğini ve etkileşimleri görselleştirmek için. Bu, çoklu foton lazer tarama mikroskobu elde etmek için en güçlü teknoloji, hala, onun uzaysal çözünürlüğü sınırlamak ön çarpıtmalar, saçılması, yavaş edinimi, ışıkla ve fotohasar, dalga ilişkin sınırlamaları aşmak kontrast yanı sıra zaman çözünürlüğü vardır . <p class="jo...

İki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), kızılötesi ultra kısa atımlı uyarma 1 ilgili derin doku görüntüleme için avantajları ile çeşitli motilite ve etkileşim kalıplarını ortaya koyarak bir tek hücre düzeyinde hayati süreçleri hakkındaki görüşümüzü devrim yarattı hayvanların 2-5 yaşayan hücre alt. Ancak, mevcut teknoloji, sağlık ve hastalık dokuları içinde hücresel yanıtın moleküler temeli hakkında sadece seyrek bilgiler vermektedir beri, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için bir ön koşul olarak organ fonksiyonu ve disfonksiyonu mekanizmaları aydınlatmak için hala yetersizdir. Mevcut teknoloji saçılma nedeniyle birkaç yüz mikron sadece bir mekansal pencere açar ve mekansal çözünürlükte ve yetişkin hayvanların son derece kompakt dokusunda özellikle ortada sinyal-gürültü oranı 6, ​​üzerinde ön distorsiyon etkileri dalga. Bu saçılma ve dalga ön distorsiyon etkileri oldukça heterojen An nedeniyle3 boyutlu uzamsal çözünürlük bir derinliğe bağlı bozulması için bir birinci aşamada dokularda kırılma indeksi d anizotropik dağıtım ve son balistik uyarılma fotonlarının, sinyal-gürültü oranı yani kaybından kaynaklanan sinyalin toplam kaybına bağlanmıştır. Bioscientific ve biyomedikal derin doku uygulamaları açısından, bu sinyal-gürültü oranının azalması sistemi bazı ardı neden olur oysa düşük çözünürlük yalancı pozitif etkileşimlerin yol açacak, çünkü mevcut teknoloji tümden hücresel iletişimi ortaya çıkarmak için mümkün olduğu anlamına gelir Loş yapılar arasındaki etkileşimler. Net bir şekilde dinamik bir şekilde hücresel etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük derin doku içinde gereklidir. Örneğin özel sayısal algoritmalar, ilk uyarılmış durum incelmesi örneğin yapısı-aydınlatma yaklaşımlar, dayalı anda tanıtıldı güçlü nanoscopy teknikleri </em&gt; STED&#39;in, RESOLFT veya molekül yerinin üzerinde, örneğin dSTORM, PALM, sabit hücrelerin yanı sıra canlı hücre kültürlerinde 7&#39;de birçok uygulama bulduk. Ancak, doku bölümleri, canlı doku ve organizmalar için bu uygulamaları genişletmek için biz hala ciddi teknik zorlukların üstesinden gelmek gerekir. İki foton uyarma farklı dalga boylarına sahip hem de uyarma için, tek bir dalga boyunda (sw2PE-STED) ile STED ve emisyon aynı anda sırasıyla gömülü hücrelerin 9, beyin dilimleri 8 ya da yapay matrislerde yanal çözünürlüğünü geliştirmek için uygulanmış uyarılmış standart TPLSM olarak eksenel çözünürlük. Tek-foton STED&#39;i kullanarak, dendritik dikenler dinamikleri 67 nm 10 çözünürlükte bir yaşam Thy1 EGFP fare beyin korteksinin (kadar 10-15 mikron derinlik) yüzeyinde görüntülü olabilir. Gelişimsel biyoloji için çok yönlü bir araç iki kat geliştirilmiş 2D sağlayan multifokal yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu tarafından sağlanmaktadırçözünürlük. Ancak, bu teknik sadece bu zebra balığı embriyolar 11 gibi ışık saçılması düşük bir eğilimi olan organizmalar kullanılabilir. Yine de, bu tekniklerin hiçbiri, doğum sonrası başlangıçlı hastalıkların biyomedikal ve klinik araştırmalar için önemli bir model olan birkaç yüz mikrometre arasında, yetişkin hayvanların yüksek saçılma dokusunda uygulanabilir. Nokta dağılım fonksiyonu (PSF), yani kırınım-sınırlı dalga ön şeklini hesaplamak için kullanılan yaklaşım, bağımsız, bir lens aracılığıyla odaklama sonra, optik eksen (eksenel çözünürlük) boyunca PSF genişliği en az üç kat daha büyük Optik eksenin (lateral çözünürlük) 12 dik PSF genişliği. Önemli ölçüde özellikle optik boyunca çok daha büyük PSFs, önde gelen derin doku görüntülemede odaklı elektromanyetik dalga dalga ön şekli değiştirmek Zernike katsayıları ile ölçülebilir farklı siparişlerin ön bozulmaları dalgadiğerleri 13-15 eksen. Bu nedenle, kırılma kanunları ve dalga ön bozulma etkileri hem derin doku görüntülemede sınırlayıcı faktör olarak optik eksen boyunca çözünürlüğe işaret. Nanoscopy teknikleri kırınım sınırlarını mücadele odaklanmak Oysa sadece eksenel çözünürlük ve kırılması ve dalga-ön bozulma etkileri hem mücadele ile kontrastı artıran bir teknoloji, yüksek-çözünürlüklü Intravital görüntüleme için gereklidir. İdeal olarak, bu tekniğin yeterince hızlı hücresel dinamikleri izlenmesini sağlamak için de olmalıdır. PSF sapmaları ve TPLSM uyarlanabilir optik kullanarak kontrast kaybı gerçek-zamanlı düzeltme yoğun çalışılan ve son on yılda 13,14,16-18 geliştirilmiş ve bu nedenle balistik uyarma daha iyi bir yönetime giden anki mevcut en iyi seçimdir olmuştur 14 fotonlar. Yine nedeniyle en ön düzeltme adaptif optik kullanılan yaklaşımlar dalga gerçeği iteratif ve onlar ha vardırnedeniyle dokuda kırılma indeksi yüksek heterojen küçük alanlar için (birkaç 10 x 10 mikron 2) tekrarlanmasını ettik, toplama hızı görüntüleme hücre motilitesi ve iletişim için gerekli önemli ölçüde daha düşüktür. Ayrıca, adaptif-optik olarak fiziksel sınır TPLSM yine kırınımı ile belirlenir geliştirilmiş. Aydınlatma (SPIN) ve algılama tarafında (SPADE) temporal modülasyon Mekansal modülasyonu teorik çözünürlüğü artırmak için lazer tarama mikroskopisi için uygulanacak önerilmiştir. Intravital görüntülemede pratik uygulama hala 19 gösterilmelidir kalır. Birlikte ele alındığında, yetişkin hayvanların canlı derin doku görüntüleme için çözünürlüğünü artırmak teknolojilerin gelişimi için yüksek bir talep var. Bu çalışmada, çoklu ışın çizgili-aydınlatma çoklu foton lazer-s tarama işlemini kontrol ederek uyarma desen mekansal modülasyon eldekonserve mikroskobu (MB-SI-MPLSM) 20. Uyarım kiriş kesiti uzaysal modüle edildiği yapılandırılmış aydınlatma yaklaşımlar, aksine, biz uyarma uzaysal modülasyonunu elde etmek için sadece tarama işlemini kullanır. Uzun dalga boyuna uyarım genişleterek, biz bağımsız optik, yüksek doku (örneğin lenf düğümü, serbest-saçılım yolu 47 mikron 6) saçılma derin doku mekansal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranını hem de geliştirmek mümkün biz tespit non-lineer bir sinyal, örneğin floresan, ikinci harmonik üretimi veya diğer frekans fenomen karıştırma. 900 nm eksitasyon dalga boyu kadar bu yaklaşımı kullanarak fare lenf nodu germinal merkezlerinde az molekül ölçeğinde dinamik görüntü hücresel protein yapıları edebiliyoruz. Bu nedenle, daha iyi bir anti tarama işleminde foliküler dendritik hücreler ve B hücrelerinin yüzeyi üzerinde antijen taşıyan birimleri arasındaki etkileşimin görselleştirmekikincil lenfoid organlarda immün yanıtı sırasında gen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">ATTO590 &#8211; NSH for coupling</td>
			<td style="width:99px;">ATTO Tec, Germany</td>
			<td style="width:119px;">AD-590-35</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">CD21/35 &#8211; Fab fragment &#8211; ATTO590</td>
			<td style="width:99px;">DRFZ, Berlin</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B1-8 Jk-/- EGFP+</td>
			<td style="width:99px;">Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment&#160;</td>
			<td style="width:99px;">StemmCell Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19854</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Polystyren beads (605), 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F8803</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">TriMScope I</td>
			<td style="width:99px;">LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OPO (manual version)</td>
			<td style="width:99px;">APE, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:99px;">Coherent, Duisburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td>
			<td style="width:99px;">Olympus Germany, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly resolved intravital striped-illumination microscopy of germinal centers

Intravital derin doku çoklu foton mikroskobu ile hücresel iletişimi izleme sağlığı ve hastalıkları, kalın doku örneklerinin ve organları içinde bağışıklık hücrelerinin kaderini anlamak için anahtardır. Çoklu foton mikroskopi tarama desenini ve uygun sayısal algoritmaları uygulayarak, biz daha iyi eksenel çözünürlük ve daha gelişmiş sinyal-gürültü oranı, yani kontrast, 3 kat elde etmemizi sağladı ki, bir çizgili-aydınlatma yaklaşım geliştirdi standart çok-foton mikroskopi ile karşılaştırıldığında son derece lenfoid organların doku saçılma içinde 100 mikron doku derinliği. Görüntüleme derinlik nedeniyle alan detektörlerinin kullanılması ile biraz daha düşük iken, toplama hızı hem de ışıkla ağartma ve fotohasar etkileri, standart foto çoğaltıcı dayalı tekniğe benzer. Çizgili-aydınlatma yaklaşımı kullanarak, ikincil foliküler dendritik hücreler üzerinde immün kompleks mevduat dinamiklerini gözlemlemek mümkün ̵1; germinal merkezlerinde bir kaç protein molekülünün bir seviyede.

Lenf düğümlerinde Mekansal çözünürlük Etkili nokta dağılım fonksiyonu (epsf) boyutları bir mikroskop 12 mekansal çözünürlükte gelmektedir. Biz (CCD kameralar vasıtasıyla) kurulan iki-foton lazer tarama mikroskopi teknikleri, yani alan algılama TPLSM göre bizim MB-SI-TPLSM tarafından lenf düğümlerinde kollajen liflerinin ikinci harmonik nesil sinyal alarak bu üç boyutlu fonksiyonu ölçülür ve nokta tespiti TPLSM (PMT vasıtasıyla). <p class=...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers at JoVE.com

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  Leibniz Institute.  Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü. 

Video: Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...