Çalışma tarafından desteklenen ABD Kamu Sağlığı Servisi Hibe DK-081.527, DK-072.473, Chicago Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi (Hayvan modeller Core) Üniversitesi ve Kovler Aile Vakfı hediye DK-20.595.

1. İmmünohistokimyasal Vitray Resimler Sanal Dilimleri oluşturma <ol><li> Açık StereoInvestigator. Örnek mikroskop sahibinin tutan temiz bir slayt yerleştirin ve &quot;Canlı Image&quot; sonra &quot;Acquisition&quot; (Toplama → Canlı Görüntü) tıklayarak ve Stereo Araştırmacı görselleştirmek. Her kanal için maruz kalma seviyeleri belirlemek; bizim belirli bir örnek, Kanal 2 Cy7 DAPI, Kanal 3 Cy5 için GFP, RFP, Kanal 5 Kanal 4 ve Kanal 6 için kullanılır. Maruz kalma düzeyini belirlemek için, floresan yoğunluğu görüntüler &quot;Video Histogram&quot; penceresini kullanın. Uygun floresan yoğunlukları ulaşıldığında Video Histogram sağ ucunda yoğunluğu kuyrukları kapalı. Maruz kalma seviyeleri &quot;Kamera Ayarları&quot; penceresinde değiştirilebilir. Video Histogram mikroskop odak tekerleği ile odaklı olabilir. </li><li> Sanal Dilim oluşturmadan önce, ekranda bir referans noktası örnek uzak bir noktaya tıklayarak ve daha sonra örnek dışhatlarını tıklayarak örnek kontur. Kontur tamamlandığında, sağ tıklayın ve başlangıç ​​ve bitiş noktalarını bağlamak için &quot;Kapat Kontur&quot; seçin. </li><li> Kontur kapalı sonra, örnek Sanal Dilim (Kazanç → Sanal Dilim Edinme) yakalamak. Sanal Dilim pencere seçenekleri seçin, &quot;Yüksek Hız Edinme&quot; yanı sıra yanındaki kutunun işaretini kaldırarak otomatik odaklama &quot;Kılavuzu.&quot; Dosyayı kaydedin. </li><li> Yani, siteleri sanal dilim prefocus Sanal Dilim önizleme, seçerek kalibre (sağ tıklayıp → Site Listesi Odak ekle) ve birkaç rastgele bölümleri elle odaklama gerekir. Birkaç siteleri odaklı olduğunda, Sanal Dilim başlatmak (sağ tıklayın → Prefocus ile Sanal Dilim Başlat). Ilk örnek Sanal Dilim tamamlandıktan sonra, bir sonraki kanala geçiş ve pozlamayı buna göre ayarlamak. Her kanal için 4. ve 5. adımları tekrarlayın. </li></ol> 2. Bilgisayar destekli İki Boyutlu Analizi Islets, ölçümü <ol><li> Bu görüntüler daha sonra (yani beta-alfa-ve delta-hücre popülasyonları her alanda adacık hücre kompozisyon gibi özellikleri analiz için yüklenen görüntüler hazırlar ve daha sonra rakamlarla &quot;IHCVS&quot; adında bir ImageJ makro kullanarak işlenmiş ve adacık. alan) toplam değer. Yığını, her bir kanal immünohistokimyasal dayalı ayrı bir görüntü gösterir, ImageJ ayrı kanal ayrılmıştır. Her görüntü eşiklenir görüntü 8-bit, siyah ve beyaz bir görüntü, ya da bir maske, daha sonra otomatik olarak üretilen bu tarihten sonra eşiklenir. Kompozit bir maske içine ayrı bir kanal görüntüler daha sonra aritmetik birlikte eklenir ve kompozit görüntü ImageJ dahili partikül analizi yapılır. </li><li> Tek bir beta hücre daha küçük parçacıklar hariç ROI&#39;ler sonra tanımlanır (&lt;170 mikron 2 Hara ve ark, 2003; ~ 15 mm çapında kullanılarak hesaplanmıştır). Ortaya çıkan ROI&#39;ler analiz ve ImageJ kullanarak sayısal kantifikasyon çevre (bir alanı çevreleyen bir mesafe), dairesellik (sayı, 1.0 mükemmel bir daire gösteriyor yuvarlaklık derecesi), Feret çapı (bir alanda en uzun mesafe) ve merkezi analiz her bölge için koordinatları, böylece bu parametrelerin çeşitli kombinasyonları kullanarak adacık dağılımının matematiksel analiz ve 3D grafik çizilen olabilir, veri hangi matematiksel modelleme için kullanılan olacak. Tek bir sanal dilim resim, 30 saniye içinde analiz edilir. Birden fazla resim, görüntü işleme ve analiz komut dosyası ImageJ makro dili ile desteklenen bir döngü sözdizimi içine gömerek analiz edilebilir. Döngüsü, belirli bir dizindeki tüm dosyaları açar görüntülerini analiz eder, ve bir Excel dosyası olarak yeni bir konuma sonuçları verir. </li><li> Toplu sonuçları görüntü etiketli karşılık gelen numaraları ile birlikte, alan, çevre, dairesellik, Feret çapı ve her adacık adacık merkezi gibi veri depolama, bir Excel elektronik tabloya kaydedilir. </li></ol> İşlemsel Analiz ve Histogram Kurulum <ol><li> Otomatik olarak bir kez başlatan çalıştırmak Mathematica scriptleri, yüz binlerce girdileri tutarında, toplanan elektronik tablo verilerini işlemek için kullanılır. Çalıştırılır kritik süreçlerin biri bir frekans analizi, boyut dağılımı incelemek ve aynı zamanda veri aykırı belirlemek için kullanılan bir histogram oluşturur. Komut dosyası altında, toplam adacık alan ölçülür ve diğer parametrelere göre, özellikle zaman puan veya pankreas yaş ve buna uygun bir grafik görüntülenir. </li></ol> 3. İki Boyutlu İmmünohistokimyasal Vitray Sanal Dilim Resimleri Üç Boyutlu Rekonstrüksiyon 3D Sanal Dilimleri İmar <ol><li> Komut dosyası (&quot;im_jp2_2_tiff&quot;) (yani, klasör) dizin içine kopyalayınJP2 görüntüleri içerir. Linux kabuk komut dosyası konsol içine &quot;./im_jp2_2_tiff&quot; yazarak ve sonra enter&#39;a basarak çalıştırın. Bu betik çalıştırma Sanal Dilimleri üç boyutlu yığınlarının inşaat ve ölçülmesi kullanılan biçimidir tiff resimler, otomatik olarak tüm dizinde JP2 görüntüleri dönüştürmek olacak. (Not: Türü &quot;chmod + x im_jp2_2_tiff&quot; düzgün bir şekilde çalıştırmak, böylece bir komut dosyası içine metin dosyasına dönüştürmek komut dosyasını çalıştırın değilse,) </li><li> Çekilen görüntülerin tüm JP2 tiff dosyalarını dönüştürülmüş zaman, onlar ImageJ analiz için kullanılmak üzere hazır. </li><li> ImageJ ile tüm görüntüleri, ilk örnek (Bu durumda beş görüntüler: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) açın ve bir resim (Image → Renkli → Birleştirme Kanallar) olarak bunları birleştirmek. Numunelerin her biri için bu işlemi tekrarlayın. Tüm örneklerin tek bir görüntü olarak kombine edildiğinde, &quot;Poligon Seçimleri&quot; aracı ile istenmeyen bölgelerin seçilmesi ve (Edit → doldurun) onları doldurma görüntüleri temizleyin. (Gerekirse, daha küçük bir boyuta yeniden boyutlandırma). Sonra bir RGB renk görüntü (Resim → Tip → RGB renk) her bir görüntü dönüştürün. Son olarak, gerekirse, daha da &quot;Yığın Reg&quot; eklentisi ile uyumlu hale getirilmesi bu tarihten sonra, (Yığınları Görüntü → Yığınları → Görüntü) bir yığın görüntü oluşturmak. Sonuçta, tüm pankreas adacık tüm 3D montaj kanalları birleştirilmesi ve daha sonra görüntüleri birleştirerek oluşturur. Görüntülemek için &quot;3B görüntüleyici.&quot; Daha sonra &quot;Eklentiler&quot; tıklayın ve </li></ol> 4. Islet Haritalama Görüntü Yığınları Toplama <ol><li> Mikroskop altında tüm montaj pankreas adacık bulunurdu. </li><li> Slidebook yazılımını açın. &quot;Ctrl + Shift + E&quot; tuşuna basarak &quot;Yakalama ve Kontrol Focus&quot; Erişim &quot;Odaklama Denetimi&quot; penceresinde, adacık boyutuna göre, 20X veya 40X, hedef olarak belirlemiştir. Bir suya daldırma objektif lens kullanıyorsanız su uygulayın. </li><li> &quot;Bin&quot;, &quot;Focus Denetimleri&quot; penceresi 2X ve Kullanıcı1 Filtre Set set, adacıklar bulmak için mikroskop mercek kullanmak için. &quot;Emisyon Seçimi&quot;,% 100 Eyes ve 1 Nötr Yoğunluk olarak ayarlanması gerekir. Sonra &quot;GFP ey&quot; ni ve &quot;Açık Fluor.&quot; </li><li> Slidebook örnek görselleştirmek için, Focus, pencere Kontrolleri ve &quot;Live&quot; tıklayın ve &quot;Filtre Set&quot; anahtarı &quot;GFP ds.&quot; Kamera 1 pencerede adacık merkezi yanı sıra olası joystick&#39;i kullanın. Derinliğe kadar adacık hücreleri kolayca ayırt edilebilir merkezine yakın bir yere odaklanın. </li><li> &quot;Odak Kontroller Pencere&quot;, &quot;Z sekmesinde&quot; i seçin.. Bir referans noktası olarak mevcut derinliği ayarlamak için pencerenin sol üst köşesinde tıklayın. Adacık özellikleri açıkça ayırt edilebilecek en üst derinliği gidin ve kapsamı denetimi kullanın &quot;En iyi ayarlayın.&quot; Adacık altına gidin ve &quot;Set Alt.&quot; Referans noktası geri dönmek için &quot;git&quot; tıklayın. </li><li> Yakalama penceresi, &quot;2X&quot; &quot;Bin Faktörü&quot; ve &quot;Filtre Seti&quot; &quot;Canlı.&quot; &quot;Yakala Türü&quot;, &quot;3D&quot; (ve sadece 3D) ayarlayın. Pencerenin sağ tarafında, &quot;Üst ve Alt Pozisyonlar kullanın&quot; seçeneğine tıklayın.. &quot;Yakalama Noktası Sonrası Referans dön.&quot; &quot;Adım Boyutu&quot; Set &quot;3&quot; </li><li> Altında &quot;Filtre Box Set&quot; seçeneğini seçin DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU ve Cy5 DSU Her biri için, &quot;Pozlama ayarlayın,&quot; sonra &quot;Test&quot; Seçilen pozlama uygun olduğundan emin olmak için tıklayın altında &quot;En İyi Bul&quot; tıklayın. Yakalama başlamak için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Yakalama işlemi tamamlandığında, gerektiği gibi seviyelerini ayarlamak ve beyaz RFP için görüntülenen renk değiştirmek. Slayt kaydetme ve → İhracat → TIFF serisi gidin. Sonunda bir çizgi ile slayt adını yazın ve kaydedin. Düzinelerce bireysel TIFF dosyası oluşturulur, her adacık görüntü yığını ayrı bir klasörde tutmak için yararlı olabilir. </li></ol> Görüntü Yığınları eşleme <ol><li> Stereo Araştırmacı açın. Görüntü yığınları (Dosya → Görüntü Yığın → Görüntü Yığın Aç) açarak görüntü gözünüzde canlandırın. &quot;Görüntü Ölçeklendirme menüsü 3.00 mikron,&quot; set &quot;Görüntüler Arası Mesafe&quot;. Slidebook 2X binning düzeltmek için, &quot;Baskın X ve Y Ölçekleme&quot; ve Ölçek &quot;X ve Y Kaynak Belirtilmemiş Kullanıcı&quot; seçeneğini seçin ve X ve Y. hem 0.65 girin </li><li> Ilgi adacık ortasında tıklayarak Merkezi görüntü &quot;Makro penceresi.&quot; Uygun bir kalem kullanarak en az bir hücre işaretleyin. Beta-hücrelerinde yeşil görünür, alfa hücreleri kırmızı görünecektir ve delta hücreleri, beyaz görünecektir; kullanım Marker 2 (içi boş daire), alfa hücreleri işaretlemek için beta hücreleri, Marker 5 (içi boş bir üçgen) işaretlemek için, Marker 6 ( delta hücreleri içi boş bir üçgen). Hücreler örnek DAPI ile boyanmış olup olmadığını mavi görünecektir çekirdeği, merkezi işaretlenmiş olmalıdır. </li><li> En az bir hücre işaretlenmiş edildikten sonra, üst menüdeki simgesini kullanarak &quot;Ortogonal Görünüm&quot; gösterilecek. &quot;Z-Filter&quot; ve &quot;Simetrik.&quot; Aralığıhould 15,00 ayarlanması gerekir. 0.0 Z düzeyinde başlayarak, fare tekerleğini kullanarak adacık ilerlemek ve uygun marker ile her hücre işareti. Her hücre derinliği merkezinde sadece bir kez işaretlenmiş olmalıdır. Z-seviyesi her işaretleme, &quot;Z-filtre&quot; onay kutusunu işaretlenmemiş olabilir bittikten sonra. Bu Z seviyeleri tüm belirteçlerin gösterecektir. </li><li> Her hücrede işaretlenmiş edildiğinde, &quot;DAT&quot; dosyası olarak kaydedin, sonra Dosya → İhracat İzleme gidin. Izleme &quot;TXT&quot; dosya olarak kaydedin. &quot;Yeni Veri Dosyası&quot; yeni adacıklar haritaya denemeden önce çalışma alanını temizlemek için tıklayın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Sanal Dilimleri immünohistokimyasal lekeli bir pankreas örnek hazırlanması (her ikisi birlikte adacıklar (Şekil 1A) ve ayrı ayrı ayrı kanallarda, bütün pankreas (alfa, beta ve delta hücreleri) endokrin hücrelerinin tümünü incelemek için bir olanak sağlar Şekil 1B). Büyük ölçekli veri bir kitle analizi, bilgisayar programları ve scriptler yardımı ile bu sanal Dilimleri yapılabilir. Özellikle, kompozit maskeleri (Şekil 1C) bir parçacık analizi, adacık alanı, çevre (bir alanı çevreleyen mesafe), dairesellik (yuvarlaklık derecesi, 1.0 mükemmel bir daire temsil eder) gibi parametreleri içeren bir istatistik tablosu olarak çıktı ve her adacık Feret çapı (bir alanda en uzun mesafe) (Şekil 1D) tespit edildi. Büyük ölçekli üretiminde toplam adacık sayısı ve büyüklüğü dağılımı histogramlar alfa-beta ve delta-hücre alanlarda ayrıntılı bir karşılaştırma yanı sıra bu görüntüleri sonuçlarının analizi. Buna ek olarak, her bir Sanal Dilim yaklaşık 5 mm derinlikte alınır ve tüm bireysel 2D Sanal Dilimler daha tüm pankreas örnek bir 3D yeniden oluşturmak için yığılmış. Islet haritalama 3D adacıklar yakalama değil, sadece başka bir örneğini gösterir, ancak aynı zamanda bilgisayar destekli detaylı analiz. Islet haritalama ayrı adacıklar yakalama (Şekil 2A) ve markalama sonraki oluşur alfa-beta ve delta-hücreleri çeşitli Z-uçakları (Şekil 2B) 3D bir adacık (Şekil 2C, D) görselleştirmek için. Otomatik matematiksel analiz eşlenen adacık hücre-hücre mesafeleri (Şekil 2E) ve hücre-hücre mesafe dağılımları (Şekil 2F) kümülatif olasılıkları da dahil olmak üzere kendi hücresel yapısı ve mimari, görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Sanal Dilim kullanarak adacık dağıtım Büyük ölçekli yakalama ve analizi. A. Sanal dilim bir insan pankreas bölümünde görüntüleyebilirsiniz. a. Immünohistokimyasal boyama (yeşil) insülin, glukagon (kırmızı), somatostatin (beyaz) ve DAPI (mavi). b. Otomatik eşikleme sonra 8-bit maskesi dönüştürülür. Kutulu alan her kanal BB Views büyütülmüş. a. delta-hücreleri, b. beta-hücrelerinin, c. alfa-hücreleri ve d. kompozit görüntü birleşti. C. Partikül analizi kompozit maske üzerine yapıldı. Küçük hücre kümeleri dahil olmak üzere her adacık yapısı (mavi vurgulamak) numaralı olduğunu unutmayın. C&#39;de gösterildiği etiketleri karşılık kimlikleri, bireysel yapılar için ölçülen çeşitli parametreler D. İstatistikler tablo, <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 2 immünohistokimyasal Sanal Dilim analizi. Şekil 1 A. 3D dağılım arsa alanı, dairesellik ve feret çapı gibi parametrelerin büyüklüğü ve şekli her adacık dağılımını gösteren. Şekil 1 B. 3D scatter plot hücresel adacık kompozisyon ve boyutunu gösterir. Lognormal olasılık yoğunluk dağılımı Şekil 1 C. tüm insanlık bölüm analizi Islet boyutu dağılımı takılmıştır. D. hücresel bileşim oranlarının matematiksel analizi (beta-hücrelerinin yeşil, mavi, kırmızı ve delta-hücreleri alfa-hücreleri) Şekil 1&#39;de her adacık etkili çapı bin. E. a. Rastgele örnekleme immünohistokimyasal analiz Islet boyutu dağılımı (solda). Sanal dilim analiz Islet boyutu dağılımı (sağda). b. Rastgele örnekleme immünohistokimyasal analizi (kırmızı) ve sanal dilim (mavi) log-normal arsa karşılaştırılması. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Islet haritalama ve hücresel yapısı ve mimari matematiksel analizi. A: Ekran yakalama 3D Stereo Araştırmacı içine yüklenen bir insan adacık görüntüleri yeniden inşa yığını (kırmızı, yeşil, alfa-hücreleri beta-hücrelerinin, delta-beyaz hücreleri ve mavi çekirdekleri) tek bir odak düzlemli . B: Floresan görüntü (solda) ve üç farklı odak düzlemleri ilgili eşlenen verileri (sağda), 10 mikron aralıklarla gösterilmiştir. C: 3D yeniden inşa adacık harita verileri Temsilcisi. D: 3 boyutlu rekonstrüksiyon adacık haritalama ile elde edilen koordinatlara göre çeyrek dilimlenmiş adacık. E: hücresel yapısı ve mimari matematiksel analizi. Left. Göreli frekans tek bir hücre popülasyonu iki hücre arasındaki hücre-hücre mesafelerin. Sağ. Hücre-hücre iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki mesafelerin Göreli frekans. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) testi. Sol. Kümülatif olasılıkları hücre-hücre-alfa alfa-uzaktan dağılımları, beta-beta ve delta-delta hücreleri. Sağ. KS ilgili üç kümülatif olasılıkları mesafeler.

<ol>
	<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l., Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture+-+a+comparative+study.">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li></ol>

Büyük ölçekli bilgisayar destekli görselleştirme ve miktar burada pankreas adacık çalışmalarında dört temel nokta göze sundu: (1) büyük ölçekli pankreas örneklerin analizi, genel adacık boyut dağılımı ve adacık mimarisi kapsamlı bir bakış sağlar. (2) hücresel bileşimi ve mimarinin 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve matematiksel analiz, bir adacık içerisinde endokrin hücreler mekansal düzenleme inceleme daha kolaylaştırır. (3) ve çeşitli patofizyolojik koşullar altında aynı türün fa...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus </td>
<td>IX-81
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture

Pankreas adacık beta-hücrelerinin (insülin), alfa-hücrelerinin (glukagon) ve delta-ekzokrin dokularda gömülü ve 1 oluşturan hücreleri (somatostatin) gibi birçok hormon salgılayan endokrin hücrelerde oluşan benzersiz bir mikro-organ- tüm pankreas% 2. Vücut ve pankreas ağırlığı arasında yakın bir korelasyon vardır. Toplam beta hücre kitlesinin de vücutta insülin talebi telafi etmek için orantılı olarak artar. Bu orantılı genişleme adacık boyutu dağılımı kaçar. Büyük hayvanların insanlar gibi, bu mikro-organ işlevsel olması için belirli bir boyut sınırı olduğunu düşündüren, fare ile benzer bir adacık boyutu dağılımları paylaşıyoruz. Orantılı olarak daha büyük adacıklar oluşturmak için büyük hayvan pancreata yetersizlik adacık sayısında bir artış ve genel adacık boyutu dağılımı büyük adacıklar oranında bir artış ile telafi edilmektedir. Ayrıca, adacık hücre yapısı ve mimarisi, farklı türler arasında ve aynı zamanda çeşitli patofizyolojik koşullar altında aynı türün içinde çarpıcı bir plastisite sergilerler. Bu çalışmada, geniş ve heterojen veri toplama ve analiz için dinamik biyolojik süreçlerin ve karmaşık yapılara sahip çalışmaya izin analitik süreçlerin otomasyonu kolaylaştırmak için biyolojik görüntü verilerini analiz için yeni yaklaşımlar açıklanmaktadır. Böyle çalışmalar tarafsız örnekleme teknik zorluklar nedeniyle engellendiği ve büyük ölçekli veri üreten adacık biyoloji biyolojik süreçlerinin karmaşıklığı tam olarak yakalamak için ayarlar var. Burada örneklerin sınırlı sayıda (ya da örnek toplama en aza indirmek için) ve standart deneysel ayarları içinde tarafsız &quot;temsili&quot; verileri toplamak ve adacık karmaşık üç boyutlu yapısını tam olarak analiz etmek için yöntemler göstermektedir. Bilgisayar destekli otomasyon, büyük ölçekli veri setleri toplama ve analiz sağlar ve aynı zamanda verilerin tarafsız bir yorumlama sağlar. Ayrıca, adacık boyutu dağılımı ve mekansal koordinatları (yani X, Y, Z-pozisyonlar) kesin kantifikasyon sadece pankreas adacık yapısı ve bileşimi doğru bir görselleştirme için değil, aynı zamanda bize, geliştirme ve adaptasyon sırasında desen değiştiren koşulları tanımlamanıza olanak sağlar matematiksel modelleme yoluyla. Bu çalışmada geliştirilen yöntemlerin yanı sıra birçok diğer sistemlerin ve organizmaların çalışmaları için geçerli.

Watch this Scientific Journal Video about Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture at JoVE.com

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.

Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Görüntüleme.  University of Chicago. Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.

Video: Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biyoloji

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

Farelerde, pankreatik beta-hücre Kütle yerinde Niceleme

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...