Dr P. Lindström ob / ob farelere sağlamak için kabul edilmektedir. J. Lehtonen düzenleme ile yardım için video prodüksiyon ve J. Gilbert yardım için kabul edilmektedir. (JS ve: Bu çalışma Diyabet Araştırma Enstitüsü Vakfı (AP), Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (AP ve UA), Avrupa Komisyonu (. CP-IP 228933-2 FP-7, hayır Hibe anlaşması) hibe tarafından desteklenen UA), Kempe Vakıflar, Umea Üniversitesi ve UA ile İsveç araştırma konseyi

1. Numune Hazırlama ve Tarama 1.1 Numune hazırlama 7. Daha önce tarif edildiği gibi Aşağıdaki prosedür, temelde gerçekleştirilir. <ol><li> Pankreas Harvest. Proteolitik degradasyona önlemek için buz gibi soğuk PBS kullanın. </li><li> 2-3 saat için buz üzerinde PBS içinde% 4 PFA doku düzeltildi. Loblar fiksasyon sırasında &quot;yayılmış&quot; olduğundan emin olun. Bu rekonstrüksiyon sonrası anatomik yerlerinden belirlenmesini kolaylaştıracaktır. </li><li> 30 dakika boyunca ilave PBS içinde yıkanır. </li><li> Metanol içinde kademeli olarak pankreas (33,% 66,% 100), 15 dakika / adım kurutmak. Bu (adım 5) bleaching sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirir ve (bkz: adım 7) donma-çözülme sırasında hücre tahribatını önler. </li><li> H2O: 2: DMSO endojen doku floresan gidermek için 24 saat oda sıcaklığında bir 02:01:03 oranında tampon ağartma taze hazırlanmış MeOH içinde doku inkübe edin. Yeni bleachi daha büyük örnekler, değişim içinBaşka bir 24 saat için ng tampon ve inkübe. </li><li> ON, aşırı MeOH içinde yıkayın. </li><li> -80 En az 5 döngü için donma-çözülme ° C - RT antikor penetrasyon kolaylaştırmak için. </li><li> TBST (33,% 66,% 100), 15 dak / adıma geri adım adım rehidrate. </li><li> Oda sıcaklığında 12-24 saat boyunca% 10 serum (tercihen ikincil antikor oluşturulduğu aynı türden),% 5 DMSO ve% 0.01 Naaz ile TBST içinde Blok </li><li> RT, 48 saat süreyle tampon engelleme primer antikorlar ile inkübe, daha geniş örneklem (Burada kullanılan antikorların reaktiflerin tabloda listelenmiştir) için 72 saat kadar uzanır. </li><li> ON, aşırı TBST yıkayın. </li><li> 48 saat boyunca floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe, RT, büyük numuneler için 72 saat kadar uzanır. </li><li> ON, aşırı TBST yıkayın. </li></ol> 1.2 Aşağıdaki yordam (bkz. Şekil 7 agaroz örneklem mount ve özel yapılmış numune tutucu takmanız açıklamaktadır) Tarama OPT öncesinde. <ol><li> Hörnblad ve ark 3 Şekil 3A&#39;ya uygun olarak, dalak duodenum ve mide loblar ayırın. Loblar arasındaki ilişki ileri Hörnblad ark 11&#39;de açıklanmıştır. </li><li> % 1.5 (w / v) dH 2 O, filtre, düşük erime sıcaklığına agaroz hazırlayın, 37 soğumasını bekleyin ° C ve deterjan aşındırmak ve buz üzerinde agaroz-gömmeden önce kabarcıkları dH 2 O doku durulayın. </li><li> Senin örnek parça bir agaroz bloğu kesip ve numune ve agaroz tabanı arasında bir ~ 1 cm boşluk bırakın. Işık saçılması azaltmak için agaroz blok keskin kenarları (≤ 90 °) kesin. </li><li> Her bir zaman adım arasında denge sağlaması için izin MeOH (33, 66%,% 100) kademeli olarak örnek kurutmak. Örnek lavabolar zaman dengelenmiş olarak kabul edilir. </li><li> Benzil Benz: benzil alkol 1:2 çözelti içinde örnek temizlemeOATE (Babb) şeffaf hale gelinceye kadar. Ek 12 saat için Exchange Babb çözümü ve inkübe. </li><li> Numune tutucuya temizlenmiş numune konumlandırın ve tutucu flanş delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk ile 2 iğneler takarak sabitleyin. </li><li> Babb temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir küvet içine daldırın ve tarayıcı içinde örnek yerleştirin. Pancreata bir dizi karşılaştırarak aynı büyütme her tarama için kullanılmalıdır. Büyütme serisinin en büyük numune için optimize edilmelidir. </li></ol> AR at örneğinin 1.3 Konumlandırma Aşağıdaki protokolü tam COM-AR algoritması kullanılarak bir örnek yerleştirmek için prosedürü açıklar. ROI tüm numune bulunduğunda bu prosedür geçerlidir. Algoritmalar ayrıntılı açıklamaları için, Cheddad ark 2 bakın. <ol><li> Bot için iki pozisyonda örnek görüntülerini Edinmeh anatomisi ve sinyal kanalları. En büyük projeksiyon alanı, ve 90 ° (Z ekseni ile ilişkili olan) konum 2 de sergileyen 0 ° (X-ekseni ile ilişkili), at Pozisyon 1. Biz anatomi görselleştirmek için GFP kanalı kullanıyor. </li><li> Eşik ROI&#39;ye anatomi görüntüleri beklenti-maksimizasyonu (EM) algoritması uygulayın. </li><li> 0 ° ve 90 ° projeksiyonları için 2. adımda elde ikili görüntülerin COM noktaları (x-koordinatları) hesaplayın. </li><li> 0 ° ve sinyal kanalı 90 ° görüntüleri Adım 3&#39;te hesaplanan tanımlanan COM noktadan geçen dikey bir çizgi Superimpose. </li><li> Referanslar View Saha merkez çizgisinin örnek bulundu COM puan geçer böylece örnek hareket olarak 4. adımda elde edilen görüntüleri kullanın. </li></ol> 1.4 Tarama <ol><li> Satürasyonu olmadan mümkün gürültü oranı en yüksek sinyal elde etmek için etki süreleri ayarlamaprojeksiyon görüntüleri ting herhangi bir yerlerde. Taranacak tüm kanallar için tekrarlayın. </li><li> Taranacak ilk floresans kanal için filtre ayarı seçin. Kısa λ floroforlar gelen salma uzun λ florofor ile tahrik ve böylece resim ağartma neden olabilir. Bu olasılığı en aza indirmek için, ilk uzun uyarma λ ile fluorofor tarayın. </li><li> Örnek aydınlatmak ve her kanal için dikey eksen boyunca örnek dönen, 360 ° &#39;den fazla floresan sinyal toplamak için deklanşör açın. NUR-OPT kurulumu için kullanılan adım açısı 0,9 ° ve Bioptonics 3001 tarayıcı 0,45 ° için. </li><li> Sonraki kanal için uygun filtreyi seçin ve yukarıdaki işlemleri. </li></ol> 2. Hesaplamalı İşleme ve Yeniden Yapılanma 2.1 Post-edinimi kayma algılama ve düzeltme (A-değeri ayarlama) Projeksiyon tomografide, genel olarak gerekliöncesinde yeniden dönme ekseni boyunca ince ayar görüntülerin konumuna projeksiyonlarına bir post-hizalama değerini atamak. Bununla birlikte, optik eksen yönünde kamera açısını küçük bir sapma numune uzunluğu boyunca düzgün olmayan A-değerlerine neden olabilir ve böylece geometrik bozulma meydana getirir. Bu tür bozulmayı önlemek için, tüm numune boyunca doğru ve birleşik sonrası uyum değeri (A-değeri) bulmak için bir hesaplama yöntemi 2 uygulanabilir. <ol><li> 8 piksel yüksekliğinde blok içine 0 azından belirli bir sinyal projeksiyon ° ve 180 ° bölmek ve her blok arasındaki x-ekseni boyunca kayması (A-değeri) hesaplamak için dönüşümü bir ayrık Fourier kullanın. </li><li> Numune uzunluğu boyunca x-ekseni-shift eğimi tanımlayan açısı θ &#39;, hesaplamak yardım etmek ve bir dönme merkez noktası bulmak için doğrusal en küçük kareler regresyon uygulayın. </li><li> Tüm Proje çevirerek tarama sırasında uzaklaşmaları için düzeltindönme merkez noktası etrafında ctions θ &#39;/ 2. </li></ol> 2.2 Kontrast sınırlı adaptif histogram eşitleme (CLAHE) Rekonstrüksiyon ve / veya kantitatif değerlendirmeler için segmentasyon sırasında &quot;üzerinden eşiklenir&quot; için risk altındadırlar çok zayıf sinyaller, sergilenmesi nesneleri (adacık) tespiti ve segmentasyonu kolaylaştırmak için, bir CLAHE algoritma projeksiyon görüntüleri uygulanabilir. CLAHE işlem iki ana yoğunluk dönüşümleri ile gerçekleştirilir: <ol><li> Lokal kontrast tahmin ve projeksiyon görüntü örtüşmeyen blok içinde dengelenir. </li><li> Şiddetleri sonra bilinear enterpolasyon yoluyla bloklar arasındaki sınır bölgelerinde normalize edilmiştir. </li></ol> Adı kontrast sınırlı görüntüde doyurarak piksel önlemek için ayarlanır klibi limiti ifade eder. Bu protokolde, MATLAB yerleşik işlevi &quot;adapthisteq&quot; varsayılan c ile kullanılan ve uygulanan<html> 0,01 dudak sınırı ve 256 boyutunda döşeme. Not, optimum döşeme boyutunu ampirik olarak test edilmesi ve analiz örneğinin bağlı olarak değişebilir ihtiyacı var. Algoritması ve örnekler ile ilgili daha fazla detay Hörnblad ve ark 3 bulunabilir. Not! Yukarıdaki hesaplama işlem adımlarını standart algoritmalar üzerine inşa edilir ve MATLAB (Mathworks) yürütülür (COM-AR, A-Değer tuning ve CLAHE dahil 1,3-2,2 bakınız). 2.3 tomografi yapılandırma ve iso-yüzey işleme <ol><li> Süzülmüş bir arka projeksiyon algoritması kullanarak, düzeltilmiş ve normalleştirilmiş görüntüler şimdi birleşik kayma kompanzasyonu ve dinamik aralık optimizasyonu için asgari gerekliliktir yeniden inşa edilebilir. Bu protokol, tüm yeniden inşa NRecon yazılımı (Skyscan), sürüm 1.6.8 (mevcut süzülmüş geri projeksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Paralel ışın geometrisinde görüntüleme kurulum uygulanan sürece Not resimli bir nesnenin büyütme objektifin odak noktası uzaklığı bağlıdır. Bu nedenle, NRecon yazılım için bir projeksiyon dataset alırken bunun beraberindeki kaynak mesafesi (mm) ve tarayıcı dönme yönünü (saat yönünün tersine girdi &quot;cc&quot; için ve saat girişi &quot;cw&quot; için) doğru nesne dahil etmek önemlidir yeniden yapılanma sırasında koni ışın kaynaklı eserler önlemek için, günlük dosyası. </li><li> Elde edilen sanal bölümler yığınını görselleştirmek ve ölçmek için, Imaris veya Volocity gibi uygun görüntü işleme yazılımı kullanarak 3D iso-yüzeyler oluşturur. </li></ol> Mürin adacık izolasyonu ve transplantasyonu yorumlanan protokol çerçevesinde Diyabet Araştırma Enstitüsü&#39;nün Preklinik Hücre İşleme ve Translasyonel Model Çekirdek gerçekleştirilen ve Miam Üniversitesi tarafından onaylanmışi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu. Hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar için etik kurul, Kuzey İsveç, hayvanları kapsayan diğer tüm deneyler onayladı.

<ol>
	<li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography.">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li><li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution.">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li><li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+imaging+islets:+recent+advances+and+future+prospects.">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography.">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas.">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes.">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo.">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li><li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas.">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753 (2011).</li><li>Lindstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+(ob/ob+Mice).">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

OPT görüntüleme için anlatılan teknikleri fare pankreas hacmi boyunca mekansal ve niceliksel parametreler ekstraksiyon sağlar. Mezoskopik görüntüleme, bu tür için ulaşılabilir çözünürlük sınırlamaları nedeniyle belirtmek gerekir ki en görüntüleme yöntemlerinin yanı, daha büyük numune düşük çözünürlük (daha yüksek çözünürlüklü CCD kullanımı OPT tarama çözünürlüğünü artırmak gerekir rağmen) . Dolayısıyla, sağlam pankreas fare lobların değerlendirilmesi için, şu anda teknik olmasına rağmen yakın (yaklaşık 15-20 mikron) 7 Tek hücre çözümü sağlamaz. Yine, fare pankreas BCM dağılımının çıkarılması için protokollerinin tam morfometri 3,13 sayma örneğin noktası elde eşleşen fazla Unutulmamalıdır ki veri sağladıklarını CLAHE protokolün uygulanması önemli ölçüde daha fazla adacıktan tespiti için izin verir ancak bu adacıklar genellikle daha küçük ve katkısı yokte büyük ölçüde tüm β-hücre hacmine. Katılan immünohistokimyasal protokolleri (en fazla iki hafta) nispeten uzundur, ancak numune hazırlama için zaman gerçek eller kısa ve dolayısıyla tekniği de hayvanların 9 büyük kohort çalışması için uygun olmasıdır. Heterojen dağılımları potansiyel soruşturma için bir odak noktası ise, bakım fiksasyon ilgilendiren ve pankreatik doku olumsuz bir şekilde sabit hale gelir ve düz (&quot;yaymak&quot; olduğunu önlemek için montaj adımları alınması gerektiği vurgulanmalıdır doku) bağlama bu değerlendirmede kolaylaştırmak için çaba olmalıdır. OPT gerçekleştirerek önemli bir konu da örnek COM dönme ekseni sabit ve tarama işlemi sırasında, yatay veya dikey, hareket etmediğinden olmasıdır. Bu nedenle attachi için istikrarlı mekanik kurulum ve iyi işleyen bir sisteme sahip olmak esastırng örnek. Biz yeni bir bağlama (Şekil 7) oluşturarak bu sorunu çözdü. Paralel geometri bizim NUR-OPT veya sırt ve kaydedilen projeksiyon görüntüleri periferik nesnelerin önünde pozisyon arasındaki dikey bir kayma olduğu tespit edildi Bioptonics 3001 tarayıcı için doğru değildi. (2.3.1 bakınız) ilgili tarayıcının log dosyasına kaynak mesafe nesnesi ayarlayarak önemli ölçüde bizim veri kalitesini artırmak olabilir ve belirli bir öneme sahiptir projeksiyon görüntüleri en uzak kenarlarında geometrik bozulmaları düzeltmek zaman Daha büyük numuneler değerlendirilmesi. Geçerli protokol, biz üç farklı belirli kanallar ve sağlam pankreas hazırlıkları değerlendirmelerinde bir &quot;anatomisi&quot; kanal görüntülenmesine izin filtre setleri bir öneri sunmak. Açıkçası bu ayarları floresan tüm formları olduğu gibi, daha iyi olmasına rağmen, belirli bir çalışma için kullanılan florokromlar uygun modüle olabiliryüzde mikroskopi, sinyal sızdırma-yoluyla potansiyel tehlike dikkatle değerlendirilmelidir. 750 nm ve üzeri heyecanlıyız florokromlar ile insülin etiketli adacık çalışma henüz bizim set up kullandığı metal halide lamba kullanarak bize mümkün olmamıştır. Bu alternatif ışık kaynağının (örneğin diyot lazerler) ile birlikte uygun dalga boylarında da yüksek kuantum verimliliği sahip bir kamera daha NIR-OPT potansiyelini artırmak ve daha yüksek dalga boylarında görüntüleme için izin verebilecek mümkündür. OPT görüntüleme mm-cm ölçekte biyomedikal numune mekansal ve niceliksel olarak değerlendirilmesi için oldukça çok yönlü bir tekniktir. Burada sunulan protokol pankreas / diyabet araştırma amacı için geliştirilmiş olmasına rağmen, diğer türler, örnek tipine ve belirteçleri üzerine araştırma çevirmek mümkün olmalıdır. NUR-OPT görüntüleme f, sağlam pankreas hazırlıkları birkaç farklı kanallar görselleştirmek için potansiyel olarakurther sürece bu kontrast ajanlar da OPT tarafından algılanamaz bir fluorofor taşımak için tasarlanmış olabilir gibi diğer görüntüleme yöntemleri ile non-invaziv değerlendirme amaçlı kontrast maddelerin alımını özgüllüğünü değerlendirmek için bir araç olarak bir potansiyele sahiptir.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Β-üreten hücrelerin insülin kan şekeri dengesini kontrol etmek için vücudun yeteneğini için anahtardır. Bu nedenle, pankreas BCM dağıtım değerlendirmeler klinik öncesi diyabet araştırma birçok alanda zorunludur. Örneğin terapötik rejimlerin değerlendirmelerde, hastalık için kemirgen modellerinde endokrin hücre farklılaşması veya diyabet etiyolojisi çalışmaları hedeflenen gen ablasyon etkisi sık sık bu tür analizler bağlıdır. Geleneksel olarak, bu tür değerlendirmeler boyut ve pankreas kompleks anatomik anayasasını dolayı yapmak zor olan zaman alıcı stereolojik yaklaşımlar yararlanmıştır. Şu anda en yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlar (genellikle optik), kemirgenler tüm pankreas görüntüleme için yeterli penetrasyon derinliği vermeyin. Tersine, onların penetrasyon derinliği (genellikle nükleer) ile sınırlı değildir görüntüleme yaklaşımları tam BCM dağılımı gidermek için yoksul kararlılık sağlamak ve engellenmektedir4,5 yeterli kontrast maddelerin eksikliği. Optik projeksiyon tomografi cm çaplı 6 mm biyomedikal numunelerin yüksek çözünürlüklü değerlendirmeler sağlayan bir 3D görüntüleme yöntemidir. Bu vesile ile, mekansal konumu ve Langerhans adacıkları ifade bireyin insülin hacmi hakkında bilgi normal ve diyabetik farelerde 3,7-10 yılında pankreas hacmi boyunca elde edilebilir. Bu çalışmanın amacı, daha pankreatik β-hücrelerinin değerlendirilmesi için bu tekniğin kapasitesini artırmak için; diğer dokular, diğer pankreatik bileşenlerin (örneğin hücre tipleri infiltratif gibi) onların ilişkisi içine ve büyük aşılı kendi endojen dağılımı, önceden mümkün olandan pankreas hazırlıkları. Yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi (NUR-OPT) kurulumu Protokoller, yukarı Sharpe tarafından tanımlanan orijinal kümesine dayanan OPT tarayıcının altında ise <earalığında yakın kızılötesi görüntüleme için uyarlanmış m&gt; 1 ve diğerleri, açıklanan ve kullanılmaktadır. Fare pankreas (BCM gibi) tek bir kanal değerlendirilmesi için, SkyScan 3001 (Bioptonics) tarayıcı kullanılabilir. 650nm Yukarıdaki dalga boylarında bir civa ark lambası daha yüksek uyarma enerjisi sağlayan metal halide lamba, eksitasyon ışığı sağlar. Işık sıvı ışık kılavuzu ile aktarılır. Florokromlar ve NIR floresan görüntüleme ve kanal ayırma için bant geçiş filtresi yararlı bir kombinasyon Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Yayılan ışık NUR spektrumunda yüksek kuantum verimliliği ile, arka aydınlatmalı CCD kamera ile tespit edilir. OPT tarama bir kamerayı kontrol LabView platformu ve step motor kullanılarak otomatik olarak yapılır. Bozulmamış sıçan pancreata, korunmuş bir gümüş kaplı ayna ve bir küvet büyük boyutu olarak örnek desteklemek için kullanılır. Son olarak, bir numune tutucu istenmeyen dikey movemen ortadan kaldırırTarama sırasında numunenin ts tasarlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> % 30 H2O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Benzil Alkol </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzil Benzoat </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük meltingpoint agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehid (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-ASMA-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Tavşan anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Guinea Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Eşek karşıtı GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti Rb-DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11076 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21076 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21039 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Tarayıcı </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stereomikroskopta </td></tr><tr><td> Leica Amaç 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adaptörü 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> Halide EL6000 Metal </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Sıvı Işık Kılavuzu </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52.5 mm </td></tr><tr><td> Ayna </td><td> Edmund Optik </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Teknoloji </td><td> DU934N-BV </td><td> Arka aydınlatmalı CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 41021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 41022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 49037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sefaroz boncukları </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose Fast Flow 4 </td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Sodyum azid 0.1 M çözelti </td></tr></tbody></table>

near infrared optical projection tomography for assessments of &beta;-cell mass distribution in diabetes research

Yakın kızılötesi (NIR) spektrum görüntüleme yeteneğini eklemek için OPT adapte olarak, biz burada böyle sıçan pankreas pankreas dokusu görüntüsü daha büyük cisimlerin imkanı göstermek ve kanal sayısı (hücre tipi) olabilir artırmak için tek bir örnek olarak incelenecektir. ; Yazı için 2 / geliştirilmiş algoritmalar bir örneğinin (bizim durumumuzda pankreas) dönme ekseninde kütle merkezi (COM) (AR) 2 1 / doğru konumlandırma: Biz daha verin hesaplama araçlarını bir dizi uygulama tarif -hizalama tomografik geriçatma 2 ve 3 / OPT tabanlı BCM tespitler 3 gürültü oranları sinyal artırmak için yoğunluğu dengeleme için bir protokol sırasında geometrik bozulmaları önler ayarlama. Ayrıca, görüntü edinimi sırasında numune kasıtsız hareketleri riskini en aza indiren bir numune tutucu açıklar. Birlikte, bu protokolleri BCM dağıtım ve oth değerlendirmelerini sağlamaker özellikleri, Langerhans adacıkları bireyin düzeyine çözünürlüğe sahip, sağlam pancreata veya diğer organlara (adacık nakli çalışmaları gibi) hacmi boyunca aşağı yapılmalıdır.

Geçerli yazıda ekstraksiyon ve NUR-OPT (Şekil 1) kullanarak kemirgen pancreata BCM veri (ve diğer dokular) hesaplama işlem için bir protokol açıklar. Şekil 2 de gösterildiği gibi, pankreas dokusu numunesi autofluorescense olarak belirgin bir NIR spektrum azalmıştır beklenmektedir. Langerhans insülin etiketli adacıklar değerlendirme oranı: Bu gürültü ortalama sinyal önemli bir artış (N S) yol açar. Olarak burada tarif spektrum, NUR bölümünde görüntüleme için OPT uyarlamalarına göre, en az üç belirli kanalları yeterli S ile görüntülendi olabilir: N oranı farklı olan fare pankreas hacmi boyunca antikor etiketli hücre tipleri değerlendirmelerini sağlamak için kanal ayırma (Şekil 3 ve 4&#39;e bakınız). Diyabetojenik süreçler ve / veya genel olarak BCM değerlendirmelerin görüntüleme için uygulanan tekniğin böylece bir görselleştirme ve ölçümü için izin verirÇevre ve / veya hücre tipleri (bkz. Şekil 4) etkileşim göre insülin pozitif alanlar. Bu tür değerlendirmeler onun fare muadili (bkz. Şekil 5) 3-5 kat daha büyük olan sıçan pankreas da dahil olmak üzere daha önce çok daha büyük numuneler, gerçekleştirmek mümkün NUR aralığında elde artan doku penetrasyon derinliği sayesinde vardır. Ne olursa olsun görünür veya NIR dalgaboyu kullanılmaktadır olsun, CLAHE uygulanması önemli ölçüde tekniğin algılama hassasiyetini (bkz. Şekil 6) artırarak farklı genetik ve fizyolojik koşullar sırasında BCM temelli değerlendirmeler OPT kolaylaştırabilir. Gelişmiş numune tutucusu için bir plan Şekil 7 &#39;de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Akış mur içinde BCM OPT bazlı analizler için kritik adımları gösterenine pankreas. tipik bir fare pankreas değerlendirmek için gereken süre 13-14 gündür. Tarama uzunluğu gerekli pozlama süresi (normalde yaklaşık 1 saat) bağlı iken zamanın çoğunluğu doku işleme ve immünohistokimyasal boyama (10 gün) boyunca tüketilen, doku temizleme yaklaşık 2 gün gerektirir. Daha sonraki sayısal işlem tipik olarak bir gün içinde gerçekleştirilir. Not, nispeten uzundur boyama protokolü ideal örneklerinin büyük miktarlarda toplu işlem için uygundur. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Farklı dalga boylarında BCM değerlendirmeler için gürültü oranı Sinyal. Insülin ve florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli (Alexa 488, 594, 680 ve lekeli bir fare duodenum pankreas lob,Farklı dalga boylarında N oranı: 750), S belirlemek için kullanılmıştır. A Görüntüler her sinyal kanal için ilk projeksiyon karesini göstermek. Her bir sinyal kanal için N: ortalama S gösteren B, Grafik. Oranları plan yoğunluğu (ekzokrin doku endojen doku floresan) bölünmesiyle ortalama adacık yoğunluğu (215 adacık üzerine dayalı) olarak belirlendi. C, S gösteren Grafik: Yok Alexa 594 kanal için elde: S normalize her kanalda ayrı adacıklar N oranları. Tek yönlü varyans analizi kullanılmıştır. Anlamlılık seviyesi ** p &lt;0.01 &#39;e karşılık gelir göstermiştir. (A) 1 mm karşılık gelir Ölçek çubuğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Şekil3. Kanal ayırma. A, tabloda listelenen Alexafluor boyalarla konjuge sekonder antikor proteinG-Sepharose boncuklar üzerinde ayrı immobilize edildi. B, floresan boncuklar daha sonra bir agaroz fantom farklı düzeylerde gömülü ve belirtilen filtreler kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Diyabet araştırma tabanlı çok kanallı görüntüleme OPT. A, OPT Sigara Obez Diyabetik (NOD) tip 1 diyabet için model bir pankreas (12 hafta, duodenal lob) iso-yüzey rekonstrüksiyonu dayanır. Düz kas α-aktin (kan damarları, kırmızı) ve CD3 (T-lenfositler infiltre, yeşil); örnek insülin (adacık β-hücrelerinin, sözde renkli mavi) için lekeli. Kullanılan ilgili ikincil antikorlar vardı; Cy3, IRDye-680 ve sırasıyla DyeLight-750.parçalar (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;) bireysel sinyal kanallarıyla gösterir. B, syngenic adacıkları ile aşılı ve transplantasyon sonrası NUR-OPT iki hafta ile görüntülenebilir bir fare karaciğer lob (lobus sinister lateralis) ve OPT görüntüsü (görünüm blow up). Insülin ifade adacıklar mavi pseuodocolored ve düz kas α-aktin pozitif gemileri kırmızı vardır. Yaklaşım damar ağı içinde adacık greft dağılım değerlendirmelerini sağlar. Ölçek çubuklar 1 mm karşılık gelir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Şekil 5," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Şekil 5,. NUR-OPT büyük numunelerin görüntüleme kolaylaştırır. Tip 2 diyabet (9 ay dalak lob) için Zucker Yağ modelinden bir sıçan pankreas BCM dağılımının, Iso-yüzey işleme, sıçan görüntü numune olasılığı örnekleyen NUR-OPT tarafından pankreas ölçek. Olarak belirlendiBu teknik ile gösterilen lob onun fare muadili göre (v / v) ~ 6 kat daha büyüktür ve β-hücre hacmi toplam lobular hacminin% 1.32 oluşturan Langerhans adacıkları ifade 10139 ensülin barındırır. B, (A), doku ve her derinliklerinden adacıkları tespit edildiği gösteren de kırık çizgilerle gösterilen hat karşılık gelen tomografik bölümü. C, bir boyut referans olarak gösterilen bir fare pankreası (8 hafta için dalak lob) içinde BCM dağıtım Iso-yüzey görüntüleme. Görüntülenen lob olan β-hücre hacmi toplam lobüler hacminin% 0,89 oluşturan 2.490 insülin ifade adacık barındırır. Alexa594 pancreata konjuge keçi anti-GP (fare) ve sırasıyla IRDye 680 Konjuge eşek anti-GP (sıçan) antikorları tarafından takip GP anti-insülin ile boyanmış. In örnekleri (AC) (C) 2 mm karşılık ölçek ve ölçek bar betimlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Şekil 6" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Şekil 6. CLAHE OPT görüntüleme ile fare pankreas adacık tespitini kolaylaştırır. Ac, C57BL / 6 fare pankreas (8 hafta splenik lob) Temsilcisi iso-yüzey render OPT görüntüleri insülin için etiketli. OPT görüntülerin Iso-yüzey rekonstrüksiyonlar önce yapıldı (A, sözde yeşil renkli) ve CLAHE protokolünden sonra (B, sözde kırmızı renkli) uygulandı. C,-olmayan normalize veri Kaplama (A) ve (B) &#39;de CLAHE işlenmiş verileri. C&#39;-C kırmızı-sadece &quot;adacıklar&quot;, (A) non-normalize ve CLAHE işlenmiş (B) görüntüleri Temsilcisi yüksek büyütme kaplaması. Olarak varlığını gösterdiği &quot;, CLAHE komut küçük ve düşük sinyal tespiti kolaylaştırır yoğunluğu adacıklar. Geçerli örnekte tasvir numune (CLAHE işlem sonrası) gelen işlenmemiş projeksiyon verilerine dayanarak Numaraları 1057 adacıktan wi oldu 1.74 mm 3 (hacminde 2419 adacıktan harbored1.77 mm 3) bir hacme inci. D ve E, kontrol (D) ve CLAHE protokol uygulanması 6 ay sonra, tip 2 diyabet 12 (e) için ob / ob fare modeli Örnek veri. Ob / ob pankreas (E) adacık boyutu genel olarak büyük bir artış not edin. (D) ve (E) pankreas dış hat (gri) doku otofloresans gelen sinyale bağlıdır. C Ölçek çubuğu AC 500 mikron. C Ölçek çubuğu &quot;C&quot; ve C&#39;&#39;. Ölçek çubuğu E ile 1 mm karşılık olarak 200 mikron karşılık gelir (D) ve (AC) Hörnblad ve diğerleri 3 adapte edilmiştir olarak (E). Görüntü ve kullanılarak oluşturuldu Bioptonics 3001 tarayıcı. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. OPT örneklerin eki için örnek tutucu. Numune flanş önceden delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk aracılığıyla iğneler takarak sabitlenir. Tutucu via step motor menteşeliGüçlü mıknatıs tabanı bulunmaktadır. Bu kurulum kararsız tutkal kullanımı atlar ve tarama sırasında numune istenmeyen hareketleri önler.

Watch this Scientific Journal Video about Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of Î²-cell Mass Distribution in Diabetes Research at JoVE.com

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &amp;#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Biz optik projeksiyon tomografisi (OPT) adaptasyonu tarif<sup&gt; 1</sup&gt; Yakın kızılötesi spektrum, ve hesaplama araçları bir dizi uygulama içinde görüntüleme için. Bu protokoller, büyük numuneler pankreas β-hücre kitlesi (BCM) değerlendirmelerini sağlayan tekniğin kanallı kapasitesini artırmak ve OPT verilerin kalitesini artırmak.

Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

near-infrared-optical-projection-tomography-for-assessments-cell-mass

Research

JoVE Journal

Medicine

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

16.2K Görüntüleme.  Umeå University. Biz optik projeksiyon tomografisi (OPT) adaptasyonu tarif 1 Yakın kızılötesi spektrum, ve hesaplama araçları bir dizi uygulama içinde görüntüleme için. Bu protokoller, büyük numuneler pankreas β-hücre kitlesi (BCM) değerlendirmelerini sağlayan tekniğin kanallı kapasitesini artırmak ve OPT verilerin kalitesini artırmak.

Video: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

İnflamatuar Plak Kızılötesi Floresans (NIRF) İntravasküler Moleküler Görüntüleme, Multimodal Yaklaşım civarında in vivo Ateroskleroz Görüntüleme

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Tıp

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Retina Sirkülasyon Doppler Optik Koherens Tomografi

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Meme Kanseri Cerrahisinde Potansiyel Yakın kızılötesi Floresans Görüntüleme Uygulamaları değerlendirilmesi için Phantom Doku-simüle

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

Vivo, Perkütan, İğne Tabanlı, Böbrek Kitlelerin Optik Koherens Tomografi

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Doğrudan Serebral emboli görselleştirme için Kombine Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro bilgisayarlı Tomografi

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Ultrahigh çözünürlük fare optik koherens tomografi göz içi enjeksiyon Retina gen terapisi araştırma yardımcı olmak için

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part of many experimental procedures where reagents need to be introduced directly into the bloodstream. Unwittingly, the injection can be subcutaneous, possibly altering the scientific outcomes. Utilizing a nanoemulsion-based biological probe with an incorporated near-infrared fluorescent (NIRF) dye, this method offers the capability of imaging a successful tail vein injection in vivo. With the use of a NIRF imager, images are taken before and after the injection of the agent. An acceptable IV injection is then qualitatively or quantitatively determined based on the intensity of the NIRF signal at the site of injection.

Here we present a method to validate tail vein injections in rats by utilizing near-infrared fluorescence imaging data from dyes incorporated into agents or biological probes. The tail is imaged before and after the injection, the fluorescent signal is quantified, and an assessment of the injection quality is made.

Kuyruk ven enjeksiyonları sıçan-kızılötesi-etiketli ajanlar ile doğrulamak için yeni bir en iyi yöntem

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Sıçanlarda Miyokard İnfarktüsü İndükleyen Yarı-Minimal İnvaziv Yöntem ve İzole Çalışan Kalp Sistemi Ile Kardiyak Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated hemoglobin molecules. A probe placed on the skin emits light that is absorbed, scattered, and reflected by the underlying tissue. Detectors in the probe sense the amount of reflected light: this reflects the organ-specific ratio of oxygen supply and consumption - independent of pulsatile flow. Modern devices enable the simultaneous monitoring at different body sites. A rise or dip in the rSO2 curve visualizes changes in oxygen supply or demand before vital signs indicate them. The evolution of rSO2 values in relation to the starting point is more important for interpretation than are absolute values.
A routine clinical application of NIRS is the surveillance of somatic and cerebral oxygenation during and after cardiac surgery. It is also administered in preterm infants at risk for necrotizing enterocolitis, newborns with hypoxic ischemic encephalopathy and a potential risk of impaired tissue oxygenation. In the future, NIRS could be increasingly used in multimodal neuromonitoring, or applied to monitor patients with other conditions (e.g., after resuscitation or traumatic brain injury).

This protocol is designed to assist clinicians to measure regional tissue oxygenation at different body sites in infants and children. It can be used in situations where tissue oxygenation is potentially compromised, particularly during cardiopulmonary bypass, when using non-pulsatile cardiac-assist devices, and in critically ill neonates, infants and children.

Kritik Hasta Neonatlarda, Bebeklerde ve Çocuklarda Yakın Kızılötesi Spektroskopi Nasıl Uygulanır?

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...