Protokol Langerhans pankreas adacıkları içinde hücrelerin küçük alt popülasyonları hızlı izole fonksiyonu sağlar. Bu tekniğin avantajları gerçek zamanlı doğa ve yüksek istatistiksel güç ve dolayısıyla yüksek tekrarlanabilirlik, elde edilen verilerin içerir. Görüntüleme için adacıkları hareketsiz hale getirmek için, ters bir mikroskop için bir görüntüleme odası monte edin ve odanın içine cam bir kapak fişi yerleştirin.
Cam hazne arabiriminin su geçirmez olduğundan emin olun ve kapak fişinin mikroskop hedefinin ulaşabileceği bir yerde olduğunu doğrulayın. Sonra, ince ve kaba örgü 20 milimetre kareler tarafından 20 kesilmiş ve ince örgü bir parça üzerinde iki spacer duvarlar oluşturmak için kalın yapışkan bant 45 ila 50 mikrometre adet kullanın. Kaba örgü ve bir ağırlığı 35 milimetrelik Petri çanak görüntüleme solüsyonuna batırın ve ince kafesi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.
Boşluk duvarları ters ve spacers yukarı bakacak şekilde ince örgü açın. Ve iki spacers arasında birkaç adacık aktarmak için bir p20 pipet kullanın. Saatçilerin pişmelerini kullanarak, kafesi ters mikroskobun görüntüleme odasına baş aşağı yerleştirin, böylece spacer'lar aşağı doğru oda örtüsüne otursun, boşluklar ile kapak fişinin ortasındaki kafes arasındaki adacıkları sıkıştırın.
Kafesin, numunenin yanal hareketini kışkırtacak aşırı miktarda çözelti içermeden iyice sulu olduğuna dikkat edin. Daha sonra kaba örgü ve ağırlığı odadaki ince kafesin üzerine yerleştirin ve odaya görüntüleme solüsyonu ekleyin. Adacıklar hareketsiz hale geldikten sonra, ters mikroskobun görüntüleme modunu ve hedefini seçin ve adacıklarla birlikte hazneyi mikroskobunun Sıcaklık kontrollü aşamasına yerleştirin.
Perfüzyonu ayarladıktan sonra, giriş akışını oda içindeki çıkış akışından daha düşük konumlandırın ve çıkış akışını giriş akışından daha büyük olacak şekilde ayarlayın. Uzun aralıklarla sürekli çözüm çıkarmadan kaçınarak, çözeltiyi birden fazla sıralı küçük damlacıkta kaldırarak çözümle en az temasa sahip olduğundan emin olun. Daha sonra, üç milimolar glikoz içeren görüntüleme solüsyonu ile perfüzyon başlatın ve yeşil floroforlar görüntüleme için ışık yolu ve filtreler seçin.
Ardından, görüntüleme parametrelerini ayarlamak ve ilgi çekici adacıkları yakalamak için görünümü ayarlamak için canlı görüntüleme çalıştırın. Görüntünün sinyal-gürültü oranını optimize etmek için uyarma ışık yoğunluğunu, pozlama süresini ve binning'i ayarlayarak ayarların adacıkiçindeki her hücrenin mümkün olan en az ışık yoğunluğu ve pozlamada ayrı bir görselleştirilmesine olanak sağlamasını sağlar. Daha sonra adacıkları 0,1 ila beş hertz olarak görüntüleyin ve elde edilen verilerin kalitesini kontrol edin.
Alfa hücre aktivitesi tespit edildiğinde, mümkün olduğunca satın alma yazılımı içinde sinyal dinamikleri bir online grafik kullanın ve iki ila beş dakika boyunca banyo çözeltisi içine adrenalin veya glutamat ekleyin. Kalsiyumda hızlı bir sıçrama ve ardından alfa hücre salınımlarının yavaşlaması veya iptali gözlenecek. Daha sonra, son zamanlarda seçici delta hücreleri etkinleştirmek için bildirilmiştir ghrelin ekleyin.
Adacık hücrelerinin küçük bir alt popülasyonunda kalsiyumda hızlı bir geri dönüşümlü artış gözlenecektir. Sonra 10 milimolar glikoz ekleyin. Beta hücre alt popülasyonunda eşgüdümlü bir salınım yanıtı gözlenecektir.
Daha önce adrenalin veya glutamat ve ghrelin tarafından aktive edildi hücrelerin yanıtları da not. Görüntüleri kaydettikten sonra, verileri uygun bir veri analizi yazılımı programına aktarın ve ham floresan yoğunluğu verilerini floresanilk değerine göre normalleştirin. Hücreden hücreye değişkenlik yoğunluğu veri kümesi hala önemliyse, kontrol çözeltisinin uygulandığı süre aralığı için bir kontrol bölgesi tanımlayın.
Kontrol bölgesinin salınımsız net bir sinyali varsa, kontrol çözeltisinin her uygulamasından sonra floresan yoğunluğunun taban çizgisine geri döndüğünü varsayalım. Her hücre için zaman atlamalı verileri düzeltmek için, verileri denetim çözümlü eklenen noktalara göre ayrılmış bölümlere bölün ve her segmente doğrusal düzeltme uygulayın. Kontrol aralığında net salınımlar varsa veya ek etkenler varsa, bir ani algılama algoritması kullanın.
Kalsiyum ani lerinin sıklığını ve agonistlerin ve antagonistlerin eklenmesine verilen yanıtı ölçmek için, kaydı eşit zaman aralıklarına bölün, aralıktaki ani artışları sayın ve kısmi frekansın zaman seyrini hesaplamak için aralık süresine normalleştirin. Alternatif olarak, eşiği ayarlayın ve aralıkların her biri için plato fraksiyonu hesaplayın. Kesir, hücrenin heyecanlı durumda geçirdiği aralık taki zaman yüzdesini gösterir.
Veya aralıkların her biri için eğrinin altındaki kısmi alanı hesapla. Membranın lipid bileşimi etkilenmedikçe, adacıklar tropikal boyalarla oldukça iyi yüklenirler. İnsan adenovirüs tip 5 vektörü de adacık hücrelerini başarıyla hedefler.
Alfa hücrelerinde kalsiyum spiking kolayca düşük glikoz düzeylerinde tespit edilebilir, ve düşük glikoz aktivitesi ve adrenalin ve glutamat yanıtı arasında yüksek hücre-hücre korelasyon var. Ghrelin düşük glikoz bazı adrenalin duyarlı hücreleri aktive ancak düşük glikoz tarafından aktive hücrelerin çoğunda kalsiyum dinamikleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Kısmi frekans açısından analiz edildiğinde, adrenalin veya ghrelin uyarılmış hücreler all-or-nothing koşulları altında önemli bir artış görüntüler, bazal spiking ve adrenalin etkisi arasındaki genel değişiklikler ince olmasına rağmen.
Buna karşılık, eğrinin altındaki kısmi alan bazal aktivite yüksek olsa bile tüm hücrelerde adrenalin tarafından tanıtılan değişikliklere duyarlıdır. Tüm meshes görüntüleme çözümü ile temas halinde olduğundan emin olun ve hava kabarcıkları önlemek için makul yoğun doku konumlandırmak için dikkat edin. Yöntem hücre türleri arasında ayırt etmek için yapay zeka içerecek şekilde genişletilebilir.
Farmakolojik belirteçler desen tanıma teknolojisi ile değiştirilebilir, böylece kayıt süresini kısaltılabilir.
