Dan McWhorter video protokol anlatan için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH Hibe 5R01NS062182 Yaşlanma Araştırma Amerikan Federasyonu hibe ve HTG verilen kurumsal fonlar tarafından desteklenmektedir.

I. Prosedürleri Aşağıdaki teknikler, sterilize araçlarını kullanarak, bir laminer akış kaputu steril koşullar altında olmalıdır. Organotipik dilimler için cam alt yemeklerin hazırlanması <ol><li> Yemekleri steril bir ortamda hazırlanan ve araçlarını kullanarak sterilize edilmelidir. </li><li> 150μL dilim orta bir damla (yemek tarifleri) orta hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli bir şekilde çanak cam alt kısmının merkezinde yer almaktadır. </li><li> Neşesiz bir tarafı bırakarak, kültür çanak merkezi işgal yuvarlak lamel bitişik kare saçaklar yerleştirilir - 23 Gauge iğne, tutkal birden fazla lekeler (Elmer, kedi # E904 Kauçuk Çimento) ile donatılmış bir tek şırınga ile sıvı alışverişi için (Şekil 1). Listelenen tutkal olarak bu protokolü uygulanan dilimleri veya hücreleri için toksik değildir. Bakım değindiği ve daha sonra dilimleri görüntüleme engel olarak cam kapak slip üzerindeki her türlü tutkal yerleştirerek önlemek için verilmelidir. Nucleopore membran (çapı 25mm, gözenek boyutu 8.0μm Whatman kedi # 110.614), bir yere sabitlemek için yapıştırıcı noktalar kullanarak, cam lamel üstüne yerleştirilir. Cam lamel ve membran arasında sıkışmış hava kabarcıkları olmadığını sağlarken, bir mikro forseps kullanılarak yapılmalıdır. </li><li> 1 ml dilim orta membran üstüne ekleyin. Yemekleri Kullanıma hazır olana kadar, 30 dakika sonra buz üzerinde bir kuluçka yerleştirilir. </li></ol> Erken doğum sonrası beyinlerin çıkarımı Dilimleri genç postnatal fareler (P1-P10) hazırlanan zaman en iyi sonuçları elde edilir. <ol><li> Pups ölümcül anestezi isofluorane veya onaylanmış diğer yöntemlerle (aşırı doz). Baş, sterilite artırmak için keskin bir makas kullanarak hızlı dekapitasyon% 70 etanol ile püskürtülür olabilir. </li><li> Mikro forseps ile mandibula sıkma baş stabilize edilir. Deri, boyun burnu boyuna eksize edilir. Kafatası 1 medial ve 2 yan keser (Şekil 2A her iki tarafında bir) yaparak, sisterna magna başlayan boyuna ve anteriora kesilir. Kraniyal flep beyin uzak kaldırılır Bakım altta yatan kortikal doku ile temas en aza indirmek için alınmalıdır. </li><li> Vibratome kesit sırasında doku istikrarı geliştirmek için iki sagital kesikler yaparak, beynin lateral en yönlerini kaldırılır. Beynin kaudal yönü de beyincik rostral tabanı (Şekil 2B) bir kesim yaparak kaldırılır. </li><li> Iki yarısının orta hat fissür boyunca pürüzsüz bir kesim yaparak ayrılmış ve iki yarımküresinin kafatası dikkatle scooped ve gömme bir kalıp (Şekil 2C-D), aşağı, medial yüzeyi yerleştirilir. </li></ol> Ev sahibi beyin, Kesit <ol><li> Gömme kalıp iki yarımküresinin hemen erimiş% 3, düşük erime noktası DNA dereceli agaroz jel (Fisher, kedi # BP1360-100) 37 ° C (yemek tarifleri) muhafaza doku hazırlanması tampon içinde çözünmüş kaplıdır. Agaroz bile sertleşme sağlamak için yatay düz bir yüzey üzerinde sabitleme 2 dakika sonra, kalıplar ayarını tamamlamak için buz üzerinde konumlandırılmış. </li><li> Hemisferlerin içeren jel ayarlandıktan sonra, kalıptan çıkarılır ve beyin dokusu etrafında jel 2-3mm bırakarak kesilmiş. </li><li> Sonra jel gömülü doku medial yüzeyi ile, vibratome numune disk monte ve siyanoakrilat yapıştırıcı (Krazy yapıştırıcı veya eşdeğeri) ile güvenli. Bakım sadece az miktarda tutkal uygulamak için gerekli önlemler alınmalıdır çok dilimleri ve göç hücreleri toksik etkileri olacaktır. Çok fazla tutkal blok tarafta da potansiyel doku zarar kesme engel olacaktır. </li><li> Disk doku hazırlanması orta buz dolu vibratome örnek tepsiye yüklü. </li><li> Doku (kullanılan vibratome bağlıdır, ve böylece en iyi sonuçlar için bağımsız olarak tespit edilmelidir), yavaş ve orta menzil vibratome hızda, 150μm kalınlığında kesitli konumundadır. Bizim ellerde, maksimum titreşim frekansı en uygunudur. İlk birkaç dilim atılabilir. </li><li> En kısa sürede RMS içeren dilim bıçağı (RMS SEZ OB uzanan gri U-şeklinde bir yapı olarak çıplak gözle görülebilen) yayımlanan, onlar dikkatle jel kalıp alay ve topladım. küçük bir flathead spatula ile. Dilim dilim orta (Şekil 3A-B) içeren cam-alt yemekler nucleopore zarı üzerine yerleştirilir. 150 mikron kesildiğinde tipik bir erken postnatal fare beyin yarımkürede başına yaklaşık 2-3 RMS bölümleri verecektir. Bu, çok kırılgan olduğu gibi dilim işleme minimumda tutulması olduğunu kritik öneme sahiptir. Dilimleri ile yemekler daha sonra bir kuluçka aktarılır. </li></ol> Donör beyinkesit ve RMS nakli <ol><li> Donör beyinleri (neuroblasts göç floresan gazetecilere ifade beyinsel) 250μm kalınlığı kesitli ve dilim buz doku hazırlanması tampon toplanır. </li><li> Dilimler hemen Epifloresans yeteneği ile bir diseksiyon mikroskop altında yerleştirilir ve RMS yavaşça mikro forseps kullanarak, microdissected. Bir forseps, dilim, diğer dilim serbest bırakılana kadar RMS çevresinde küçük bir kesim yapmak için kullanılır ise stabilize etmek için kullanılır. Eksize RMS sonra nakli için önce küçük eksplantlar (çapı yaklaşık 200-500 mikron) bölünür. </li><li> Cam alt yemekleri nucleopore filtrelerin üzerine yerleştirilmiş ana dilim içeren inkübatör kaldırılır ve diseksiyon mikroskop altında yerleştirilir. RMS, görünür ışık kullanarak, açıkça tanımlanmış ve RMS ilk segment küçük bir kesi yapılır. </li><li> 20 mcL ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak, tek bir donör RMS eksplant ana RMS kazıma sitesine aktarılır. Eksplant nazikçe 2 dokular arasında iletişim kurmak için kesi içine itilir. Bu iletişim kararlı olduğundan emin olmak için, eksplantlar dilim ve nucleopore zarı arasında biraz itti. </li><li> RMS ile tüm ana dilim nakledilen sonra, bulaşıkları membran bölümlere yerleşmek için izin için en az 1 saat inkübatör iade edilir. Neuroblasts eksplant host yaklaşık 1-2 saat sonra RMS içine göç etmeye başlamalıdır. </li></ol> Zaman atlamalı görüntüleme nöronal migrasyon <ol><li> Cam alt yemekleri inkübatör mikroskop inkübe odası (Şekil 3C) aktarılır. Floresan neuroblasts 0 İstenen analizin türüne bağlı olarak 10 dakika arasında değişen aralıklarla görüntülü olabilir. Örneğin bireysel neuroblasts göçmen döngüsü sırasında 2,5 dakika veya daha az eşit aralıklarla ayarlayarak görüntü sitoskeletal dinamikleri. Ancak, 5 ila 10 dakika arasında değişen aralıklarla göç yönü ve hızı gibi nüfus dinamikleri daha iyi yakalanır. Hedeflerinin seçim mikroskop marka bağlı olarak oldukça değişkendir. Nikon C1 konfokal mikroskop, 20x kuru lens (Nikon Pan Fluor, NA 0.75, WD 0.35mm) analizleri için en uygun olduğunu bulmak. Bu konfokal sistemi en iyi sonuçlar için, orta boy bir iğne deliği (60μm çap) açıldı. , Görüntüleme göç davranışı için en uygun en az 20 mm uzakta iki dilim kesilmiş yüzeyleri, RMS kalınlığı içinde derin hücrelerine sınırlıdır. Lazer gücü en az şekilde optimize edilmiş, ancak bireysel neuroblasts ayrıntıları görünür kalmasını olmalıdır. </li><li> Dilimleri görüntüleme tamamlandıktan sonra buz ile sabit ve taze% 4 paraformaldehid hazırlanan, immunohistokimyasal ve daha fazla görüntüleme için kızaklar üzerinde monte edilmiş olabilir. Membranlar gibi laminin gibi herhangi bir yandaşı substratları ile kat bizim olmadığından boyama tamponlar dalmış kez dilimleri genellikle membran uzakta yüzer. , 150 mikron kalınlığında korurken Bölüm görüntülenmiş. Bu dilim cryopreserve ve dondurma ve orijinal dilim ince bölümleri elde etmek için bir Kriyostat kullanmak da mümkündür. Ancak, bu eserlerin yanı sıra doku bütünlüğünü değiştirecek boyama insidansı artış neden olur. </li></ol> II. Malzeme / ekipman Organotipik dilimler için cam alt yemeklerin hazırlanması <ul><li> Küçük şırınga ile (1 mL) </li><li> 23-insülin iğnesi </li><li> Parça-Etch Nucleopore Membran çapı 25mm, gözenek boyutu 8.0μm - whatman, kedi # 110.614 </li><li> Glass Bottom Kültür Yemekleri, 35mm petri, 14mm kuyu, No 1.5 coverglass - MatTech, kedi # P35G-1.5-14-C </li><li> Kauçuk Çimento - Elmer, kedi # E904 </li><li> Bazal Orta Eagle - Gibco, kedi # 21010 </li><li> 1M HEPES (pH7.4) </li><li> 1M D-glukoz </li><li> 100 mM CaCl 2 </li><li> 100 mM MgSO 4 </li><li> 1M NaHCO 3 </li><li> dH 2 O </li><li> 200mm L-glutamin </li><li> Penisilin-streptomisin </li></ul> Beyin çıkarma ve gömme <ul><li> Anestezik (isofluorane, vb.) </li><li> Mikrodalga fırın </li><li> Düşük Erime Agaroz - Fisher, kedi # BP1360-100 </li><li> Krazy tutkal - kedi # KG585 </li><li> Peel-A-Way Disposable gömülmesi Kalıplar (R-40) - 22mmx40mm dikdörtgen, 20mm derin - Polysciences, kedi # 18646C </li></ul> Beyin kesit ve RMS transplantasyonu <ul><li> Vibratome - Leica VT1000S ve dilim hazırlanması için tüm aksesuar parçaları </li><li> 10X Hank Dengeli Tuz Çözüm - Gibco, kedi # 14185 </li><li> Microdissecting forseps # 5 - Roboz, kedi # RS-4976 </li><li> Microspatula - Fisher, kedi # 21-401-15 </li><li> Stereomikroskopta </li></ul> Time-lapse görüntülemeOrganotipik dilimleri <ul><li> Nemlendirilmiş İnkübatör,% 5 CO 2 </li><li> Ters Mikroskop inkübatör odası ve uzun mesafe çalışma hedefleri (0.6 veya daha yüksek NA) ile donatılmış </li></ul> III. Yemek Tarifleri Tampon çözelti doku diseksiyonu ve dilim hazırlama (doku hazırlama tampon) <table border="1"><tbody><tr><td> Stok çözelti </td><td> Hacim </td><td> Final konsantrasyon </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> 50 ml </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 1M HEPES (pH 7.4) </td><td> 1.25 mL </td><td> 2.5mm </td></tr><tr><td> 1M D-Glikoz </td><td> 15 ml </td><td> 30mm </td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 0,5 mL </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 0,5 mL </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> 1M NaHCO 3 </td><td> 2 mL </td><td> 4mm </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 430,75 ml </td><td></td></tr></tbody></table> 4 at 0.2 mikron filtre ve mağaza ° C ile sterilize filtreleme Organotipik dilimleri, doku nakli ve görüntüleme Kültür orta (dilim orta) <table border="1"><tbody><tr><td> Stok çözelti </td><td> Hacim </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Bazal Orta Kartal </td><td> 35 mL </td><td></td></tr><tr><td> Doku hazırlanması tamponu </td><td> 12.9 ml </td><td></td></tr><tr><td> 1M D-Glikoz </td><td> 1.35 mL </td><td> 20mm </td></tr><tr><td> 200mm L-glutamin </td><td> 0.25 ml </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> 0,5 mL </td><td> 100units / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin </td></tr></tbody></table> 4 at 0.2 mikron filtre ve mağaza ° C ile sterilize filtreleme Düşük erime noktası agaroz jel hazırlanması Düşük erime noktası agaroz 50 ml konik tüpünde 0.3g / ml (yemek tarifleri) doku hazırlanması tampon ile seyreltilir. Tüp 5-10 saniye aralıklarla yüksek güç mikrodalga. Artışlarla sayısı toplam hacmine bağlıdır; 10 ml, üç artışlarla (10-8-5 saniye, her) yeterli olacaktır. Hava basıncı dikkatlice bırakın ve tüpün patlama önlemek için tüp kapağı ısıtma artışlarla arasındaki vida. Tüp içeriği çok sıcak olacak gibi Dikkat alınmalıdır. Agaroz tamamen eridikten sonra, tüp sıcaklığı kullanmadan önce stabilize etmek için izin vermek için en az 5 dakika 37 ° C su banyosunda tutulur. Oda sıcaklığında uzun süre maruz kalmak sertleşmesine jel. Bu mümkün olduğunca kaçınılmalıdır rağmen, ilk hazırlık 24 saat içinde hemen kullanıma için sertleştirilmiş jel ısıtılması olabilir ve yeniden erimiş. Organotipik dilimleri üzerinde İmmünohistokimya Konfokal mikroskop görüntüleme sonra, dilimler PBS içinde% 4 formaldehit ile 4 ° C&#39;de gece boyunca sabit olabilir. Bölüm sonra% 1 Triton X% 10 keçi serumu gecede, 4 ° C&#39;de engellenir (Sigma, Kedi # S26-36-23) PBS içinde 4 ° C&#39;de primer antikorları ile gecelik inkübasyon Floresan etiketli keçi sekonder antikor görselleştirme için kullanılan (tüm seyreltilmiş 1:1000, oda sıcaklığında 1 saat inkübasyon). Etiketli dilimleri önce buz PBS cam slaytlar montaj ve coverslipping 5-6 kez iyice yıkanır. IV. Temsilcisi Sonuçlar Bizim Organotipik dilim kültür protokolü iyice test edilmiş ve bu son birkaç yıl içinde göç desen ve yönlendirme tutarlılık için optimize edilmiştir. Kırmızı floresan proteini, Td-domates, ifade Nestin organizatörü (Nestin-Td Domates) altında indüklenen olan hangi farelerden elde edilen eksplantlar göç hücrelerin analizi, (ev sahibi RMS içine tdTomato + neuroblasts yüksek odaklı ve hızlı göç ortaya koymaktadır Şekil 4A). Yüksek büyütmeli zaman atlamalı analizi (Şekil 4B) 20 dakika görüntüleme oturumu sırasında göç neuroblast tüm uzunluğu mükemmel çözünürlük göstermektedir. Donör ile Dilimleri Td-domates + hücreler sabit ve RMS içinde farklı hücresel bileşenleri için immunohistokimyasal. GFAP + astrositler ve CD31 + kan damarlarının floresan immünohistokimya (Şekil 5A) kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Yüksek büyütmeli Hücre iskeleti proteinleri aktin ve tubulin lekeli dilim analizi göç ortasında bir hücre (Şekil 5B) tarafından bu bileşenlerin düzgün olmayan bir ifade ortaya koymaktadır. Kullanılan Antikorlarbu örnekler: tavşan anti-Teklife Çağrı Dosyası (Abcam 1:250), tavşan anti-GFAP (Dako, 1:1000), sıçan, anti-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), fare, anti-aktin (Santa Cruz, 1: 500), tavşan anti-tubulin (Sigma, 1:1000), keçi anti-fare Cy3 (Chemicon 1:1000), keçi anti-tavşan AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:1000), keçi anti-sıçan AlexaFluor 488 (Invitrogen 1:1000), keçi anti-tavşan AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000). <img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Organotipik dilimleri için cam alt yemekler hazırlanması. Tutkal Çoklu noktalar, filtre altından orta değişimi için bir tarafı açık bırakarak, çanak dairesel cam alt bileşeni (kırmızı) etrafına yerleştirilir . Dilim orta 150μL açılan cam lamel merkezinde yer almaktadır. Nucleopore membran (mavi), sonra cam lamel ve membran arasında sıkışmış hava kabarcıkları olduğunu sağlarken, parlak tarafı aşağı, uygulanır. Bir mililitre dilim orta (gri) membran üstüne yayılır ve yemekleri ° C kullanımdan önce 37 inkübe edilir. <img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Beyin çıkarma ve kesit için hazırlanması. (A) kafatası, boyun (orta hat boyunca noktalı çizgi) burnu kafa derisi incising maruz kalmaktadır . Kafatası 1 medial ve 2 yan keser (her iki tarafta; 2A) yaparak, sisterna magna başlayan boyuna ve anteriora kesilir (B) korteksin lateral en yönlerini ve MSS kaudal yönü vibratome kesit sırasında doku istikrarı geliştirmek için rezeke (CD) iki yarımküresinin daha sonra ayrılmış ve doku hazırlanması tampon içinde çözünmüş% 3 agaroz jel uygulaması öncesi bir iç içelik kalıp medial yüzü aşağı yerleştirilir . <img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Beyin kesit ve çapraz nakli. (A) konakçı doku 150μm kalınlığı kesitli, ve RMS içeren bölümleri dikkatli bir şekilde, soğuk cam alt yemekler nucleopore membran düz konumlandırılmış (B) Donör beyinleri (RMS floresan gazetecilere ifade beyinleri ) kesitli. 250μm kalınlığı, ve dilim buz doku hazırlanması tampon toplanır. Donör RMS microdissected ve küçük eksplantlar oyulmuş. 20 mcL ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak, bireysel RMS eksplantlar ev sahibi RMS bir kazıma sitesine aktarılır (C) 1-2 saat inkübasyondan sonra, yemekleri konfokal mikroskop inkübe bir aşamaya aktarılır ve göç yakalanır zaman atlamalı kullanarak görüntüleme. Bir yüzey (gri) tipik bir dilim transplantasyonu (kırmızı noktalı çizgiler anahat ana dilim RMS tdTomato + RMS kırmızı bir bağış fare eksplant) 1 saat sonra bir temsilcisi düşük büyütmeli görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Göç ev sahibi RMS içine eksplantlar gelen neuroblasts. (A) Nestin-tdTomato + neuroblasts (kırmızı), ev sahibi RMS (noktalı yeşil hat) naklinden sonra 1 saat içinde eksplantlar göç ederler . tdTomato + Organotipik dilim SEZ bir yüksek odaklı ve hızlı bir şekilde OB doğru hareket konak RMS işgalci hücreler. (B) göçmen döngüsü yaklaşık bir neuroblast yüksek güç zaman atlamalı görüntüleri gözlenen olabilir. 20 dakikalık süre. Ölçek çubuğu = 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Organotipik dilim immünohistokimyasal değerlendirme. Eksplante neuroblasts (kırmızı) göç ortasında sabit vardı 12 saat yazılan nakli. (A) dilim Floresan immünohistokimyasal boyama CD31 + kan damarlarının (yeşil) GFAP + astrositler bir yoğun havuzu (mavi) ortaya çıkarır ve dağınık (B), izole bir tdTomato hücre iskeletinin ana dilim RMS içinde + bir dizi RMS göç hücre (kırmızı) co-immün aktin (mavi) ve tubulin (yeşil) karşı antikorlar ortaya çıkar .

<ol>
	<li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+adult+brain:+are+we+there+yet.">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+neocortex:+a+perspective+from+developmental+biology.">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 724-735 (2009).</li><li>Jaglin, X. H., Chelly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin-related+cortical+dysgeneses:+microtubule+dysfunction+underlying+neuronal+migration+defects.">Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects.</a> Trends Genet. 25, 555-566 (2009).</li><li>Carro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+network+for+mesenchymal+transformation+of+brain+tumours.">The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours.</a> Nature. 463, 318-325 (2010).</li><li>Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+neuronal+migration+in+the+olfactory+system+by+the+protein+Slit.">Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.</a> Nature. 400, 331-336 (1999).</li><li>Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polysialic+acid+in+migration+of+olfactory+bulb+interneuron+precursors+in+the+subventricular+zone.">The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone.</a> Neuron. 16, 735-743 (1996).</li><li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. a. n. u. e. l., Alvarez-Buylla, J., &amp;amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain.">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li><li>Vreys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+visualization+of+endogenous+neural+progenitor+cell+migration+along+the+RMS+in+the+adult+mouse+brain:+validation+of+various+MPIO+labeling+strategies.">MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies.</a> Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).</li><li>Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+migrating+neurons+in+the+mammalian+forebrain.">In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain.</a> Chem. Senses. 30, 115-116 (2005).</li><li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subventricular+zone+en-face:+wholemount+staining+and+ependymal.">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li><li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells.">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li><li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain.">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li><li>Polleux, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li><li>Murase, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream.">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li><li>Suzuki, S. O. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways:+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration.">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li><li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone.">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li><li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts.">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li><li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuronal+proliferation,+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors.">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li></ol>

North Carolina State Üniversitesi, Veteriner Koleji tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Çıkar çatışması ilan etti.

RMS Nöronal göç koku ampuller 1 postnatal nöron önemli bir bileşeni. Göç yoluyla RMS beynin yüzeyine teğet bir düzlem oluşur. Teğet göç neuroblasts radyal yanı sıra, son nöronal ürünler 1, 2, 3 ıraksak kaderi kendi progenitör kaynağının yerini dayalı hücreler göç farklıdır. Postnatal RMS teğet göç hücrelerinin oldukça saf bir nüfus bu anatomik olarak tanımlanabilir bölge teğet göç mekanizmaları çalışmak için optimum bir platform yapar. Nöronal göçü...

an organotypic slice assay for high-resolution time-lapse imaging of neuronal migration in the postnatal brain

Progenitör hücrelerin, neuroblasts göç yanı sıra, mevcut nöral devrelerin farklılaşma ve yeni nöronlar entegrasyonu yayılması: doğum sonrası beyindeki nöron üç biyolojik olaylar bakım bağlıdır. Koku ampuller doğum sonrası nöron için, bu olayların üç anatomik olarak farklı alanlar içinde ayrı: proliferasyon neuroblasts rostral göçmen akışı (RMS) aracılığıyla hareket göç büyük ölçüde, lateral ventriküllerin subependimal bölgesi (SEZ) oluşur ve yeni nöronlar ayırt etmek ve koku ampuller (OB) içinde entegre. Bu üç etki alanı biyolojik olayların her belirgin düzenleyen, hücresel, moleküler ve fizyolojik mekanizmaların çalışması için ideal bir platform olarak hizmet vermektedir. Bu yazıda, ekstraselüler koşulları yakından neuroblasts göç in vivo ortamda taklit postnatal beyin dokusu için optimize edilmiş bir Organotipik dilim testi açıklar. Biz tahlil, üniforma, odaklı ve hızlı hareket için RMS içinde neuroblasts sağladığını göstermektedir. Bu testte, farklı genetik geçmişleri fareler çapraz nakli yaklaşımlar kullanılarak nöronal göçün hücre özerk ve özerk olmayan bir yönetmelik çalışması için son derece uygun olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain at JoVE.com

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

an-organotypic-slice-assay-for-high-resolution-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Görüntüleme.  North Carolina State University. Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Video: An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...