MS ve YZ KCL ve KCL-Çin Doktora studentships tarafından desteklenmektedir. MO Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından finanse edildi. Biz Elektroporasyondan değerli tavsiye için Masaru Okabe ve Haziran-ichi Miyazaki PCX-EGFP plazmid ve Alain Chedotal ve Athena Ypsilanti teşekkür ederim.

Bu prosedür, İngiltere İçişleri Bakanlığı Yönetmeliği (Hayvan Bilimsel Usul Yasası, 1986) ile uyumludur. Bilim adamları kurulan ve kendi kurumsal ve ulusal hayvan düzenleyici kuruluşlar tarafından onaylanan yönergeleri takip etmelidir. 1.. Doğum Sonrası Elektroporasyon 1.1. Cam kapillerleri, DNA Çözüm ve Electroporator hazırlanması <ol><li> DNA enjeksiyon için çekti cam kılcal damarları (0.86 mm: 1,5 mm, ID OD) hazırlayın. (Sutter P-97 kılcal çektirmesi için Gösterge ayarları şunlardır: Isı 283; 50 çekin, Velocity 90, gün 50). Yaklaşık 2 ul bir hacme karşılık gelen kılcal bir iz yapın. </li><li> 850 msn aralıklarla (100 V, 50 milisaniye ON nabız, 850 msn&#39;den, nabız 5 OFF darbe) ile, 100 V, 5 kare bakliyat, 50 msn / darbe elektroporatörü voltajını ayarlayın. </li><li> 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, yüksek saflıkta (OD&gt; 1,80 260/280) seyreltin endotoksin içermeyen plazmid DNAEndotoksin ile Tris-EDTA tampon maddesi ya da PBS boşaltın. Bu, DNA çözeltisi (başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde boya ventrikülde yaymalıdır)% 0.1 hızlı yeşil ilave edilmesi tavsiye edilmektedir. </li><li> , 5-7 mm elektrotlar hazırlayın elektrot jeli ve ısıtma pedi ısınmak. </li></ol> 1.2. Elektroporasyon <ol><li> Kafes bir doğum sonrası gün 2 yavru fare çıkarın ve (~ 0.6 L / dk &#39;lık bir akış hızında) izofluran teneffüs bunu anestezi. </li><li> Yaklaşık 1 dakika sonra, ayak tutam yanıt kullanarak anesthetization durumunu belirlemek. Herhangi bir hareket olursa, intraventriküler enjeksiyonu ile devam edin. </li><li> Kılcal bağlı bir aspiratör tüpü kullanılarak DNA 1-2 ul kılcal iğne yerleştirin. </li><li> Bir soğuk ışık kaynağı altında, başparmak ve daha az dominant elin işaret parmağı arasında yavru kafa tutun. Biraz doğru enjeksiyon noktası tanınmasına yardımcı olmak için kafasına cilt geri çekin. </li><li> Göz ve t arasında sanal bir çizgi dikkateO dönüm lambda (Şekil 1A) kraniometrik. Lambda (hattı orta noktasından yaklaşık 1 mm) 15 bu hattın uzunluğunun yaklaşık üçte bir kılcal iğne takın. Beyinde derin penetrasyonu önlemek için emin olun, derin 2 mm hakkında kılcal yerleştirin. </li><li> Ağız yoluyla yavaş yavaş üfleyerek plazmid enjekte edilir (kılcal bağlı bir şırınga da kullanılabilir). Bu başarılı plazmid enjeksiyonu önlemek gibi bu işlem sırasında, parmaklarınız beyin üzerinde çok fazla baskı uygulamadan olmadığından emin olun. </li><li> DNA çözeltisinin bir minimum miktarda kılcal bırakıldığında enjeksiyon durdurun. Bu, intrakraniyal basınç artışı zararlı önlemek için en az 1 ul enjekte etmek için tavsiye edilir. </li><li> Coat hem jel ile elektrotlar ve DNA (Şekil 1A) enjekte edildi yarımkürenin yan tarafında olumlu tarafı ile koyun. Için rostral SVZ&#39;unda içine DNA eklenmesi için, yer elektrotlar biraz rostralenjeksiyon noktası. Elektrot konumu değişen SVZ&#39;unda 22,25 farklı alanlarda elektroporasyon bölgesel özgüllük elde edebilirsiniz. </li><li> Darbe Ayak pedalına basarak geçerli transferini başlatmak. Elektroporasyon tamamlandığında, (düşük voltaj değerleri zayıf elektroporasyon verimliliği ile ilişkili beri voltaj değerleri, 90 V altında olmamalıdır) elektroporatör ekranda gerilimi kontrol edin. </li><li> Birkaç dakika ısıtma pedi üzerinde oksijen altında yavru canlandırdığı ve uzak anneden yerleştirerek, kafese geri. Anne yavru alır ve çöp geri kalanı ile tekrar bir araya emin olun. Elektroporasyondan sonra, bir sonraki adımdan önce 4-7 gün boyunca anneleri ile yavrular bırakın. </li></ol> 2. Akut Beyin Dilim Kültürler hazırlanması 2.1. Çözümleri ve Araçları hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki çözeltiler (bu kesme ve görüntüleme için yüksek glikoz DMEM kullanmak da mümkündür gerekmektedir17): Diseksiyon Medium (500 mi) Gey Dengeli medya - 500ml % 45 Glukoz - 5ml Film Medium (10 mi) % 45 Glukoz - 0.110 mi HEPES 1 M - 0,100 mi Pen / Strep - 0,100 mi FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 mi Glutamine - 0.200 mi Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (fenol kırmızı içermeyen) - 8.89 mi </li><li> 37 ° C&#39;de ısıtın kadar film orta </li><li> Sıra Millicell 37 ° C /% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde film orta ve yer 1 ml içeren, 35 mm cam alt kültürü çanağı içine yerleştirir. </li><li> Vibratome aksesuarları (tornavida, odasını, jilet, yapıştırıcı) hazırlayın. </li><li> Makas, küçük spatula, düz forseps: diseksiyon araçları hazırlayın. </li><li> Dilimleri taşıma araçları hazırlayın: küçük fırça veya yumuşak bir aşılama döngü (boyut: 10 ul), plastik Pasteur pipetler, bir buz kutusu ve birkaç 6 cm plastik tabaklar. </li><li> Diseksiyon orta ön soğutma2-4 ° C&#39;de </li></ol> 2.2. Beyin Dilimleri hazırlanması <ol><li> Önceden ısıtılmış diseksiyon orta ile 6 cm çanak doldurun ve (taze kesilmiş dilimleri tutmaya) buz üzerine yerleştirin. </li><li> Servikal dislokasyon ardından, yavru fare başını kesmek için makas kullanın. , Bir neşter ile kafa derisi kaldırmak beyinciğe OB orta sagital sütür boyunca kafatası kesilmiş ve hafifçe forseps kullanarak kranial kapaklarını çıkarın. Tüm beyin maruz olduğundan emin olun ve dikkatli bir dokusuna zarar vermemek için özel dikkat, bir spatula kullanarak teşrih. Diseksiyon dikkatli yapılması gereken, ancak aynı zamanda çok hızlı bir şekilde (eğer mümkünse bir dakikadan daha az). Uyuşturucu / gaz anestezik terminal anestezi nöroblast ve hayvan kurban aşağıdaki nispeten hızlı bir şekilde yansıması gereken beyin dilim kültürlerin sağlıklı devletin göçmen özelliklerini etkileyebilir çünkü Servikal dislokasyon bizim tercih edilen bir yöntemdir. </li><li> Bir raz ile beyin Hemisectya da bıçak (Şekil 2). Uninjected Yarımküreyi atın veya diğer deneyler için kullanın. </li><li> Vibratome tutucuya bant küçük bir parça koyun ve bunun üstüne beyin yarımkürede (Şekil 2) eklemek için tutkal gerekli minimum miktarda kullanın. Bu, tekrarlanan uygulamalara tutkal tutucu yüzeyinin hasar görmesini önler. </li><li> Tutkal birkaç saniye kurumasını sağlayın. </li><li> Önceden ısıtılmış diseksiyon çözümü ile dolu vibratome tepsisine tutucu yerleştirin. Bıçağın doğru koku ampul (Şekil 2) yöneltin. </li><li> Uygun ayarları kullanarak beyin yarımkürede kesme başlar. Aşağıdaki parametreler önerilir: dilim kalınlığı 300 mikron; hız ~ 3-5; frekans ~ 9. Yüksek frekans ve düşük hızlı dilim zarar görmesini önlemek için önerilmektedir. </li><li> Küçük bir fırça veya yumuşak bir aşılama döngü kullanarak dilimleri toplayın. Sadece görünür OB (genellikle 2-3 dilim / beyin) ile dilimleri tutun. Tipik olarak, RMS çoğu içeren dilim can alt yüzeyinden ~ 300 um bulunabilir. </li><li> (Her iki tarafta floresan kontrol etmek için onları çevirmek için emin) GFP sinyali için standart bir floresan mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve RMS çoğu boyunca parlak floresan gösteren olanları seçin. </li></ol> 2.3. Kültürleme Beyin Dilimleri <ol><li> Bir hücre kültürü kaputu, beyin dilim en kaudal üçte kesip ve ince düz bir cımbız veya bir mikrodisseksiyon neşter kullanarak herhangi bir tutkal izlerini kaldırmak. </li><li> İncelikli bir plastik Pasteur pipet kullanarak dilim aspire (daha büyük bir açıklık oluşturmak için pipet ucu kesilmiş, bu dilim zarar görmesini önleyecek) ve insert önceden ısıtılmış Millicell ortasına yerleştirin. </li><li> En parlak flüoresan sinyali ile yan Millicell (bir inverted mikroskop ile görüntüleme için) girişi ile temas halinde yerleştirilir emin olun. </li><li> Bir pipet ile insertin üst fazla diseksiyon çözüm çıkarın. </li><li> Için dilim kültürleri bırakıngörüntüleme önce en az 1 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yerleşirler. </li></ol> 3. Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme <ol><li> En az 2 saat görüntüleme önce, sabit ayarlanmış Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), dijital CCD kamera soğutmalı Perkin Elmer UltraViewVoX konfokal dönen disk sistemi, ters Nikon Ti-E mikroskop, ve ısıtma sistemi (Solent Scientific) açın 37 ° C&#39;de sıcaklığı </li><li> Volocity yazılım Toplama modülü açın ve &quot;VIZ&quot; butonuna tıklayın ve görüntüleme için lazer (lar) ı seçin. </li><li> Beyin dilim hazırlık 2 saat içinde, mikroskop sahnede görüntüleme odasında beyin dilim içeren cam alt çanak yerleştirin. </li><li> Yansıması olacak dilimin alanı (örneğin, sadece enjeksiyon yerinde sonra RMS ilk inen kısmı veya ELBO seçmek ve odaklanmak için uygun floresan ışığı altında Nikon CFI Süper Planı Fluor ELWD 20X/0.45 objektif kullanınRMS bölge w, ya da sadece Nöroblastlar OB girmeden önce dirsek sonra). </li><li> Aşağıdaki eylemlerden ile time-lapse görüntüleme ayarlayın: <ol><li> Mikroskop, numunenin lazer tarama izin L100 butonuna tıklayın. </li><li> Volocity, uygun lazer (GFP örneğin 488 nm lazer) seçerek ultraview Lazer Changer açın. </li><li> Floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak pozlama süresini (genellikle 100-500 arasında msn) ve lazer yoğunluğu (genellikle% 20-30) ayarlayın. </li><li> Hücre görselleştirme geliştirmek için görüntü dijital kazanç ayarlayın. </li><li> Beyin dilim içindeki görüntüye z-yığın aralığı (genellikle üzerinde 100-120 mikron aralık) seçin. (Bu, daha sonraki izleme analizi kolaylaştıracak) mümkün olduğu kadar örtüşen mümkün önlemek için bir izole edilmiş hücre uygun bir sayısı ile bir aralık seçin. </li><li> Her z-yığın görüntü (genellikle 2-4 mikron) arasındaki boşluğu seçin. </li><li> Zaman int seçinHer z-yığın yakalama (örneğin 3 dk) ve toplam görüntüleme süresi (örneğin 3 saat) arasında erval. </li><li> Görüntüleme parametrelerinde değişiklikleri kaydetmek için &quot;kaydet&quot; ikonuna tıklayın. </li><li> Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın. </li></ol></li><li> Kontrol ve deney numunelerinin Alternatif görüntüleme aynı gün boyunca (örneğin bir araç / ilaç tedavisi veya farklı elektroporasyona plazmid için). </li></ol> 4. Neuroblast Göç Analizi <ol><li> Volocity Kantitasyon modülünde, bir time-lapse deneyi tamamladıktan sonra oluşturulan istenen kitaplığı açın. Sol üst kutuya (Şekil 4A, adım 1) &quot;Extended Odaklama&quot; öğesini seçin. </li><li> (Şekil 4A, adım 2) Ölçüm penceresini görüntülemek için &quot;Ölçümler&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Görevlerin bir listesi ekranın sol alt köşesinde görünür. Drag &quot;Track&quot; (&quot;Diğer&quot; başlığı altında bulunan alt başlığıYukarıdaki uzay liste). Bu ekranın sol üst kısmında &quot;İz&quot; adlı yeni bir pencerenin açılması (Şekil 4A, adım 3) isteyecektir. </li><li> Parça pencerede &quot;Giriş&quot; sekmesinde (Şekil 4A, adım 4) den &quot;Puan&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Nokta Aracı (Şekil 4A, adım 5) tıklayın. </li><li> Hücre vücudun merkezi alanında fare ile tıklayarak göç neuroblast izleme başlatın ve zaman sukut son noktaya kadar hücre hareketlerini takip tutmak ulaşılır (3 hr-uzun film için örnek nokta sayısı 61 için) . </li><li> Veri seçmek edinmek için Ölçüm Menüsü (Şekil 4B, 6-7 adım) dan &quot;Ölçüm Item&quot;. Bir pencere ekranın merkezindeki görünür. </li><li> Bu pencerede, &quot;adı verilen yeni bir ölçüm öğe:&quot; seçin ve (Şekil 4C, adım 8) bir ad yazın. PR önce &quot;All zamannoktaları&quot; seçeneğini seçmeyi unutmayınessing OK (Şekil 4C, adım 9). Bir ölçüm öğesi dosyası time-lapse dosyası altında görünecek ve kantitatif analiz için parametreleri (örneğin göç mesafe, hız, yer değiştirme ve yer değiştirme oranı) içerecektir. </li><li> Bir pencerede (Şekil 4D, adım 10) olarak açmak için ölçüm öğe dosyasına çift tıklayın. </li><li> , Analiz hücrelerin tek parça görselleştirmek &quot;Display&quot; seçeneği (Şekil 4D, adım 11) adlı &quot;Paletli Point&quot; seçin. </li><li> Sağ Ölçüm Ürün dosyasını tıklayın ve ardından göç parametreleri analiz etmek Excel gibi programlarda ithal edilebilir bir metin dosyası olarak dışa aktarın. </li><li> , Filme dönemde her bir hücresi tarafından yapılan ölçüm Öğe dosyasında &quot;Display&quot; seçenekleri &quot;Nokta&quot; veya &quot;Nüfus&quot; seçin ve (her parça benzersiz bir kimliği vardır) kimliği tıklayın ardışık çerçeve ve duraklar arasındaki hareketlerini ölçmek için. Devam ile sonuçlanan dosya İhracatadımda 4.10 açıklandığı gibi ing. </li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain.">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li><li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions.">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain.">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb.">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury.">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li><li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury.">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li><li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury.">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883 (2008).</li><li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation.">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li><li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis,+spine+density,+synaptic+integration,+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons.">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174 (2012).</li><li>dal Maschio, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960 (2012).</li><li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).</li><li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+cell+migration:+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy.">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30 (2011).</li><li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls:+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis.">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13 (2011).</li><li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

RMS boyunca sinir atalarıdır Verimli göç fonksiyonel nöronlar 10 onların sonraki olgunlaşmasını sağlar. OB yönelik sinir atalarıdır Tanınmış akışları insan bebeklik görülebilir ve erken doğum sonrası insan beyin gelişiminde 27 önemli bir rol oynaması olasıdır. Ayrıca, bu hücreler, yaralanmaya ve nörodejenerasyon 4,28 etkilenen beyin siteleri hedef edebiliyoruz. Gerçek zamanlı neuroblast dinamikleri üzerinde gen manipülasyonu etkisini izlemek için güç...

Memeli beyninde, yeni nöron (nöron) &#39;nin üretimi başlıca iki bölgede doğumdan sonra ortaya çıkar, hipokampus 1 kıvrımlarının lateral ventriküllere ve subgranular bölgesinin subventricular bölgesi (SVZ). Son yıllarda toplanan önemli kanıtlar hipokampus ve koku alma ampul hafıza fonksiyonları 1-3 doğum sonrası nöron için kritik bir rol destekler. Önemlisi, doğum sonrası nörogenezis aynı zamanda terapötik çünkü dejeneratif nörolojik bozuklukları ile ilişkisi potansiyelini ve beyinde 4-6 yaralı sitelere göç neuroblasts yeteneğini tutar. Subventricular bölgesi (SVZ) son zamanlarda önemli bir nörojenik niş olarak ortaya çıkmıştır. SVZ&#39;una türetilmiş Nöroblastlar bu doğum sonrası beyin 1,7,8 en uzun göç süreci yapma, rostral göçmen akışı (RMS) aracılığıyla koku ampul (OB) doğru göç ederler. Memeli SVZ / RMS / OB sistemi haline gelmiştirBöyle çoğalması, göç ve farklılaşma 1,8 nörogenezin farklı adımlar, incelemek için yararlı bir model. Birçok büyüme faktörleri ve hücre dışı ipuçları RMS boyunca SVZ&#39;una nörogenezi ve göç düzenleyen, ancak hücre içi moleküler mekanizmalar tam olarak uzak olmaktan 1,9 anlaşılamamıştır. RMS boyunca doğru göç yenidoğan nöronların 10 sonradan olgunlaşması için çok önemlidir. Ayrıca, bazı çalışmalar SVZ&#39;una türetilmiş Nöroblastlar beyin hasarı sitelere 4-6,11-13 için RMS dışına göç olduğunu göstermiştir. Bu durumda, sinyal düzenleyici mekanizmalar neuroblast göç soruşturma nöron anlamak için sadece temel hem de potansiyel terapötik uygulamalar içindir. Burada, in vivo doğum sonrası elektroporasyon ile SVZ&#39;una sinir atalarıdır etiket ve time-lapse dönen disk konfokal microsco kullanarak akut beyin dilim kültürlerde RMS boyunca onların göç izlemek için ayrıntılı bir protokol açıklarpy. Elektroporasyon yaygın embriyonik yetişkin evrelerinde 14-18 gelişimsel çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu SVZ&#39;una sinir atalarıdır hedef ve işlemek için güçlü bir araçtır ve transgenik modeller 1,15,19,20 viral vektörlerin veya kuşak stereotaktik enjeksiyonu için daha ucuz ve çok daha hızlı bir alternatif temsil eder. Bu ameliyat gerekir ve yüksek sağkalım oranlarına sahip değildir nispeten basit bir işlemdir. ShRNA veya loxP sistemi ilgi genlerin hedeflenmesi ya da SVZ progenitörlerinin kalıcı etiketleme elde etmek, böylece yetişkin nöron çalışmalar 21,22 için yararlı bir araç temsil kullanılabilir kullanılarak fare Genetik modellerde CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon. Sağlam bir beyin görüntüleme RMS neuroblast göç nedeniyle hala geçerli teknik kısıtlamalar nedeniyle zordur. Ancak, bu süreç uygun bir Sist sağlamak akut beyin dilimleri, konfokal dönen disk time-lapse mikroskopi kullanılarak izlenebilirem yakından farmakolojik manipülasyon 23,24 için de müsait in vivo durum benzer. Time-lapse görüntüleme ile vivo doğum sonrası elektroporasyon Kavrama neuroblast hareketliliğini kontrol moleküler mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak ve beyin tamir teşvik etmek için yeni yaklaşımların gelişmesine katkıda bulunacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyindeki ana nörojenik niş biridir. Burada, sinir atalarıdır çoğalır ve koku ampul (OB) doğru rostral göçmen akışı (RMS) birlikte hareket edebilmek nöroblast doğuran. Bu uzun mesafe göç OB yenidoğan nöronların sonraki olgunlaşması için gereklidir, fakat bu süreci düzenleyen moleküler mekanizmalar hala belirsiz olmasıdır. Neuroblast hareketliliğini kontrol sinyal yollarını araştıran nörojenezindeki temel bir adım anlamak değil, aynı zamanda yaralanma, inme veya dejenerasyon etkilenen beyin sitelerini hedeflemek için bu neuroblasts yeteneği verilmiş, tedavi rejeneratif potansiyele sahip olabilir sadece. Bu yazıda; in vivo sonrası elektroporasyon ve fare RMS neuroblast göç sonraki zaman atlamalı görüntüleme için ayrıntılı bir protokol açıklar. Doğum sonrası elektroporasyon verimli SVZ&#39;una dede transfect olabilirsırayla RMS boyunca göç neuroblasts oluşturmak hücreleri. Akut beyin dilim kültürleri disk time-lapse mikroskopi iplik konfokal kullanarak, neuroblast göç yakından in vivo durumu andıran bir ortamda izlenebilir. Ayrıca, neuroblast hareketliliği izlenen ve kantitatif analiz edilebilir. Örnek olarak, biz RMS boyunca göç neuroblasts etiket ve görselleştirmek için bir GFP-ifade plazmid in vivo doğum sonrası elektroporasyon nasıl kullanılacağını açıklar. LoxP sistemi vasıtası ile koşullu knockout farelerde shRNA veya CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon de ilginç genlerin hedeflenmesi için kullanılabilir. Akut beyin dilim kültürlerin Farmakolojik manipulasyon neuroblast göç farklı sinyal moleküllerin rolünü araştırmak için yapılabilir. Time-lapse görüntüleme ile vivo elektroporasyon bağlanmasıyla, biz neuroblast hareketliliği kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak ve geliştirmek için katkıda bulunmayı umuyoruzRomanın Ment beyin tamir teşvik yaklaşır.

SVZ türevi göç neuroblasts işaretlenmesi genellikle 4-8 gün başarılı bir elektroporasyon (Şekil 1 B) sonra, RMS boyunca gözlenebilir. Daha uzun süre noktaları da seçilebilir, ancak çoğu OB girmiş olacağından daha az hücre RMS bulunacaktır. Nöroblastomun yaklaşık 2-3 hafta sonra, elektroporasyon (gösterilmemiştir), OB olgun granül hücrelerin morfolojisi ve tipik özellikleri elde başlar. ~ 1 saat kültür işleminden sonra, elektroporasyona fare yavrularından Beyin dilimleri ...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices at JoVE.com

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K Görüntüleme.  King's College London.  Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir. 

Video: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...