Biz değerli uzmanlık için teknik yardım ve Dr. Shivraj Tyagi Emeka Ifedigbo teşekkür ederim. Ayrıca Harvard NeuroDiscovery Merkezi mikroskobu ile yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Amerikan Kalp Birliği tarafından hibe 09PRE2250120 Hilaire Lam ve AMK Choi verilen NIH hibe R01-HL60234 R01-HL55330 R01-HL079904 predoctoral kısmen desteklenmiştir.

Genel protokol, hayvan doku, hücre çoğalması için 5-10 gün ve hava-sıvı arayüzü hücre farklılaşması için ek bir 10-14 gün için 2 gün hücre izolasyonların gerektirir. Ek bir gün hücre pozlama ve numune hasat için gereklidir. 1. Fare Trakeobronşiyal Epitel Hücreleri (Mtec) izolasyonu. Not: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler ve Brigham ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Okulu Alanı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Başlamadan önce: <ul><li> Ham F12 Medya antibiyotik içeren hazırlayın. 250 ml Ham F12 bazal medya (Cellgro) 2.50 mL 100 X Penisilin / Streptomisin (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) solüsyonu, 1000 X Fungizone çözüm 250 mcL ekleyin . 4 haftaya kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. </li><li> % 0,15 Pronase bir çözüm hazırlayın. Ham F12 Medya antibiyotik içeren 10 ml için 15 mg Pronase ekleyin. Taze ve kullanana kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Temiz bir çalışma yüzeyine ve steril cerrahi aletler, küçük bir hayvan ameliyatı için uygun ve hücre izolasyonların için bir lamelli doku kültürü kaputu hazırlayın. Hayvan hücre kültürü için nemlendirilmiş CO 2 inkübatör, soğuk oda, masa hücre santrifüjler, ters mikroskop ve tek kullanımlık plastik pipet ve kültür eşya da dahil olmak üzere diğer tüm ekipmanları standart olarak kabul edilir. </li><li> Kollajen hazırlayın solüsyonu (0.02 N asetik asit, 50 mg / ml). 12 transwell plaka (Corning) her kuyuya Pipet 1.0 mL kollajen çözüm. Parafilm sarın ve oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde bir gece bekletin. </li></ul><ol><li> Piyasada satılan bir fare suşu (eski, yani erkek 6-8 hafta C57BL / 6) kullanarak, fareler gibi CO 2-kaynaklı narkoz ötenazi onaylanmış bir yöntem kullanarak euthanize . Genelde 6 fareler 12-iyi transwell plaka tohum için yeterli hücreleri (1.5-2.0 x 10 5 hücre / fare) verecektir. </li><li> Alanında sterilize etmek için 70% EtOH çözüm ile hayvan leşleri püskürtün. </li><li> Temiz cerrahi makas, neşter ile trakeal alanı çevresinde deri kaldırmak ve trakea maruz. Karnın aç, sternum boyunca kesme ve göğüs kafesi kaldırmak. Trakea sonuna maruz kadar doku çıkarın. </li><li> Buz üzerinde, antibiyotik içeren 30 ml Ham F12 medya içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirin tracheas. </li><li> Steril bir lamel akış kaputu, antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren steril bir 100 mm Petri kabında trakeal doku transferi. </li><li> Yavaşça steril forseps ve cerrahi makas ile bağ dokusu disseke. </li><li> Durulamak için antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren yeni bir 100 mm Petri kabında trakeal doku aktarın. Tracheas lümen maruz dikey eksen boyunca kesin. </li><li> 10 ml% 0,15 Pronase çözüm içeren 50 ml tüp tracheas aktarın ve 4 gece boyunca inkübe ° C </li><li> Ikinci gününde, hazır bulundurun: <ul><li> DNAz Ben çözümü hazırlayın. Içeren antibiyotikler -20 1 ml alikotları ve mağaza olun, 10 mg / ml Sığır Serum Albumin (BSA) stok solüsyonu 2 ml, 10 mg ve ham pankreas DNAz I. eklemek Ham F12 Medya ° C 18 ml (üzerinde çözülmüş Kullanmadan önce buz). </li><li> % 20 fetal sığır serumu (FBS) ile antibiyotik içeren Ham F12 ortamı hazırlayın. 200 ml Ham F12 bazal medya (Invitrogen) 50 ml ısı inaktive FBS 2.5 ml, 100 X Penisilin / Streptomisin (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) çözeltisi ve 250, 1000 X Fungizone çözüm mcL ekleyin . </li><li> Mtec Temel Orta antibiyotik içeren hazırlayın. 475,5 ml DMEM/F12 temel medya (Cellgro -) 7.5 mL 1 M Hepes çözüm, 200 mM glutamin çözüm, 2 mL% 7.5 NaHCO 3 çözümü, 100 X penisilin / streptomisin çözüm 5 ml, 10 ml, 500 mcL ekleyin 1000 X Fungizone çözüm </li><li> Mtec medium/10% FBS hazırlayın. Mtec temel orta antibiyotik içeren 45 ml, 5 ml ısı inaktive FBS ekleyin. </li></ul></li><li> Yavaşça tüp (Adım 1.8) 10-12 kez, rock ve sonra 4 oC de 30-60 dakika bekletin ° C. </li><li> Tüp ve kaya 12 kez% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya ekleyin. </li><li> 3,% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren 15 ml konik tüpler hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde bu çözüm bir kenara koyarak, Pronase çözüm tracheas çıkarın. Ham F12 içeren ilk konik tüp tracheas transferi ve tüp 12 kez ters. Bu işlem iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Biri 50 ml tüp içine adım 1.13 üç süpernatantlar Pronase çözüm birleştirin. Kalan doku atın. </li><li> 4 dakika 10 ° C ve supernatant atmak için; 1400 Santrifüj (A-4-62 rotor ile donatılmıştır Eppendorf 5810R santrifüj 390 xg). </li><li> Yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin, 1 ml DNAz çözüm pelet (100-200 mcL / trakea)ve 5 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 5 dakika 4 ° C ve supernatant atmak için 1400 (390 xg) santrifüjleyin. </li><li> 8 mL Mtec orta% 10 FBS içeren hücre pelletini tekrar </li><li> Primaria Plakalar Plaka hücre süspansiyonu (Falcon). 37 inkübe ° C% 95 hava atmosferi,% 5 CO 2, 5 saat (Not: Bu fibroblastlar için negatif bir seçim adım) . </li><li> Plakalar hücre süspansiyonu toplayın ve 4 mL Mtec% 10 FBS içeren plakalar iki kez yıkayın. Havuz hücre süspansiyonu ve 50 ml konik bir tüp içinde birlikte yıkar. </li><li> Sitospin ve hücre sayımı için 1 ml koruyun. 5,000 rpm (Eppendorf 5415D) 5 dakika için bir masaüstü santrifüj Spin. Kalan süpernatant 500 mcL ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Tripan Blue hayati boyama yöntemi kullanılarak hücre sayımı için 100 mcL kullanın. Sitospin analizi için 4 alikotları 100 mcL tasarruf </li><li> 4, 1400 (390 xg) Spin kalan 15 ml hücre süspansiyonu ° C&#39;de 10 dakika. </li></ol> 2. Mtec Hava-Sıvı Arayüz, Yayılması ve türevleri Retinoik asit stok çözelti hazırlayın. Stok çözelti A:% 95 EtOH bir 5 mM stok solüsyonu yapmak için karanlıkta Retinoik asit (Bay 300,44 g / mol) tartılır. -80 ° C bir folyo sarılmış tüp içinde saklayın Gerektiğinde Hazır B çözeltisi (5 mcM), 50 mcL Menkul Kıymetler A, 500 mcL BSA çözüm (100 mg / ml) ve 49.5 ml Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek hazırlayın. Bir folyo ile muhafaza için -80 ° C&#39;de 4 hafta kadar tüp tamamladı. Retinoik asit içeren Mtec çoğalması ortamı hazırlayın. Antibiyotik içeren 45,7 mL Mtec bazal medya için, 2.5 ml ısı inaktive FBS, 1 ml Retinoik asit Menkul Kıymetler B, 250 mcL İnsülin solüsyonu (2 mg / ml insülin 4 mM HCl), 250 mcL Epidermal büyüme faktörü çözüm (5 mg / eklemek , 1 mg / ml BSA içeren HBS ml EGF), 200 mcL sığır hipofiz ekstresi (HBS 1 mg / ml BSA içeren 15 mg / ml), 50 mcL Transferrin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 5 mg / ml transferrin ), 50 mcL kolera toksin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 100 mg / ml). Filtre son medya sterilize hazırlık ve hazırlık 2 gün içinde kullanın. <ol><li> Transwell plakaları kollajen çözüm çıkarın, kaputun altında 5 dakika boyunca bekletin ve PBS 2 kez yıkayın. </li><li> Ardından santrifüj, proliferasyon medya (500 mcL) uygun bir hacmi de ortalama 7.5 x 10 4 -1.0 x10 5 hücre kaplama kolaylaştırmak için hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Transwell polikarbonat membran eklemek apikal yüzeye Pipet 500 mcL hücre süspansiyonu. 1,5 mL çoğalması medya transwell bazal bölmesine ekleyin. </li><li> 37 batık Mtec kültürler inkübe ° C,% 95 hava içeren bir nemlendirilmiş inkübatör 7-10 gün için% 5 CO 2. </li><li> Medya ilk kez değiştirmeden önce üç gün bekleyin. Her gün medya değiştirin. (EVOM Ohmvoltometer, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL), bir elektrot kullanarak transepitelyal hücre direnci görsel denetim ve ölçüm kültürler izleyin. </li><li> Hücreleri konfluent görünür ve epitel direnci 1000 Ω / cm 2 ulaştığında, hücreler ALİ ayırt etmek için hazırız. </li><li> % 2 NuSerum içeren Mtec bazal ortamı hazırlayın. % 2 V / V nihai konsantrasyonu Mtec temel orta NuSerum ekle Kullanmadan önce son konsantrasyonu 1 X 10 -7 M retinoik asit Menkul Kıymetler B ekleyin. Taze hazırlayın ve 2 gün içinde kullanın. </li><li> Hücre apikal medya kaldırılması ve yerine% 2 Nuserum ve retinoik asit içeren 750 mcL Mtec bazal medya ile bazal medya, 10-14 gün için ayırt etmek için izin verin. Bazal medya değiştirin ve apikal tarafında% 2 NuSerum içeren Mtec her gün yıkayın. </li></ol> 3. Sigara Duman Uygulama Kültür Epitel Hücreleri <ol><li> CS hücre poz sistemi (EMI Instruments, Pittsburgh, PA) kullanarak ana sigara dumanı transwell kültürlerin apikal tarafında Açığa. Cihazın fotoğraf için Bkz: Şekil 1. Teknik özellikler için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakın. Kısacası, aparat, havalandırmalı bir pozlama odasına bağlı bir polipropilen hattı ana duman çizim ~ 7-8 ponponları her sigara içiyor peristaltik bir pompa oluşur. Maruz kalma odasında dolaşan su ° 37 ° C&#39;de muhafaza ve% 5 CO 2 gaz hattı üzerinde bir atmosfer korunur. Hücreleri Kentucky 3R4F araştırma referans filtre sigara (Tütün Araştırma Enstitüsü, University of Kentucky, Lexington, KY) kullanarak dumanına maruz kalabilirler. Genelde hücrelerin toplam partikül madde (TPM) 100-200 mg / m 3 verimli 1-2 sigara dumanına maruz kalmaktadır. Kontrol kültürleri eşdeğer bir pozlama süresi oda havaya maruz kalır. </li><li> TPM, TE ile birlikte üreticinin protokole göre ölçülür.-10c sigara makinesi (Teague&#39;nin Şirketler). Kısaca, bir filtre (Pallflex) bir satır içi paslanmaz çelik tutucu bir sabit akış pompası (örnekleme birimi) için sigara içme odası örnekleme port önde gelen bir örnekleme tüp yerleştirilir. Bir çıkış tüp gaz sayacı (Kuru Gaz Sayacı, ONM61, 67, AEM) örnekleme birimi bağlanır. Filtre gaz örnekleme önce ve sonra tartılır. Mg filtre üzerinde biriken toplam malzeme örneklenir havanın toplam hacmi için normalize. </li><li> Hücreler daha sonra herhangi bir zaman noktasında (örneğin, 0-24 saat) mesaj standart hücre analitik prosedürler için maruz kalma (yani Batı immunoblotting analizi, mRNA analizi, vb..) Ya da mikroskobu (yani, konfokal veya elektron mikroskobu) hasat edilebilir. Kültür ortamı da sitokinler veya sitotoksisite deneyleri için LDH serbest için analiz edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar ALİ başarılı epitel izolasyon, proliferasyon ve farklılaşma bir arnavut kaldırımlı morfolojisi ile sağlam bir tek tabaka boyun eğmek zorundadır. Sağlıklı kültürlerin Transepithelilal hücre direnci yaklaşık 1000-2000 Ω / cm 2 olmalıdır. Şekil 2 fare solunum yolu epitel hücreleri, kontrol koşulları altında ve sigara dumanına maruz kaldıktan sonra, epitel hücre ve kirpikler belirteçler için lekeli bir tek tabaka gösteriyor. Şekil 3 ultrastrüktür ve kirpikler morfoloji gösteren, sağlıklı Mtec kültürlerin temsilcisi elektron mikrograflar gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 üç faz, bir izolasyon adım, bir yayılma aşamasında, ve bir farklılaşma aşamasında hava-sıvı arayüzü (düzeni) ile epitel hücreleri gelirleri hazırlanması. Epitel hücreleri, fare batık kültürü yayılmaya transwells üzerine numaralı seribaşı trakea, izole edilmiş, ve sonra tam olarak ayırt hava-sıvı arayüzü dönüştürülür. Deneyler genellikle sürekli kültürün 24. gününde yapılmaktadır. Resmi kültür hücreleri ana sigara dumanına maruz kalma için bir model sistem gösteriyor. Transwell ALİ kültür sistemi, sıcaklık, nem ve CO 2 kontrollü özel modüler sigara dumanı dağıtım sistemi içine yerleştirilir . <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Epitel hücre kültürleri sabit ve lekeli çekirdekleri (Hoechst 33.258), F-aktin (yeşil; Alexa Fluor 488-konjuge Phalloidin) ve kirpikler işaretleyici asetillenmiş α-tubulin (kırmızı, Cy3-konjuge sekonder antikor). Alt paneller, 4 saat sigara dumanına (2 sigara, 150 mg / m 3) maruz kalmaktan sonra alınan epitel hücreleri eşdeğer görüntüleri göstermek. (B) Laktat dehidrogenaz (LDH) yayın gösterildiği gibi sigara dumanı değişen dozlarda maruz kalma 24 saat sonra bazal ortamda ölçüldü. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 fare trakeal epitel epitel hücreleri izole Hava-sıvı arayüzü kültürler, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bazal ve non-siliyalı tüycüklü hücreleri 1 özelliklere sahip çok sayıda alt tipi ayırt . Bu hücreler, yalancı solunum yolu epitel örneğini oluşturmaktadır. Şekil etiketler karşılık: bb: Bazal vücut, bir axoneme m: mitokondri, n: nükleus, s: substratı (polikarbonat membran), mv: microvili

<ol>
	<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).</li><li>Davidson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+epithelial+cells:+isolation+and+culture.">Murine epithelial cells: isolation and culture.</a> J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).</li><li>Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+model+of+differentiated+murine+tracheal+epithelium.">A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).</li><li>Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.;+Global+Initiative+for+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.+Global+strategy+for+the+diagnosis,+management,+and+prevention+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease:+GOLD+executive+summary.">et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary.</a> Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li><li>Macnee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease.</a> Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).</li><li>Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art.+Cellular+and+molecular+mechanisms+of+alveolar+destruction+in+emphysema:+an+evolutionary+perspective.">State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).</li><li>Yao, H., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+on+the+role+of+inflammation+in+COPD+and+lung+cancer.">Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).</li><li>van der Toorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+irreversibly+modifies+glutathione+in+airway+epithelial+cells.">Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).</li><li>Slebos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+localization+and+function+of+heme+oxygenase-1+in+cigarette+smoke-induced+cell+death.">Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).</li><li>Kim, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+proteins+regulate+cigarette+smoke+induced+apoptosis:+protective+role+of+heme+oxygenase-1.">Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1.</a> Autophagy. 4, 887-895 (2008).</li><li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).</li><li>Okuwa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+for+cigarette+smoke+using+a+whole+smoke+exposure+system:+A+comparison+of+smoking+regimens.">In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens.</a> Exp Toxicol Pathol. , (2009).</li><li>St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+in+vitro+models+of+cigarette+smoke+exposure.">Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure.</a> Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).</li><li>Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+alters+tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+1+and+matrix+metalloproteinase+9+levels+in+the+basolateral+secretions+of+human+asthmatic+bronchial+epithelium+in+vitro.">Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro.</a> J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).</li><li>Rennard, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+in+research.">Cigarette smoke in research.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).</li><li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoke+gets+in+your+cells.">Smoke gets in your cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).</li></ol>

Fare trakeal epitel hücreleri izole açıklayan protokol 1, Sen ve ark protokolleri adapte ve diğer modifikasyonlar ile 2-3. Hücre izolasyonların açıklayan herhangi bir protokol olduğu gibi, en kritik yönü, sıkı aseptik teknikler kullanılarak bakteriyel veya fungal patojenlerin bulaşmasını önlemek için. Ikinci bir kritik adım fibroblast tracheas dikkatli diseksiyon ile önlenebilir kültürlerin kirlenme, Adım 1.19 açıklandığı gibi negatif seçim önlemek için. Kü...

* Sigara makinesi, özel tasarlandı ve üretildi 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;Çift odacıklı ve su ceketli ışık tonunu açık bir delilidir 1 / 2&quot; sıcaklık kontrollü, su seviye sensörü ile sigara dumanına maruz kalma kalınlığında polikarbonat Lexan odacıklı sistem kapanma kontrol. Şişirme / birim sigara bir sigara oranları şişirme bir değişken sigara yüklü. Ünite kullanılmadığı zaman, sıcaklık, nem ve karbondioksit sistemi kontrol anlamında bir inkübatör taklit eder. Sistemi içerir: (I), doku kültürü deneyleri için kontrollü bir ortamda muhafaza özelleştirilmiş bir çift odacıklı / su ceketli birim. (II) dijital ağır su seviye sensörü ve sıcaklık kontrolü (III) pompa şişirme sigara birimi ile yüksek hassasiyetli çift pompa su sıcaklığı sirkülatör sistemi. In-Line (IV) bir pompa döngüsü sensörü kontrol oranı cycler (IV) Paslanmaz çelik yüksek hassasiyetli filtre tutucu. (V) Ayrılabilir kapağı için parantez ile 11 / 2 &quot;boyutlu eksenel tekdüzelik sigara dumanı karıştırma fan (VI) su sirkülatör için montaj aparatı ile orta boy bir su banyosunda (VII) 1 / 2 &#39;kalın Pleksiglas tepsi monte sigara külü koleksiyoncu için puf pompa ve tutucu. Bu makine, açıklandığı gibi, TSE sistemleri (edinilebilir gibi piyasada bulunan benzer sigara makineleri ile ikame edilebilir <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

Akciğer epitel hücreleri farelerin solunum yolu ve hava-sıvı arayüzü (ALI), farklılaşmış solunum yolu epitel bir model olarak kültüre izole edilebilir. CS maruz epitel hücre yanıtlarını araştırmak için bir protokol, ana sigara dumanı (CS) bu hücreler izole etmek ve sergilemek için tarif edilir. Fare trakea, hava-sıvı arayüzü (ALI) tam olarak farklılaşmış epitel hücreleri bu hücrelerin kültür ve kültür alanında bu hücrelerin kalibre ana CS teslim hava yolu epitel hücreleri izolasyonu: protokol üç bölümden oluşur. ALİ kültür sistemi, solunum yolu epitel kültürünü daha yakından sıradan sıvı kültür sistemleri daha fizyolojik ayar benzer koşullar altında izin verir. CS maruz kalma, moleküler ve akciğer hücresel yanıtları çalışmada, çevresel hava kirliliğinin insan sağlığı üzerindeki etkisini anlamak önemli bir bileşeni. Araştırma bulguları, bu alanda sonuçta kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve büyük küresel sağlık sorunları temsil eden diğer tütüne bağlı hastalıklar, etyolojisi anlamak yolunda katkıda bulunabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface at JoVE.com

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

33.8K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.

Video: Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Tıp

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Sigara Duman maruz kalan Fare Akciğer Amfizem ve Küçük Havayolu Yaptırma otomatik ölçüm

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

Bir Elektronik Romanda Elektronik Sigara Buharı ve Sigara Dumanının Etkilerinin Karşılaştırılması<emIn vivo</em&gt; Pozlama Sistemi

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.