Bu malzeme, çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe No: 0842736 altında tarafından desteklenen dayanmaktadır.

Roman GFS Yapılandırma Giriş Düzenli bir ışık mikroskobu, bir ekvatoral montaj, kamera ve bilgisayar [Şekil 1]: GFS birkaç temel bileşenleri içerir. Örnek tutan kapalı bir akış hücre odası GFS tasarımına göre vazgeçilmezdir. Işık mikroskobu kapsamında uzayda farklı yönlerde döndürülebilir, böylece ekvatoryel kundak üzerine monte edilir. Bu yetenek, statik ağırlık vektör yerçekimi kuvveti örnekleri piconewton menzilli kuvvet yükleri aktarabilir örnekleri, vektör ile ilgili dinamik odaklı böylece istismar olanak sağlar. Kamera, ışık mikroskobu oküler lens yerine, bu yönde örnek değişiklikleri kaydedebilirsiniz. Bu ham veri sayısallaştırılmış ve gerçek gücü ve mesafe ölçümleri içine verileri yorumlamak için bilgisayar tarafından manipüle. Kapalı akış odacıklı örnek kaybı olmadan uzayda özgürlüğü tüm dereceler izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Odasında odasının yüzeyine yapıştırılmış bir &quot;demirlemiş&quot; boncuk bir ucuna yakın gergin örnek molekülü bulunur. Ters terminus odasının yüzeyinden bir &quot;cep&quot; boncuk bağlı. Bu, yerçekimi kuvveti, böylece bu kadar düşük kuvvet yükleri gergin bir molekül uzanan üzerine hareket olabilir tahlil tampon ücretsiz mobil boncuk [Şekil 2]. Iki boncuk akış odasının yüzey üzerinde oturan çiftleri bir molekül bağlılığını birleştiğinde iyi kullanılabilir çiftleri ayırt etmek biraz tecrübe sürer rağmen basit örnek, mikroskop altında mikroküreler bir çift gibi görünüyor. Sisteme bir değişiklik GFS tutan ve yaylar tarafından askıya alınır bir yüzer platform ektir. Bu yapılandırmada, bir zamanlar örnek yerçekimi kuvveti örnek üzerinde hareket edebilir bir konuma döndürülmüş, platform ve tüm bileşenler sabit bahar karşı düşmüş olabilir. Serbest düşüş civarında, mobil boncuk üzerine etki eden kuvvet sıfıra yakındır ve yaylar maksimum uzantısı, iki kez olduğunca yerçekimi kuvveti ile çarpılır. Bu şekilde, kademeli bir kuvvet / mesafe yanıt farklı kuvvet yükleri tek bir molekülün davranışlarını ölçmek için grafikle gösterilebilir. 1. Microsphere Hazırlık <ol><li> 0.04% 3-iki dakika Aminopropyltriethoxysilane (aseton ile kesilen) cam veya silika boncuk yaklaşık 10 mg Submerge. </li><li> Iki değişiklik çift distile su ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 2000 XG pelet için santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> Kaplin tamponu (0.01 M piridin çift distile su ile kesim ve pH 6,0 &#39;a ayarlayın) 5 ml ekleyin ve bu karışımı kuvvetlice sallayın. Yukarıda açıklandığı gibi santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Boncuk ıslak kek için, (kaplin tampon gluteraldehid kesmek) 2 ml% 5 gluteraldehid çözüm ekleyin. Çalkalanır. </li><li> Kaputun altında, oda sıcaklığında 3 saat / gluteraldehid karışımı boncuk döndürün. </li><li> Yukarıdaki gibi Santrifüj ve süpernatant aspire. </li><li> Şiddetle sallayarak kaplin tampon 5 ml boncuk yıkayın ve süpernatant santrifüj ve aspire. Bu üç kez daha tekrarlayın. </li><li> Boncuklar istenilen antikor yaklaşık 15 mcL ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Boncuk 16-24 saat boyunca rotasyona tabi tutulmalıdır. </li><li> Kaputun altında, 1 M glisin su verme solüsyonu 5 ml (glisin çift distile su ile kesme ve pH 7.0 &#39;ye ayarlamak) ekleyin. Bu karışımı kuvvetlice çalkalayın ve 30 dakika çevirin. </li><li> Santrifüj ve süpernatantı aspirat. </li><li> Yıkama tamponu (% 0,1 sodyum azid;% 0,1 BSA, 0.15 M NaCl ve 0.001 M EDTA 0,01 M Tris, pH 7.0) 5 ml ekleyin. Şiddetle bu çalkalayınız, santrifüj ve süpernatantı aspirat. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Düşük tuz tamponu (0.02 M imidazol; 5 mM MgCl 2; pH 7.0 &#39;ye uyum 0,1 M KCl) tamponu değiştirin. Üç kez tekrarlayın. </li></ol> 2. Örnek Eklenti için Mikroküreler <ol><li> Hazırlanan boncuklar küçük bir miktar alın ve bunları eklemek (partiler arasında çapı büyük bir tutarsızlık varsa, ancak yaklaşık 2 mcL boncuklar her pasta, büyük ve küçük boncuklar 8:1 oranı etrafında kullanımı avantajlıdır.) tahlil tamponu ile mikrosantrifüj tüp. Tahlil tampon kullanarak, yaklaşık 5 mcM protein konsantrasyonu azaltın. Tampon, protein ve boncuklar dahil olmak üzere en az 400 mcL toplam hacmi hazırlayın. </li><li> (Protein, çok ajite ise, agrega ve işe yaramaz hale), 3 saat boyunca yaklaşık 1 RPM bu karışımın döndürün. </li></ol> 3. Slayt Odası Hazırlık <ol><li> % 0.01 nitroselüloz (amil asetat) ile kalın bir mikroskop lamı ceket. Bu slayt yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Keskin bir cam kesici ile bir oda yapmak için slayt kapsayacak şekilde kesti. Bu dört cam strip gerektirir. </li><li> Aslında kullanın.kenarının her iki tarafında vakum gres bir karalama karşısında cam ve komisyon bu ORY kenarı. </li><li> Basın yağ kaplı şeritler kuru nitroselüloz üzerine slayt yüzeyinde bir kutusu oluşturmak için slayt kaplı. </li><li> Kutu içinde cam yüzeye pipetter dokunarak boncuk / protein karışımı Pipet 2 hakkında mcL. </li><li> Yaklaşık 20-400 mcL, odanın ne kadar büyük bağlı olarak düşük tuz tampon ekleyin. </li><li> Zaten kapalı ve tamponlu odasına bitirmek için vakum yağ ile kaplı kutunun üstüne bir kapak kayma basın. </li><li> Boncuk nitroselüloz kendilerini demirlemek için yeterli zamanımız var, böylece slayt düzeyde bir yere oturup edelim. </li></ol> 4. GFS Veri Toplama <ol><li> GFS sahneye Dağı slayt </li><li> GFS kamera küçük Microsphere büyük Microsphere ekvatora yakın bağlı olduğu &quot;, boncuk çiftleri&quot; kayıt ve meşru araştırın ne olduğunu izleyin. </li><li> Potansiyel bir boncuk çifti bulunduğunda, &quot;cep&quot; boncuk slayt yüzey üzerine oturtulmuş olup olmadığını belirlemek için, odak derinliği üzerinden gitmek. </li><li> Bir kere uygun bir çifti tanımlanır, not açısı mobil boncuk d max uzak (d max = birleştiğinde mikroküreler sentroidler arasındaki maksimum mesafe). Kapsamı video satın almak için pozisyon içine taşıyın. </li><li> GFS seyahat açı d min, d max, molekülünün uzunluğuna bağlı olarak 25-90 derece diyebilirsiniz d dakika kayıt için yeterli olmalıdır. </li><li> Çifti olarak RECORD d d min max ve geri d dk gitti. </li><li> Bu analiz için daha sonra çıkarılmalıdır, böylece arka planda da bir film çekmek için iyi bir fikirdir. </li><li> GFS damla performans, d max kapsamı taşımak ve en az saniyede 60 kare hızla açılan kaydetmek. Kritik bir parçası ilk salınım, ancak uzun kayıt süreleri, aynı zamanda dinamik çalışma için kullanılabilir. </li></ol> 5. GFS Veri Analizi <ol><li> Dijital &quot;eşiklenir&quot; bir görüntü içine ham video Dönüşümü ve video her kare her boncuk ağırlık merkezi konumunu belirlemek için ImageJ makro çalıştırmak. Bu açılan video için de. </li><li> X, Y ve Excel&#39;e ImageJ alan veri dökümü ve puan arsa. </li><li> Uygun bir boncuk çifti video tarafından satın alındı, grafik gözle görülür bir kambur boncuk (d min) en yakın olmanın göstergesidir ve grafik apeks d max konumudur. </li><li> Bu verileri kullanarak, her bir boncuk yarıçap tam ImageJ belirlenir ve tüm bu bilgiler iç içe denklemi içine konur: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0.5 g = [d min 2 + r b 2 - (r + r b) 2] 0.5 = r b günah β c = d max - r - g (D = kütle merkezleri arasındaki mesafe; g = yerçekimi kuvveti; α = paralel derece objektif lens açısı, r b = mobil boncuk yarıçapı r = yarıçap demirlemiş boncuk ekseni kapalı eki β = açı ekvator bağlantılı boncuk. </li><li> Hacmi de verim ve boncuk, mobil boncuk molekülün kazandırır kuvvet yoğunluğu göz önüne alındığında, mobil boncuk takılmış yarıçapı kullanarak çıkarılır solvent kaldırma kuvveti sonra piconewtons hesaplanabilir. Bu yöntem piconewtons gergin bir molekül kuvvet F = V (db) bir (F = kuvvet, V = hacim, d = yoğunluk cam Microsphere, a = ivme ölçer ve nanometre antikor ekleri arasında mutlak molekül süresini hesaplar yerçekimi nedeniyle, b = yerinden su yoğunluğu). </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Boncuk hazırlık doğru yapılırsa, hala arada bir boncuk tutam olabilirse de, en az boncuk agregasyonu olacak. Kapsamı ile bakıldığında, odanın içinde eşleştirilmiş olsun veya olmasın boncuk makul bir dağıtım olması gerekir. Mümkün olduğunca titreşimleri en aza indirmek için önemlidir; bu ya bir hava tablo yapmak için, bir EQ monte tutan bir tripod için özel şok emici ayaklar, veya yayları titreşim izolasyonu için kullanılabilir kullanan sistem. Mühürlü akış odası ile ilgili bir diğer yararlı ipucu tam olarak inşa edildikten sonra bir seviye tablosunu yaklaşık beş dakika boyunca ayakta izin vermektir. Bu herhangi bir unattached boncuk büyük nitroselüloz tabakası tampon ve dinlenme ile şamandıra sağlar. Slayt yerine tamamlanması üzerine doğrudan monte edilmiş olsaydı, araştırmacı tam anlamıyla görüş alanı üzerinden uçan boncuklar ile başa çıkmak için sürekli olurdu ve bu video edinimi sırasında olur th bozabilire deney. Bu şekilde yapılırsa, boncuk uçuş önemli ölçüde en aza indirilmeli ve temiz bir video sonuçları. Potansiyel bir boncuk çifti GFS operatör tarafından tespit edildiğinde, bu çiftin davranışlarını izlemek için bir ön döndürme koymak için yararlıdır. Nadiren, büyük boncuk slayt sıkıca yapıştırılmış değildir. Bu durumda daha büyük satın alma süresi boyunca sabit bir pozisyonda boncuk kalış demirlemiş kritik, çünkü çifti kullanan hiçbir faydası yoktur. Çifti istikrarlı ve sergi gelmez &quot;Eğer demirlemiş boncuk rulo,&quot; o zaman deneyler için uygundur. Yerçekimi göre açı değişim karşısında boncuk ayırma mesafeleri bir arsa elde edilen verileri değerlendirmek için kullanılabilir. Iyi bir temsilcisi sonucu bir plato üzerinde küçük ayrımı gösterecek ve mobil boncuk yerçekimi etkisi nedeniyle bağlantılı boncuk kendini kurtarır gibi, grafiğin daha fazla ayrılık gösterecektir. Güzel bir zirveye ulaştı ve d max denir temel tekrar dönen eğrisi aşağıya doğru başlar kadar bu şekilde devam eder d min [Şekil 1]. İdeal koşullarda, bu imza simetriktir. Olmayan bir temsili bir sonuç tutarsız desenleri ile hiçbir farklı d min-d, max-d min desen gösteren bir grafik göstermek ya da arasında bir toz parçası vardı, belki de belirten tek bir molekül için çok yüksek büyüklüğü siparişleri ayrımlarını göstermek mobil boncuk sadece ekli olmadığı belki de boncuk, veya. Çifti bulma, çekim, işleme ve analiz süreci, uygunsuz boncuk çiftleri itlaf birçok durdurmak boşluklar vardır. Yani, sürecin sonuna kadar almak ve önceki sonuçlar ile tutarlı bir molekülün uzunluğu varsa, bir çok emin orijinal boncuk çifti temsilcisi ve sonuçları dahil edilebilir. Boncuk çiftleri çekim yaklaşık yarısı, iyi bir gününde, meşru bir veri noktası olmayı yoluyla alınmış olabilir. Örneğin, MF20 ve MF30 antikorlar arasında miyozin sarmal bobin uzunluğu, EM veri ve AFM, 100 nm 2,7,8,9 yaklaşım veri olarak bilinir. Sonucu bu uzunluğu birkaç kez ise, örnek toplanmış. Burada sunulan sonuçlar, standart GFS rotasyon deneyleri ve 96 nm ± 5 nm mesafe göstermek, [Şekil 2] MF30 ölçümleri ile yakından kabul eder (miyozin subfragment-2 N-terminus bağlar) ve MF20 hangi literatür değerleri çıkarılabilir miyozin (ışık meromyosin bağlanır) antikor ayırma mesafesi [Şekil 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 GFS yapılandırma. GFS ana bölümden etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 GFS prensibinin şematik. Sol tarafta en az mesafede demirlemiş boncuk centroid bir mobil boncuk centroid gösterir. GFS döndürülebilir olduğu gibi, mobil boncuk da gergin molekülünün ekseni ile paralel çalışan yerçekimi vektör ile hizalar. Bu pozisyonda, mobil ve bağlantılı boncuk sentroidler arasındaki mesafe maksimum. Sağ üst GFS film temsili bir dilim gösterir. Sağ alt GFS rotasyon geçiren bir görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 grafiğin sol d dakika gösteren Temsilcisi sonucu; 17,78 mikron göreceli bir ayrılık d max ve d boncuklar arasında göreli olarak ayrılması 17.75 mikron temel etrafında dakika dönüş . <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 GFS rotasyon deney ortalama MF20 ve MF30 antikorlar 96 nm arasındaki mesafeyi gösteren Temsilcisi sonuç. Bu S2 yaklaşık uzunluğu temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Miyozin II dimer antikor ve / veya aktin ekleri de dahil olmak üzere GFS ile kullanmak mümkün ekleri göstermek için kullanılır. Farklı farklı bölgelerde farklı GFS stratejilerini ölçmek için, ya da miyozin dimer çubuk etki gücü dik paralel olarak uygulamak veya eklenti olanakları sağlar.

<ol>
	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

Dijital eşiklenir bir temsili bir film dönüştürürken, bu, video, her çerçeve içinde aynı bölgede korumak için eşiklenir bir görüntü için çok önemlidir. , Bir boncuk çifti boncuk birbirlerinden bağımsız hareket nedeniyle, eşiklenir alanlarda herhangi bir sürüklenme boncuk sentroidler arasındaki izafi mesafeleri önemli bir hata da sürüklenme ve tanıtmak için neden olabilir. Eşik alanı kontrol 5 nm 26 nm mesafe ölçümlerinde hata beş kat azalttı. Ayrıca, mesafe ve kuvvet değerleri ve...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

Makromoleküler yapısının çalışmada, moleküler mekanizmaları ve fonksiyon aydınlatılması için kritik hale gelmiştir. Proteinlerin yapısal özellikleri kuvvet bağımlılığı test etme yeteneğine sahip, sınırlı, ama önemli birkaç bioinstruments vardır. Ölçeği araştırmacılar, nükleik asitler, enzimler ve yaşam sürdürme çalışma yapan motor protein molekülleri, nanomechanical dünyaya eş ne ​​kadar doğru bir sınırlama parametre olmuştur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elektron mikroskobu ile eşit bir mesafe çözünürlüğü ile lifli proteinler doğal yapıları belirlemek için ayarlanmıştır. Ancak, AFM kuvvet çalışmaları, güçleri genellikle tek bir molekülün daha yüksek 1, 2 yaşayabilirsiniz. Optik tuzakları (OT), tuzağa boncuk arasındaki göreceli mesafeyi belirleyen çok iyi ve çok küçük kuvvetlerle 3 aktarabilir . Ancak, bu çalışma kapsamında moleküllerin doğru mutlak uzunluk vermeyecektir. Moleküler simülasyonlar, bu tür deneylere destekleyici bilgileri sağlar, ama aynı büyük moleküler boyutlarda, uzun zaman dilimlerini, sap ve destekleyen diğer kanıtlar 2, 4 yokluğunda bazı araştırmacılar, ikna yeteneği sınırlıdır. Yerçekimi kuvveti spektrometresi (GDS) yeteneklerinin benzersiz bir kombinasyonu sunarak bir araştırmacının cephanelik kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu cihaz genellikle% 98 veya daha yüksek doğruluk femtonewton aralığı nanonewton aralığı ile güçlerini üretme yeteneğine sahiptir. Mesafe ölçümleri şu anda aşağı beş nanometre ve hassas optik yakalamak için benzer bir göreceli boncuk çifti ayırma mesafeleri mutlak moleküler uzunluğu çözme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, GFS germe veya kuvvet denge yakın olduğu uncoiling belirlemek veya ölçülen herhangi bir yapısal değişikliklere karşı yan yana getirmek kademeli güç sağlamak. Bu fizyolojik kuvvet yükleri 2 maddesi uyarınca olayları uncoiling kaç amino asit kalıntıları yer belirlemek için bile mümkün. GFS aksine, herhangi bir tahlil önce kapsamlı bir gücü kalibrasyon var, diğer yöntemler gibi kuvvet kalibrasyonu 5 gerektirir. Güçlü diğer yöntemleri tamamlayıcı olarak, GDS hayati proteinlerin ve diğer makromoleküllerin nanomekanik anlayış boşlukları arasında köprü olacak.

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins at JoVE.com

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Görüntüleme.  University of North Texas. Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Video: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Biyomühendislik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

Yerinde Basınç Yükleme ve Kemik-periodontal ligament-diş Lifli Joint Korelatif noninvaziv Görüntüleme

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Brillouin Saçılma Analiz Yüksek Hızlı Alt GHz Spektrometre

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...