Este material é baseado num trabalho apoiado pela National Science Foundation, Grant No. 0842736.

Introdução ao GFS Novel Configuração O GFS consiste de vários componentes essenciais: Um microscópio de luz comum, uma montagem equatorial, uma câmera e um computador [Figura 1]. A câmara de célula de fluxo selada que contém a amostra é também indispensável de acordo com o projeto GFS. O microscópio de luz é montado na montagem equatorial de modo que o escopo pode ser rodado em diferentes orientações no espaço. Esta capacidade permite que o vetor estático de gravidade para ser explorada de modo que as amostras podem ser dinamicamente orientada em relação ao vetor para que a força da gravidade pode transmitir cargas piconewton gama-força para as amostras. A câmera substitui a lente do microscópio de luz da ocular para que ele possa registrar as mudanças na orientação da amostra. Este dados brutos é digitalizado e manipulado pelo computador para interpretar os dados reais e em vigor medidas de distância. O fluxo de câmara selada foi concebido para permitir que todos os graus de liberdade no espaço sem perda de amostra. Na câmara reside a molécula da amostra que está preso perto de um terminal a um &quot;ancorado&quot; talão que é colada à superfície da câmara. O término oposto é amarrado a um &quot;mobile&quot; talão, que é livre a partir da superfície da câmara. É esta pérola móvel, livres no tampão de ensaio que podem ser postas em prática pela força gravitacional, assim, que se estende a molécula amarrados em cargas tão baixa força [Figura 2]. A amostra simplesmente parece um par de microesferas sob o microscópio, embora ele não ter alguma experiência para discernir o bem utilizável pares acoplados por seu apego a uma molécula de pares em que ambos os grânulos estão sentados na superfície do fluxo de câmaras. Uma modificação no sistema é a adição de uma plataforma flutuante que detém o GFS e está suspensa por molas. Nesta configuração, uma vez que a amostra foi rodada em uma posição onde a força gravitacional pode agir sobre a amostra, a plataforma e todos os seus componentes podem ser descartados contra a mola constante. Perto de queda livre, a força que age na esfera móvel é perto de zero e na extensão máxima das nascentes &quot;, a força gravitacional é multiplicado em até duas vezes. Desta forma, uma resposta de força / distância classificados podem ser representados graficamente para medir o comportamento de uma única molécula com cargas força diferente. 1. Preparação de microesferas <ol><li> Submergir cerca de 10 mg de contas de vidro ou sílica em 0,04% 3-Aminopropyltriethoxysilane (corte com acetona) por dois minutos. </li><li> Enxágüe com duas mudanças de água destilada duas vezes e centrifugar a pelota a 2000 xg por 5 minutos. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar 5 mL de tampão de acoplamento (0,01 M piridina corte com água destilada duas vezes e ajustar o pH a 6,0), e agitar a mistura vigorosamente. Centrifugar como descrito acima. Repita este passo três vezes. </li><li> Para bolo molhado de contas, adicione 2 mL de solução gluteraldehyde 5% (corte gluteraldehyde com tampão de acoplamento). Agite vigorosamente. </li><li> Sob um capuz, gire mistura / gluteraldehyde talão por 3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga como acima e aspirar o sobrenadante. </li><li> Lave as contas em 5 mL de tampão de acoplamento, agitando-os vigorosamente e centrifugar e aspirar o sobrenadante. Repita isso três vezes mais. </li><li> Adicionar cerca de 15 mL do anticorpo desejado para contas e agitar vigorosamente. As contas devem ser rodados durante 16-24 horas. </li><li> Sob o capô, adicionar 5 mL de uma solução de resfriamento M glicina (glicina corte com água destilada duas vezes e ajustar o pH a 7,0). Agite vigorosamente esta mistura e rodar por 30 minutos. </li><li> Centrífuga e aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 5 mL de tampão de lavagem (0,01 M Tris, pH 7.0; azida de sódio a 0,1%, 0,1% BSA, 0,15 M NaCl; e 0,001 M EDTA). Agite vigorosamente este, centrífuga e aspirar o sobrenadante. Repita este passo três vezes. </li><li> Alterar buffer para baixo teor de sal tampão (0,1 M KCl, 0,02 M imidazol; 5 mM MgCl 2; acertar a pH 7,0). Repita três vezes. </li></ol> 2. Anexo amostra para Microesferas <ol><li> Pegue uma pequena quantidade de contas preparados (cerca de 2 mL de cada bolo de contas no entanto, se há uma discrepância grande em diâmetro entre os lotes, é vantajoso usar em torno de uma relação de 08:01 de grandes para contas pequenas) e adicioná-los um tubo de microcentrífuga com tampão de ensaio. Reduzir a concentração de sua proteína para cerca de 5 mM, utilizando o tampão de ensaio. Prepare pelo menos um volume total de 400 mL, incluindo o buffer, a proteína, e as contas. </li><li> Gire essa mistura em torno de 1 RPM por 3 horas (se a proteína está agitado demais, ele vai agregar e tornar-se inútil). </li></ol> 3. Preparação de slides Câmara <ol><li> Revestimento uma lâmina de microscópio com espessura de nitrocelulose 0,01% (em acetato de amilo). Deixe este slide secar por cerca de 10 minutos. </li><li> Com um cortador de vidro afiada, corte tampa deslizante, de modo a fazer uma câmara. Isto requer quatro tiras de vidro. </li><li> Use o fato deory borda do copo e ajuntá-lo através de uma mancha de graxa de vácuo em ambos os lados da borda. </li><li> Tiras de graxa imprensa revestido em nitrocelulose seca coberta de slides para criar uma caixa na superfície da lâmina. </li><li> Pipetar cerca de 2 mL de mistura do grânulo / proteína tocando pipeta na superfície de vidro dentro da caixa. </li><li> Adicionar cerca de 2-40 mL de tampão sal dependendo de como grande da câmara é. </li><li> Pressione uma lamínula em cima da caixa que já está revestida com graxa de vácuo para terminar a câmara selada e tampão. </li><li> Deixe deslize sentar num lugar plano para que as contas tenham tempo suficiente para ancorá-los ao nitrocelulose. </li></ol> 4. GFS Aquisição de Dados <ol><li> Montagem de slides para GFS estágio </li><li> Monitorar o que a câmera está gravando GFS e procure legítimo &quot;pares talão&quot;, em que o micro é ligado pequena perto do equador da microesfera de grande porte. </li><li> Quando um par potencial talão é encontrado, vá até a profundidade de foco para determinar se o &quot;mobile&quot; talão não está descansando na superfície da lâmina. </li><li> Uma vez que um par adequado é identificado, note ângulo móvel talão é longe d max (d max = a distância máxima entre os centróides das microesferas acoplada). Mover o alcance em condições de adquirir vídeo. </li><li> O ângulo de deslocação do GFS deve ser suficiente para gravar d min, d max, min e d, que poderíamos chamar de 25-90 graus, dependendo do comprimento da molécula. </li><li> RECORDE como o par viaja d min para d max e volta para d min. </li><li> É uma boa idéia para também gravar um filme do fundo para que ele possa ser subtraída posteriormente para análise. </li><li> Se estiver executando uma queda GFS, mova o escopo de volta para d max e registrar a queda de pelo menos 60 frames por segundo. A parte crítica é a oscilação em primeiro lugar, mas longos períodos de gravação também pode ser usado para o estudo dinâmico. </li></ol> 5. GFS Análise de Dados <ol><li> Transformar vídeo bruto em digitalmente imagem &quot;thresholded&quot; e executar macro em ImageJ para determinar a posição do centróide de cada grânulo em cada quadro do vídeo. Este também é para o vídeo cair. </li><li> Despejar o X, Y e dados da área de ImageJ em Excel e traçar os pontos. </li><li> Se um bom par talão foi adquirida pelo vídeo, um corcunda perceptível no gráfico é indicativo das contas estar em suas mais próximo (d min) e no ápice do gráfico é a posição de d max. </li><li> Usando estes dados, o raio de cada esfera deve ser determinada precisamente em ImageJ e toda esta informação é colocada na equação aninhada: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5 g = [d min 2 + b 2 r - (r a + r b) 2] 0,5 = r sin β b c = d max - r a - g (D = distância entre centróides; g = força de gravidade; α = o ângulo em graus paralelo à lente objetiva; r b = raio de móveis talão; r a = raio de ancorado talão; = ângulo β de ligação fora do eixo da o equador do cordão ancorado. </li><li> Usando o raio equipados do talão móveis, que também dá o seu volume, e dada a densidade da esfera, a força do talão móvel transmite na molécula pode ser calculado em piconewtons após a flutuação do solvente é subtraído. Este método mede a força sobre a molécula amarrado em piconewtons e calcula o comprimento molécula absoluta entre os anexos de anticorpos em nanômetros. F = V (db) a (F = força, V = volume, d = densidade da microesfera de vidro, a aceleração a = devido à gravidade, b = a densidade da água deslocada). </li></ol> 6. Resultados representativos: Se a preparação do grânulo é feito corretamente, haverá agregação de talão mínimo, embora ainda possa haver um amontoado ocasionais talão. Quando vistos através do escopo, deve haver uma distribuição razoável de contas se emparelhado ou não na câmara. É importante para minimizar vibrações, tanto quanto possível, para fazer isso uma mesa de ar, absorvendo choques especiais para pés de um tripé que sustenta uma montagem EQ, ou no sistema que utiliza molas podem ser usados ​​para o isolamento de vibração. Outra dica útil relativamente à câmara de fluxo selada é deixá-lo repousar durante cerca de cinco minutos em um nível de tabela depois de ter sido totalmente construído. Isso permite que qualquer grânulos maiores unattached a flutuar para baixo através do buffer e descanso na camada de nitrocelulose. Se o slide eram vez montado diretamente em cima da conclusão, o investigador teria sempre têm de lidar com contas, literalmente, voando pelo campo de visão, e se isso acontece durante a aquisição de vídeo que pode corromper ªexperiência e. Se isso for feito corretamente, a fuga de talão é significativamente minimizado e os resultados mais limpo vídeo. Quando um par potencial talão é identificado pelo operador GFS, é útil para colocá-lo através de uma rotação preliminar para monitorar o comportamento do par. Raramente, o talão grande não é solidamente fixado sobre o slide. Se isso acontecer, não há nenhum uso em utilizar o par, pois é fundamental que a maior permanência do grânulo ancorada em uma posição fixa por toda a duração da aquisição. Se o par é estável e não apresenta &quot;roll talão ancorada&quot;, então ele é adequado para a experimentação. Um gráfico de distâncias de separação talão versus mudança no ângulo em relação à gravidade pode ser usado para avaliar os dados adquiridos. Um resultado bom representante mostraria pouca separação em um planalto e como o cordão móvel liberta-se do talão ancorado por causa da influência da gravidade, o gráfico vai mostrar mais a separação. Isso continua até que um pico legal é alcançado, que é chamado d max e para baixo a curva começa novamente retornando à base d min [Figura 1]. Em condições ideais, esta assinatura é simétrica. Um resultado não-representativa iria mostrar um gráfico com os padrões incoerentes não mostrando nenhuma d distintas min-max-d d padrão min, ou ele iria mostrar as separações que são ordens de magnitude muito alta para uma única molécula, indicando talvez houvesse um pedaço de poeira entre as contas, ou talvez que o talão móveis simplesmente não foi anexado a todos. O processo de encontrar o par, atirando-o, processá-lo e analisá-lo parar de muitos tem lacunas onde imprópria pares talão são abatidos fora. Então, se você chegar ao final de todo o processo e você tem um comprimento de molécula que é consistente com os resultados anteriores, pode-se ser muito confiante de que o par original talão é representativo e pode ser incluído nos resultados. Em um bom dia, cerca de metade do tiro pares de esferas pode ser tomada até se tornar um ponto de dados legítimos. Por exemplo, o comprimento da bobina enrolada de miosina entre MF20 e MF30 anticorpos, é conhecido com base em dados e EM AFM, dados para abordagem 100 nm 2,7,8,9. Se o resultado é várias vezes esse comprimento, a amostra agregada. Os resultados aqui apresentados são a partir de experimentos de rotação padrão GFS e demonstrar uma distância de 96 nm ± 5 nm, [Figura 2], que concorda em estreita colaboração com as medições do MF30 (que liga a N-terminal de miosina subfragment-2) e MF20 (que se liga na meromyosin luz) distância de separação de anticorpos sobre a miosina deduzida a partir dos valores da literatura [Figura 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. GFS configuração. Partes principais do GFS são rotulados. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquemática do princípio GFS. Lado esquerdo mostra centróide de móveis talão a uma distância mínima de centróide de talão ancorado. Como GFS é girada, móveis talão alinha com o vetor de gravidade, que também é paralela com o eixo da molécula amarrados. Nesta posição, a distância entre os centróides das esferas móveis e ancorado é, no máximo. Canto superior direito mostra uma fatia representativa de um filme GFS. Parte inferior direita é uma imagem da rotação GFS passando. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 resultado Representante mostrando min d à esquerda do gráfico;. D max em uma separação relativa de 17,78 mícrons, e um retorno à d min em torno da linha de base de cerca de 17,75 microns de separação relativa entre as contas. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Resultado Representante do experimento de rotação GFS mostrando distância entre MF20 e MF30 anticorpos média 96 nm. Isso representa a duração aproximada de S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Miosina II dímero usado para mostrar anexos possível para uso com o GFS incluindo anticorpos e / ou anexos de actina. Possibilidades diferentes de fixação permite diferentes estratégias GFS para medir diferentes regiões, ou para aplicar força perpendicular ou paralelo ao domínio da haste do dímero miosina.

<ol>
	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao converter um filme para uma representação digital thresholded, é crucial para a imagem thresholded para manter a mesma área em cada quadro do vídeo. Porque as contas em um par de esferas se movem independentemente um do outro, qualquer desvio nas áreas thresholded também pode causar as distâncias relativas entre os centróides das contas à deriva e introduzir erros significativos. Controlar a área limite reduzido o erro de cinco vezes nas medidas distância de 26 nm até 5 nm. Também é crucial para obter ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

O estudo da estrutura macromolecular tornou-se crítica para a elucidação dos mecanismos moleculares e função. Existem vários bio-instrumentos limitada, mas importante, capaz de testar a dependência força de características estruturais em proteínas. Escala tem sido um parâmetro limitante sobre a precisão pesquisadores podem perscrutar o mundo nanomechanical de moléculas, tais como ácidos nucléicos, enzimas e proteínas motoras que executam o trabalho de sustentação da vida. Microscopia de força atômica (AFM) é bem afinado para determinar estruturas de proteínas nativas fibroso com uma resolução distância a par com microscopia eletrônica. No entanto, em estudos AFM força, as forças são tipicamente muito maior do que uma única molécula poderá ter 1, 2. Armadilhas ópticas (OT) são muito bons em determinar a distância relativa entre as esferas de presos e que pode dar forças muito pequenas 3. No entanto, eles não rendem precisa comprimentos absoluta das moléculas em estudo. Simulações moleculares fornecem informações de suporte para tais experiências, mas são limitados na capacidade de lidar com os mesmos grandes tamanhos moleculares, prazos longos, e convencer alguns pesquisadores, na ausência de outras evidências 2, 4. A força gravitacional espectrómetro (GFS) preenche um nicho importante no arsenal de um investigador, oferecendo uma combinação única de habilidades. Este instrumento é capaz de gerar forças tipicamente com 98% ou maior precisão do intervalo femtonewton à gama nanonewton. As medições de distância atualmente são capazes de resolver o comprimento absoluto molecular até cinco nanômetros, e relativa distâncias par talão de separação com uma precisão semelhante a uma armadilha óptica. Além disso, o GFS pode determinar alongamento ou desenrolando onde a força está perto de equilíbrio, ou fornecer uma força de classificados de justapor contra qualquer medida mudanças estruturais. É ainda possível determinar quantas resíduos de aminoácidos estão envolvidos em eventos desenrolando sob cargas fisiológicas força 2. Ao contrário de outros métodos onde há força de calibração extenso que deve preceder qualquer ensaio, o GFS não requer calibração tal força 5. Complementando os pontos fortes de outros métodos, o GFS vai colmatar as lacunas na compreensão do nanomecânica de proteínas vitais e de outras macromoléculas.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Este é um passo-a-passo mostrando o objetivo, funcionamento e resultados representativos do espectrômetro de força gravitacional romance.

Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Vídeo: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ compressão de carga e de imagem não invasivos Correlative do Osso-Ligamento periodontal de dentes fibrosa Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocidade Spectrometer Sub-GHz para Brillouin Scattering Análise

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...