George Giudice ve Steven Eliason'a insan dermal fibroblastları ve Ramesh Raghupathy'yi gerinim izleme algoritmasına yardım için bağışlayarak teşekkür ederiz. Bu çalışma için destek, ABD Eğitim Bakanlığı Lisansüstü Yardım Ulusal İhtiyaç Bursu Alanlarında (GAANN P200A120071) tarafındansağlanmıştır.

1. Şablon Hazırlama
İstenen geometriyi(Şekil 1A ve 1B)izleyerek her eksplantın konumunu düzene almak için Parafilm üzerinde bir şablon hazırlayın. Her biri yaklaşık 1-2 mm aralıkla boşluk açın. Bu mesafe, eksplantlar arasında fiber hizalaması oluşturmak için ideal bir araya karşılık gelir. Kalıp, numunenin bantla hazırlanacağı örtü alanının altına takın.
2. Sterilizasyon
Biyoreaktörün tüm bileşenlerini% 70 etanol kullanarak iyice temizleyin ve deneyden önce UV ışığı altında 2-3 saat sterilize edin. Biyoreaktör yerine alternatif bir damar kullanılıyorsa uygun sterilizasyon teknikleri kullanılmalıdır. Cam alt Petri kabı kullanma hakkında yorum için 4.12 adımına bakın.
3. Fibrin Jel Hazırlama
Biyoreaktörün bileşenleri sterilize edildikten sonra, kapakçık yüzeyine ince bir fibrin jeli tabakası atın. 6.6 mg/ml fibrin jelleri yapmak için fibrinojen ve trombin stok çözeltileri hazırlamaya yönelik ayrıntılar Sander ve ark. 13 Ye ve ark. 3.3 mg/ml fibrin jelleri yapmak için 19 jove web sitesinde de görülebilir.
<ol><li>DMEM'de 10 milyon boncuk/ml konsantrasyonda floresan mikrobead çözeltisi hazırlayın. Boncuklar jel yer değiştirmelerini izlemek için kullanılacaktır. Bu konsantrasyonu elde etmek için, 0.017 ml mikrobead stok çözeltisini ve 0.149 ml DMEM'i bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.</li>
	<li>Boncukları dağıtmak ve çözeltiyi homojenize etmek için bu süspansiyonu 10 dakika boyunca sonicate edin.</li>
	<li>Fibrin Çözeltisi — 15 ml c-tüpte, 0,22 ml fibrinojen stok çözeltisi ile 0,44 ml 20 mM HEPES tamponunu karıştırın. Adım 3.1'de oluşturulan mikrobeadlarla 0.1667 ml DMEM ekleyin.</li>
	<li>Trombin Çözeltisi — Ayrı bir 15 ml c-tüpte, 0.0328 ml trombin stok çözeltisi, 0.131 ml 20 mM HEPES tamponu ve 0.00246 ml 2 M CaCl2karıştırın.</li>
	<li>Çözelti eşit olarak dağıtılana kadar 5-10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak trombin çözeltisini (adım 3.4) fibrinojen çözeltisi (adım 3.3) ile dikkatlice karıştırın. Kabarcıkları mümkün olduğunca tanıtmaktan kaçının. Üretilen kabarcık miktarını azaltmak için, karıştırırken pipeti tamamen boşaltmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Trombin ilavesi çözeltinin hızlı bir şekilde jel etmesine neden olur (~30 sn). Pipet karışık çözeltiyi mümkün olan en kısa sürede örtünün üzerine. Jelin RT'de polimerize olmasını izin verin.</li>
	<li>Biyoreaktörü kapatın, ısıtma bloklarını takın ve termokuplları sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Jeli 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. Hücre Explant Hazırlığı
<ol><li>İnsan dermal fibroblast hücrelerini içeren T-75 şişesinden ortamı çıkarın.</li>
	<li>Serum proteinlerini çıkarmak için yüzeyi yaklaşık 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile dikkatlice durulayın. 1 ml tripsin-EDTA ekleyin ve 3 dakika boyunca veya hücreler kaldırılana kadar kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreler kaldırıldıktan sonra, süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'da bir santrifüjde aşağı çevirin. Üstnatantı çıkarın ve peletin 20 milyon hücre/ml'lik son konsantrasyona izin verecek bir DMEM hacminde yeniden süzdü.</li>
	<li>Hücreler santrifüjde aşağı dönerken biyoreaktörün ısıtma bloklarından ve termokupllardan bağlantısını kesin. Biyoreaktörü bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve aseptik teknikleri izleyerek kapağı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 0,3 μl'lik kısmını polimerize fibrin jeline pipetleme yaparak, şablondaki deseni izleyerek eksplantlar oluşturun. Her eksplant yaklaşık 6.000 hücre içermelidir. Düşük hacimli mikropipette uçlarının kullanıldığından emin olun (0,1-10 μl).</li>
	<li>Hücrelerin 37 °C'de 1 saat boyunca fibrin matrisine yerleşmesine ve bağlanmasına izin verin.</li>
	<li>Biyoreaktör hala açıkken, doğrudan biyoreaktör odasına %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisidin, %0,1 amfoterisilin B ve 10 mg/ml aprotinin ile desteklenmiş yaklaşık 5 ml DMEM ekleyin. DMEM bikarbonat tamponludur ve nötr bir pH sağlamak için% 5 CO2 gerektirir. Biyoreaktör CO 2 ile birlikte olmadığından, ortamı kullanmadan önce2-3saat boyunca% 5 CO2 ile bir inkübatörde koşullandırılmıştır. Aprotinin, fibrin bozulması oranını azaltmak için yaygın olarak kullanılan bir serine proteaz inhibitörüdür20.</li>
	<li>Biyoreaktörün yeniden halinen. Giriş portunda dikenli bağlantı elemanı aracılığıyla ek 5 ml CO2 şartlandırılmış ortam sağlamak için bir şırınna kullanın. Ortamı yavaşça dağıtın ve biyoreaktör odasının tüm hacminin dolduğundan emin olun. Biyoreaktörde oluşan kabarcıkları dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>pH'ı korumak, besin sağlamak ve atık ürünleri çıkarmak için deney boyunca biyoreaktöre taze,%5 CO 2 şartlandırılmış ortam sağlayın. %5 CO2 şartlandırılmış ortamla dolu 10 ml veya 30 ml şırınna ile şırınna pompası kur. Şırınnayı doğrudan Luer kilidi takılmış steril boru ile biyoreaktör kapağındaki giriş portunu bağlayın. Erkek bağlantı elemanını çıkarın ve boruyu biyoreaktör üzerindeki dikenli bağlantı parçasına takın (bkz. Şekil 1C).</li>
	<li>Perfüzyon oranını 0,01 ml/dk olarak ayarlayın. Değiştirilmiş boru parçalarını her iki çıkış bağlantı noktasına bağlayın ve atıkları toplamak için uçlarını 100 ml'lik bir kabın içine yerleştirin.</li>
	<li>Giriş ve çıkış beslemelerinin yüksekliklerini biyoreaktörde basınç farkı gelişmeyecek şekilde ayarlamak için bir laboratuvar jakı kullanın (referans için Şekil 1D'ye danışın).</li>
	<li>Bir biyoreaktör yoksa, cam üstlü 35 mm cam alt Petri kaplarda numuneler hazırlayın. Kullanılacak belirli hedefler kümesi için optimize edilmiş bir kapak boyutuna sahip bir tane kullanın. Petri kaplarında hazırlanan numuneler 37 °C ve%5 CO2'debir inkübatörde muhafaza edilmelidir. Not: Polistiren ışığı depolarize eder ve DIC görüntülemeyi kesintiye uğratacaktır, bu nedenle DIC görüntüleme yapılacaksa cam üstler kullanılmalıdır. Faz kontrastı uygun bir alternatif görüntüleme yöntemidir. Bulaşıkların inkübatör ve mikroskop arasında aktarılması görüntü kaydını zorlaştırır. Görüntüler düzgün kaydedilmezse, Bölüm 6'da hesaplanan gerinim doğru olmayacaktır.</li>
</ol>5. Zaman Atlamalı Görüntüleme
<ol><li>Numune hazırlandıktan sonra biyoreaktörü yeniden bağlayın, ısıtma bloklarını ve termokuplları yeniden bağlayın ve biyoreaktör sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Biyoreaktörü mikroskop monteli motorlu sahne üzerine ayarlayın. 20X DIC hedefini görünüm bağlantı noktasının altına yerleştirin. Özellikle hassas motorlu bir aşama mevcut değilse, daha düşük bir büyütme hedefi kabul edilebilir. Polarizatör, analizör ve prizmanın yerinde olduğundan emin olun. Alternatif olarak, örnekler faz kontrastı kullanılarak da görüntülenebilir.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımını açın.</li>
	<li>Hedefi üç eksplant arasındaki alana odakla.</li>
	<li>Bu konumun koordinatlarını (x, y ve z) görüntüleme yazılımına kaydedin.</li>
	<li>Eksplantlar arasındaki ve çevresindeki tüm alanı görüntülemek için büyük bir görüntü elde etme seçeneğini belirleyin ve alanın boyutunu belirtin. Bu, belirtilen alanın etrafında birden çok görüntünün alınmasına izin verir ve örneğin daha büyük bir bölgesini temsil eden döşeli bir görüntü oluşturur.</li>
	<li>Maruz kalma süresini ve ışık yoğunluğunu fototoksikitenin neden olduğu hücre ölümünü önlemek için mümkün olan en düşük değerlere ayarlayın, aynı zamanda hücreler, mikrobeadlar ve fibrin lifleri arasında ayrım yapmak için yeterli çözünürlük sağlar.</li>
</ol>6. Gerinim Takibi
Kullanılan gerinim izleme yazılımı (Şekil 2) hakkında ayrıntılı bilgi ve talimatlar için bkz. 21 Algoritma, <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>'den indirilebilen özel bir MATLAB kodudur. DIC görüntülerin genellikle gerinim izleme için yeterli dokuya sahip olduğunu unutmayın. Mikrobeadlar, hesaplanan gerinim alanlarında bir kontrol görevi görmek için dahil edilir. Gerinim takibi yapılacaksa, elde edilen görüntülerin aynı yerde alınması kritik öneme sahiptir, böylece görüntüler kaydedilir. Kayıtsız görüntüler sahte suşlar üretecektir.

<ol>
	<li>Grinnell, F., Petroll WM, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li><li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , (2008).</li><li>Pedersen JA, ., Swartz MA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+in+the+third+dimension.">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li><li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts.">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li><li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels.">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li><li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices.">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li><li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels:+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity.">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li><li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis.">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li><li>Stopak, D., Harris AK, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction:+I.+tissue+culture+observations.">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li><li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels.">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li><li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension.">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li><li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics:+the+interplay+among+cell+traction,+fibrillar+network+deformation,+fibril+alignment,+and+cell+contact+guidance.">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).</li><li>Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+valves+with+commissural+alignment.">Tissue-engineered valves with commissural alignment.</a> Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).</li><li>Robinson PS, ., Robinson PS, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+biaxial+behavior+of+fibrin-based+tissue-engineered+heart+valve+leaflets.">Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li><li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent.">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li><li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+an+optically+accessible,+low-volume,+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs.">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).</li><li>Ye KY, ., Sulli van KE, ., Black LD, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+cardiomyocytes+in+a+fibrin+hydrogel+for+cardiac+tissue+engineering.">Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro.">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).</li><li>Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+regional+mechanical+anisotropy+in+soft+tissue+analogs.">Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs.</a> J. Biomech. Eng. 133, (2011).</li><li>Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue-engineered+valves+from+cell-remodeled+fibrin+with+commissural+alignment+of+cell-produced+collagen.">Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li><li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases.">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li><li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nested+collagen+matrices:+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions.">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Wakatsuki, T., Kolodney MS, ., Zahalak GI, ., Elson EL, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue.">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li><li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+fiber+realignment+in+fibrin+gels.">Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels.</a> , (2013).</li><li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels.">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bu protokol, hücre aracılı ECM tadilatında yer alan mekaniği gözlemlemek ve ölçmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu tür süreçler bir dizi biyolojik fenomenin altında yatan ve mühendislik dokuları için önemli etkileri olan2,22, yara izini1,23azaltarak ve patolojik doku tadilatını anlamak12,24. Zaman atlamalı DIC mikroskopisi kullanımı, hücre çekiş kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan fibrin liflerinin yer değiştirmesini ve hizalamasını çözmesini ve ?...

Hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için önemli bir araç hücre doldurulmuş kollajen jel1,2. Jel, dokunun in vivo karakterine daha yakın ve hücre davranışını anlamak için geleneksel 2D kültürleri tarafından sunulandan daha uygun bir3Dortam sağlar 3 . Fibroblastların bir kollajen jel içinde homojen bir şekilde dağıtıldığı ilk çalışmalar, hücrelerin kollajen liflerini hızla birleştirdiğini ve jeli kompakt hale geldiğini buldu4,5. Serbest yüzen jellerdeki kontrtil fibroblastlar, jel tamamen sıkıştırmaya ulaştıktan kısa bir süre sonra sessiz bir duruma geçiş1,6,7. Sınırlarda kısıtlanan jellerdeki fibroblastlar aktif, sentetik bir durumda kalır8 ve jel geometrisine ve dış kısıtlamalara bağlı bir şekilde fiber hizalama oluştururlar5,9. Hücre aktiviteslerindeki farklılıklar, hücrelerin jeldeki kolajen lifleri üzerindeki integrinler yoluyla çekiş kuvveti uygulamasıyla gelişen iç gerilimin (veya eksikliğinin) bir sonucu olarak görünmektedir.
Bu tekniğin bir varyantı, fibroblast eksplantlarının(yani hücre kümelerinin) bir kollajen jel içinde birbirinden uzak bir mesafe yerleştirilmesini ve hücre matrisi etkileşimlerini ve eksplantlar (bazen bağ benzeri kayışlar olarak adlandırılır) arasındaki lif hizalamasının kademeli gelişimini gözlemlemeyi içerir10-12. Eksplant sisteminin birincil avantajı, hücreleri basit geometrik desenler halinde düzenlemesine izin vermesidir, bu da hücre güdümlü fiber yeniden hizalamanın altında bulunan mekanizmaları görselleştirmeyi ve araştırmayı kolaylaştırır. Öncelikle hücre çekiş kuvvetleri, hücre mekansal dağılımı, jel geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı olan bu hizalama kalıplarının anlaşılması önemlidir, çünkü küresel doku organizasyonunda, mekanik işlevde ve yerel mekanik ortamda merkezi bir rol oynarlar13.
Doku mühendisliği alanında, mekanik olarak işlevsel, mühendislik dokuları üretmek için bir strateji, hücre sıkıştırmasından gelişen lif hizalama deseninin kontrol edilmesidir, böylece mühendislik dokusu yerel dokununkini taklit eden lif hizalamaya sahiptir14,15. Bu hizalamanın, tasarlanmış dokuların yerli dokuların karmaşık mekanik davranışlarını çoğaltması için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Bu stratejinin bir modifikasyonu kollajen jelini bir fibrin jeli ile değiştirmektir16. Fibrin jeli, sıkıştırma sırasında kollajen jel ile benzer bir hizalama deseni geliştirir. Zamanla fibrin bozulur ve ilk fibrin lif hizalama desenini izleyen hücre sentezlenmiş ECM ile değiştirilir. Elde edilen mühendislik yapısı, kollajen jel türetilmiş yapılara kıyasla önemli ölçüde geliştirilmiş mekanik özelliklere sahiptir17.
Fibrin jellerindeki hizalama işlemi ve sonraki yeniden şekillendirme olayları karmaşık ve kötü anlaşılmış bir şekilde ilerler. Bu etkileşimleri ve bunların hücre davranışı ve ECM tadilatı üzerindeki etkilerini daha iyi karakterize etmek için explant yöntemine dayanan bir prosedür geliştirdik. Bu yöntemde fibroblast eksplantları farklı geometrik desenlerde bir fibrin jeli üzerine yerleştirilmiştir. Jeller çevre kontrollü, mikroskop monteli biyoreaktör18'detutulur ve sıkıştırma ve fiber yeniden hizalama işlemi zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi ile izlenir. Öteleme alanları özel algoritmalarla ölçülür. Bu deneylerden elde edilen veriler, doku mühendisliği stratejilerini optimize etmek, yara iyileşmesini iyileştirmek ve patolojik doku tadilatını tedavi etmek de dahil olmak üzere bir dizi süreç için geniş kapsamlı etkilere sahiptir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Invitrogen</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lonza</td>
			<td>DE14-701F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Probes</td>
			<td>F8858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>SS264-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Biotense Bioreactor</td>
			<td style="width:85px;">ADMET</td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti-Eclipe Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Top Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GTOP-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30600-65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing and quantifying fibroblast-mediated fibrin gel compaction

Kollajen ve fibrin jellerine gömülü hücreler jelin liflerine tüze gücü talar ve uygular. Bu kuvvetler jel mikro yapısının yerel ve küresel olarak yeniden düzenlenmesine ve yeniden düzenlenmesine yol açabilir. Bu işlem, kısmen hücrelerin konumu, jelin geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı karmaşık bir şekilde ilerler. Bu değişkenlerin küresel fiber hizalama desenlerini nasıl ürettiğini daha iyi anlamak için, geometrik aralıklı eksplantlar (fibroblast kümeleri) arasındaki sıkıştırma sürecini gözlemlemek için çevre kontrollü bir biyoreaktör ile birlikte zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi kullanıyoruz. Görüntüler daha sonra gerinim haritalarını elde etmek için özel bir görüntü işleme algoritması ile analiz edilir. Bu teknikten elde edilen bilgiler, yara iyileşmesi, hastalık gelişimi ve doku mühendisliği uygulamalarındaki süreçleri anlamak için önemli etkileri olan çeşitli hücre matrisi etkileşimlerinin mekanobiyolojisini araştırmak için kullanılabilir.

Doku tadilatı, kısmen hücreler ve çevresindeki matris arasındaki karşılıklı fiziksel etkileşimler tarafından yönlendirilen karmaşık bir süreçtir. Hücreler çevredeki lifleri yeniden düzenler ve fiber ağda gerginlik oluşturur. Liflerin ve mekanik ortamın hizalanması hücre davranışını kontrol eder, böylece hem hücreler hem de matris küresel olarak yeniden şekillendirilmiş doku üretmek için yeniden düzenler. Bu deneyde, başlangıçta morfolojide yuvarlak olan eksplantların hücreleri jel...

Watch this Scientific Journal Video about Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction at JoVE.com

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

observing-and-quantifying-fibroblast-mediated-fibrin-gel-compaction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.9K Görüntüleme.  University of Iowa. 48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Video: Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Biyomühendislik

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral surgery. Unlike platelet rich plasma (PRP) that is a gel or a suspension, Leukocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) is a solid 3D fibrin membrane generated chair-side from whole blood containing no anti-coagulant. The membrane has a dense three dimensional fibrin matrix with enriched platelets and abundant growth factors. L-PRF is a popular adjunct in surgeries because of its superior handling characteristics as well as its suturability to the wound bed. The goal of the study is to demonstrate generation as well as provide detailed characterization of relevant properties of L-PRF that underlie its clinical success.

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing.

Lökosit-trombosit Zengin Fibrin, Yeni Bir Biyomateryalinin Karakterizasyonu

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Jel destekli rehidrasyon kullanma Dev boyutlu Polymersomes Şekillendirme

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...