この材料は、グラント番号0842736の下で全米科学財団によってサポートされている作業に基づいています。

新規GFSの構成の概要定期的な光学顕微鏡、赤道儀、カメラ、およびコンピュータ[図1]：GFSは、いくつかの不可欠なコンポーネントで構成されています。サンプルを保持する密閉型フローセルのチャンバーは、GFSのデザインに応じて不可欠である。範囲は宇宙の別の方向に回転させることができるので、光学顕微鏡は、赤道儀に装着される。この能力は、重力の静的なベクトルは重力の力が試料にpiconewtonレンジの力の負荷を与えることができるので、サンプルはベクトルに関連して動的に配向させることができるように悪用されることができます。それはサンプルの向きの変化を記録できるようにカメラは、光学顕微鏡の接眼レンズに置き換えられます。この生データをデジタル化し、実際の力と距離の測定にデータを解釈するコンピュータによって操作されます。密封されたフローチャンバーは、試料を失うことなく空間中の全自由度をできるように設計されています。チャンバー内チャンバーの表面に接着され、&quot;アンカー&quot;ビーズに一方の末端近くにつながれているサンプルの分子が存在する。反対側の末端は、チャンバーの表面から自由である&quot;モバイル&quot;ビーズにつながれている。それは、それによってこのような低荷重負荷時のテザー分子を伸ばし重力によって処理することができるアッセイバッファー内の空きこのモバイルビーズである[図2]。それは、両方のビーズは、フローチャンバーの表面の上に座っているペアから分子への付着によって結合良好な使用可能なペアを識別するためにいくつかの経験を取るいませんが、サンプルは、単純に、顕微鏡下でマイクロスフェアのペアのように見えます。システムに対する1つの変更は、GFSを保持し、バネによって中断されているフローティングプラットフォームの追加です。この構成では、一度サンプルでは重力がサンプルに作用することができる位置に回転している、プラットフォームとそのすべてのコンポーネントは、バネ定数に対してドロップすることができます。自由落下の近くに、モバイルビーズに作用する力はゼロに近く、温泉&quot;最大拡張時に、重力が2倍と同じくらいで乗算されます。このように、段階的な力/距離応答は別の力の負荷での単一分子の挙動を測定するためにグラフ化することができます。 1。ミクロスフェアの調製<ol><li> 0.04パーセント2分間3 - アミノプロピルトリエトキシシラン（アセトンでカット）のガラス又はシリカビーズ10mgを約水没。 </li><li>蒸留水の二つの変更ですすぎ、5分間、2,000 xgでペレットに遠心。上清を捨てる。 </li><li>カップリングバッファー（0.01 Mピリジンは再蒸留水で切断してpHを6.0に調整）5mLを追加し、精力的にこの混合物を振る。上記のよう心する。このステップを3回繰り返します。 </li><li>ビーズのウェットケーキに、5％グルタルアルデヒド溶液（カップリングバッファーとグルタルアルデヒドをカット）2 mLを加える。精力的に振る。 </li><li>フードの下で、室温で3時間ビーズ/グルタルアルデヒドの混合物を回転させる。 </li><li>上記のように遠心し上清を吸引除去する。 </li><li>精力的にそれらを揺することによってカップリング緩衝液5mLにビーズを洗浄し、上清を遠心分離し、吸引除去する。このあと3回繰り返します。 </li><li>ビーズに所望の抗体の約15μLを追加し、積極的に振る。ビーズは、16〜24時間のために回転する必要があります。 </li><li>ボンネットの下に、1 Mグリシンクエンチング液（蒸留水でグリシンをカットし、pHを7.0に調整）5 mLを加える。精力的混合物を振とうし、30分間回転させます。 </li><li>遠心し上清を吸引除去する。 </li><li>洗浄バッファー（; 0.1％アジ化ナトリウム、0.1％BSA、0.15 M塩化ナトリウム、及び0.001 M EDTA、0.01Mトリス、pH 7.0）5 mLを追加します。精力的にこれを振って、遠心し上清を吸引除去する。このステップをさらに3回を繰り返します。 </li><li>低塩緩衝液（0.02 Mイミダゾール、5 mMのMgCl 2、pH7.0に調整し、0.1MのKCl）にバッファを変更します。 3回繰り返します。 </li></ol> 2。ミクロスフェアへのサンプルの添付ファイル<ol><li>準備ビーズを少量取り、それらを追加する（バッチ処理の間に直径の大きな食い違いがある場合は、しかし、ビーズの各ケーキから約2μLを、それは小さなビーズの大の8:1比率の周りに使用することが有利である）アッセイバッファー付きマイクロ遠心チューブ。アッセイバッファーを使用して、約5μMにあなたの蛋白質の濃度を減少させる。バッファー、蛋白質、そしてビーズを含む400μLの少なくとも合計ボリュームを準備します。 </li><li> 3時間約1回転でこの混合物を回転させる（蛋白質は、それが集約し、無用になると、あまりにも興奮している場合）。 </li></ol> 3。スライドのチャンバーの準備<ol><li>コー​​ト0.01％ニトロセルロース（酢酸アミルで）と厚い顕微鏡用スライド。約10分間このスライドは、乾かします。 </li><li>チャンバーとなるように鋭いガラスカッターで、カバースライドをカット。これは、ガラスの4つのストリップを必要とします。 </li><li>事実を使用してくださいエッジの両側に真空グリースの塗抹標本でガラスと熊手それのORYエッジ。 </li><li>乾燥ニトロセルロース上にプレスグリースコーティングストリップはスライドの表面上にボックスを作成するスライドをカバー。 </li><li>ピペットボックスの内側にガラスの表面にピペッターをタップしてビーズ/タンパク質混合物の約2μL。 </li><li>チャンバーの大きさに応じて、低塩緩衝液の20から400まで約μLを加える。 </li><li>すでに密封と、バッファ室を完了するために真空グリースでコーティングされているボックスの上にカバースリップを押す。 </li><li>ビーズはニトロセルロースに自分自身を固定するために十分な時間があるので、スライドのレベルの場所に座ってみましょう。 </li></ol> 4。 GFSデータ収集<ol><li> GFSステージ上にマウントスライド</li><li> GFSのカメラは、小さなマイクロスフェアが大きい微小球の赤道付近に添付されている正当な&quot;ビーズ​​のペア、&quot;のための記録と検索が何であるか監視する。 </li><li>潜在的なビーズのペアが検出されると、&quot;モバイル&quot;ビーズはスライドの表面上に載っていないかどうかを判断するために焦点の深さを通過。 </li><li>一度、適切なペアが識別され、メモ角度モバイルビーズは、D MAXから離れていること（D MAX =結合微小球の重心間の最大距離が）。ビデオを取得する位置に範囲を移動します。 </li><li> GFSの旅行の角度は、分子の長さに応じて25〜90度のために呼び出す可能性のあるD 分、D MAX、およびdの分を記録するために十分なはずです。 </li><li>ペアとしてRECORDは、d minからD MAXにして戻ってD minに移動。 </li><li>それは分析のために後で引くことができるようにも背景の動画を撮影することをお勧めします。 </li><li> GFSのドロップを実行した場合、D MAXに戻って範囲を移動し、毎秒少なくとも60フレームのドロップを記録。重要な部分は、最初の発振だが、長い録音時間は、動的な試験にも使用することができます。 </li></ol> 5。 GFSデータ解析<ol><li>デジタル&quot;閾値&quot;のイメージに生の映像を変換し、ビデオの各フレームにおける各ビーズの重心位置を決定するためのImageJのマクロを実行します。これはドロップのビデオにもなります。 </li><li> ExcelにImageJのからX、Yおよび地域のデータをダンプしてポイントをプロットする。 </li><li>適切なビーズペアがビデオに買収された場合、グラフに顕著なこぶは、（d minは）彼らの最も近いにいるビーズを示していると、グラフの頂点にd maxの位置です。 </li><li>このデータを使用して、各ビーズの半径は、ImageJので正確に決定されるべきであるとすべてのこの情報は、ネストされた式に配置されます。 D = [（G罪α）2 +（G COSα+ D MAX - G）2] 0.5 G = [d minは2 + R B 2 - （R A + R B）2] 0.5 = R B罪をβ C = D MAX - R - G 重心間（D =距離、重力のG =力、平行対物レンズの度数で、α=角度、軸から添付ファイルのβ=角度、モバイルビーズのR B =半径、固定されたビーズのR =半径固定されたビーズの赤道。 </li><li>溶剤の浮力が減算された後も、そのボリュームをもたらすモバイルビーズのフィット半径を使用して、そしてビーズの密度を与え、モバイルビーズが分子に与える力はピコニュートンに計算することができます。このメソッドは、ピコニュートンのテザー分子に働く力を測定し、ナノメートルで抗体の添付ファイルとの間の絶対的な分子の長さを計算します。ガラス微小球のF = V（DB）A（F =力、V =体積、D =密度、=加速重力のために、B =避難水の密度）。 </li></ol> 6。代表的な結果： ビーズの準備が適切に行われた場合、まだ時折ビーズ塊があるかもしれないが、最低限のビーズ凝集が存在します。スコープで見たときは、チャンバー内でペアになっているかどうかビーズの合理的な分布があるはずです。 できるだけ多くの振動を最小限に抑えることが重要であり、このどちらかのエアテーブルを行うために、特別なショックEQマウントを保持している三脚の脚の吸収、またはばねが振動絶縁のために使用することができます利用するシステムに。 密封されたフローチャンバーに係る別の有用なヒントは、それは全面的に構築された後、それはレベルのテーブルの上に約5分間静置することです。これは、任意のアタッチされていない大きなビーズはニトロセルロースの層でバッファし、残りを下にフロートすることができます。スライドではなく完了時に直接マウントされていた場合、調査官は、継続的に文字通り視野を飛んでビーズに対処する必要があります、これはビデオの取り込み中に起これば、それは目を破損する可能性が電子実験。これが適切に行われている場合は、ビーズの便が大幅に最小化され、クリーンなビデオの結果さ。 潜在的なビーズのペアがGFS演算子によって識別されると、それはペアの動作を監視するための予備回転を介して置くと便利です。まれに、大きなビーズはしっかりとスライドに貼付されていません。この問題が発生した場合、それは買収の期間を通じて固定された位置に大きなアンカービーズ滞在することが重要ですので、ペアを利用するには使用はありません。ペアが安定していると示していない場合、&quot;アンカービーズロールを、&quot;それは実験に適しています。 重力からの相対角度の変化に対するビーズ分離距離のプロットは、取得したデータを評価するために使用することができます。良い代表的な結果は、高原にはほとんど分離を表しているだろうし、モバイルビーズのために重力の影響の固定されたビーズから自身を解放すると、グラフはより多くの分離が表示されます。これは素敵なピークはD MAXと呼ばれるに達するまで継続され、曲線が再びベースラインに戻って下向きに始まるd minは[図1]。理想的な条件下では、この署名は対称的です。非代表の結果は異なるD MIN - D MAX - D 分のパターンを示していない支離滅裂なパターンを持つグラフを表しているだろう、またはそれが間塵の部分があったかもしれないことを示す一つの分子に対して高すぎる桁違いな分離を示すだろうモバイルビーズは単純にすべてに添付されていないことを多分ビーズ、または。 、ペアを見つけ、それを撮影、それを処理し、そしてそれを分析のプロセスは、不適切なビーズのペアがグレーに淘汰される多くのストップギャップを持っています。そのため、全体のプロセスの最後に到達して、前の結果と一致している分子の長さを持っている場合、にオリジナルのビーズペアが代表的であるとの結果に含めることのできることを確信できます。良い日には、ビーズのペアショットの約半分は、正当なデータポイントになることを通して撮影することができます。例えば、MF20とMF30抗体との間のミオシンのコイルドコイルの長さは、EMのデータおよびAFM、100nmの2,7,8,9に近づくために、データに基づいて知られています。結果はこの長さは数倍である場合、サンプルが集約しています。ここに示された結果は[図2] MF30の測定と密接に同意する（ミオシンのサブフラグメント-2のN末端に結合する）、標準的なGFSローテーションの実験からのものであるし、96 nmの± 5nmの距離を示し、MF20文献値から推定されたミオシン上（ライトメロミオシンに結合する）抗体の分離距離[図3]。 <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。GFSの構成。 GFSの主要部分が標識されている。 <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。GFSの原理の模式図。左側は固定されたビーズの重心からの最小距離でモバイルビーズの重心を示しています。 GFSが回転するように、モバイルビーズはまた、テザー分子の軸と平行に実行されている重力のベクトルに合わせて配置されます。この位置では、モバイルとアンカービーズの重心間の距離が最大になります。右上には、GFSの映画から代表的なスライスを示しています。右下には、GFS受けて回転のイメージです。 <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="図3" /> 図3代表のグラフの左側にあるDの分を示す結果、17.78ミクロンの相対的な分離でD MAX、とビーズの間の相対的な分離の17.75ミクロンのベースラインの周りのD 分に復帰。 <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。MF20とMF30抗体平均96 nmの間の距離を示すGFSローテーションの実験の代表的な結果。これは、S2のおおよその長さを表します。 <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="図5" /> 図5は、。ミオシンII二量体は、抗体および/ ​​またはアクチンの添付ファイルを含むGFSで使用するために可能な添付ファイルを表示するために使用。別の添付ファイルの可能性別のGFSの戦略が異なる領域を測定するために、または力の垂直またはミオシンの二量体の棒のドメインへの並列を適用することが可能になります。

<ol>
	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

デジタル閾値表現にムービーを変換する場合、それはビデオの各フレームで同じ領域を維持するために閾値画像のための非常に重要です。ビーズペアのビーズは、互いに独立して移動するので、閾値領域でのドリフトも、大きな誤差を漂流して紹介するビーズの重心間の相対距離を引き起こす可能性があります。しきい値領域を制御することダウンは5nm〜26 nmの距離の測定値の5倍の誤差を減?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

巨大分子構造の研究は、分子機構と機能の解明に重要になっています。タンパク質の構造的特徴の力依存性をテストできるいくつかの限られた、しかし重要なbioinstrumentsがあります。規模は、研究者がそのような核酸、酵素、および生命維持の作業を実行するモータータンパク質などの分子のナノの世界を覗きできるか正確に上に制限するパラメータとなっています。原子間力顕微鏡（AFM）はよく電子顕微鏡と同等の距離分解能で繊維状のタンパク質のネイティブ構造を決定するために調整されています。しかし、AFMの力の研究で、軍は通常、単一の分子よりもはるかに高くなっています1、2を発生する可能性があります。光学トラップ（OT）がトラップされたビーズとの間の相対距離を判断するに非常に優れていると、彼らは非常に小さな力3を付与することができる。しかし、彼らが検討されて分子の正確な絶対的な長さを得ることはありません。分子シミュレーションは、実験に協力的な情報を提供しますが、同じ大規模な分子サイズ、長いタイムフレームを、処理し、他の証拠2、4の存在下でいくつかの研究者を説得する能力に制限されています。 重力分光計（GFS）は、能力のユニークな組み合わせを提供することにより、研究者の武器庫での重要なニッチを埋める。この楽器は、femtonewtonの範囲からnanonewtonの範囲に98％以上の精度で一般的に力を生成することができます。距離の測定は、現在、光トラップと同様の精度で5ナノメートル、そして相対的なビーズペアの分離距離に絶対的な分子の長さを解決する能力があります。また、GFSは、ストレッチや力が平衡に近い場所uncoilingを決定する、または任意の測定の構造変化に対して並置する段階的な力を提供することができます。それは生理的な力の負荷2でイベントをuncoilingに関与しているか、多くのアミノ酸残基を決定することも可能です。あらゆるアッセイを先行しなければならない大きな力のキャリブレーションが存在する他の方法とは異なり、GFSはそのような力のキャリブレーション5を必要としません。他の方法の強みを補完することで、GFSは重要な蛋白質と他の高分子のナノメカニクスを理解する上でのギャップをブリッジします。

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

これは、目的、操作、そして斬新な重力の分光計からの代表的な結果を示すステップバイステップガイドです。

繊維状タンパク質をストレッチし、測定する新しい重力分光器の使用を実証

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K ビュー.  University of North Texas. これは、目的、操作、そして斬新な重力の分光計からの代表的な結果を示すステップバイステップガイドです。

ビデオ: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

その場圧縮負荷と骨歯根膜歯繊維状合同の相関的非侵襲的イメージングで

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

ブリルアン散乱分析用高速サブGHzの分光

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...