Yazarlar, Prof. Anthony Windebank laboratuar diseksiyon ve kültür DRG kendi uzmanlık paylaşımı için teşekkür etmek, hem de DMD kurulumu ile ilgili yararlı tartışmalar için Prof. Shaochen Chen. Bu araştırma, Tulane Üniversitesi ve hibeler Louisiana Regents Kurulu&#39;ndan tarafından kısmen finanse edildi (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) ve NIH (NS065374).

1. DMD Kurulum <ol><li> DMD kurulu, UV ışık kılavuzu (kolimatör) ve 4x objektif lens titreşim izolasyonu masaya dikey olarak monte edilir. </li><li> UV ışık kılavuzu ışık 45 ° aynalar, 24 ° aynalar düzleminin altında (Şekil 1) düzlemine göre açıyla ayna dizisi vurur şekilde ayarlanmış olmalıdır. </li><li> DMD uzaklık objektif lens odak uzaklığı lens ile ilgili karşılık gelir, böylece objektif lens monte edilir. </li><li> Objektif lens, mikroskop aracılığıyla odaklanmış ışık DMD yansıyan görülebilmesi gibi ters bir mikroskop altında yerleştirilir. Polimerizasyon yüzey objektif lens arasındaki mesafe yaklaşık olarak objektif çalışma mesafesi uygun olmalıdır. Mikroskop aşamasında sonra ince Görüntüye odaklanmak için bu mesafeyi ayarlamak için kullanılabilir. Bu mesafe, seçilen polimerizasyon yüzeye bağlı olarak değişebilir. </li></ol> 2. Doku Eksplant Kültürler Çift Hidrojel oluşturur A. DRG eksplant yapışma <ol><li> Kat membran kendisi özen Yağmur-X ile 6-kuyu kollajen kaplı hücre kültürü ekler (Corning), duvarları. (Alternatif olarak, hidrofobik bir bariyer kalem olabilir.) </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 &#39;de bir kuluçka yapışma orta 1.5 mL gecede Hidrat ekler. Yapışma orta,% 10 fetal sığır serumu,% 1 Penisilin / streptomisin, 0.5mm L-glutamin ve 20 mcg / ml NGF neurobasal orta. </li><li> E-15 sıçan yavrular hasat embriyonik dorsal kök gangliyon (DRG). DRG dörde kadar eklemek için, kollajen kaplı 6-iyi ekler üzerine kaplanmış olmalıdır. </li><li> Membran bağlılık DRG izin vermek için, 2 saat süreyle ekler inkübe edin. </li></ol> B. Dinamik maske fotopolimerizasyon Dijital micromirror cihazı (DMD), seçici ayna pozisyonu dayalı ışığı yansıtan projeksiyon televizyonlarda buna benzer bireysel aynalar, 1024 x 768 dizi. Bizim amaçlarımız için, DMD Belirtilebilen hidrojel geometrileri basit ve hızlı bir şekilde oluşturarak, photocrosslinkable hidrojeller üzerine desen ultraviyole (UV) ışık kullanılır. Şekil 1 DMD ve UV ışık yolu kurulumu anlatıyor. DMD bağımsız bir birim olmasına rağmen, cihaz aynı zamanda birçok mevcut mikroskopları ile kullanım için entegre edilebilir. <ol><li> Tüm aşırı sıvı eklemek çıkarın ve polimerizasyon orta eklemek içinde 500 mcL ekleyin. Polimerizasyon orta,% 10 PEG (MW 1000) ve 0.5% Irgacure 2959 20 mcg / ml NGF ve% 1 Kalem / Strep ile desteklenmiş neurobasal ortamda çözünmüş içerir. </li><li> Yağmur-X işlenmiş cam slayt DMD cihaz altındaki ekleme yerleştirin. </li><li> ALP-3 temel GUI programı kullanmak suretiyle, DMD &quot;photomask&quot; olarak kullanılmak üzere uygun siyah-beyaz görüntü yükleyin. Bizim amaçlarımız için, çatallanan şekli neurite rehberlik sistemlerinin uygulanması için izin seçildi. </li><li> Ters bir görünüm için mikroskop kullanarak, photomask DMD yansıtan bir görünür ışık kaynağı kullanılarak uygun bir konuma sahip doku eksplantlar hizalayın. </li><li> UV ışık kaynağı görünür ışık kaynağı Switch ve crosslinking yeterli kadar PEG çözüm aydınlatmak. (Koşulları için verilen ve 5.0 Watt / cm 2 olayın DMD, crosslinking az 55 saniye içinde tamamlanabilir.) Eklemek dört DRG için tekrarlayın. </li><li> Her ekleme, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> 1.5mL besi hücre kültürü ekler altına ekleyin ve 30 dakika için bir kuluçka gelmesini sağlayınız. Büyüme orta,% 2 B-27,% 1 Kalem / Strep, 0.5mm L-glutamin ve 20 mikrogram / ml NGF içeren neurobasal orta. </li></ol> C. Sekonder hidrojel Puramatrix <ol><li> Nöronal uygulamaları için,% 1 Puramatrix steril H 2 O% 0.15 üreticinin talimatlarına göre seyreltilir ve 1 mcg / mL çözünen laminin ile desteklenebilir. </li><li> Tüm fazla medya, steril bir pamuk uçlu aplikatör, Kimwipe ya da mikropipet kullanarak, DRG eksplantlar içeren PEG boşlukları, kaldırılması gerekir. </li><li> Puramatrix mikropipet ile PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak amacıyla eklenir. Boşluk hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. </li><li> Puramatrix fizyolojik tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj işlemi başlar, yani şişmiş PEG, ancak 1.5 mL besi toplam jelleşme sağlamak için ekleme altına eklenir ve bir saat süreyle inkübatör yerleştirilir. </li><li> Başlangıçta, Puramatrix hafif asidik pH denge izin bir saat sonra ortamı değiştirmek. </li><li> Medya değişiklikler yaklaşık olarak her 48 saat gereklidir. Tüm medya olduğunu, dikkatli olunmekanik olarak zayıf Puramatrix bütünlüğünü korumak için, ekleme altına eklendi. </li></ol> Agaroz <ol><li> Nöronal uygulamalar için, agaroz% 1&#39;lik bir büyüme ortamında çözüm seyreltilmiş ve agaroz tamamen eriyene kadar (~ 1 saat) 60 ° C su banyosuna yerleştirilir. Çözüm, sonra 1 mcg / mL çözünen laminin ile tamamlanmaktadır. </li><li> Tüm aşırı medya PEG boşlukları uzaklaştırılmalıdır. </li><li> Agaroz PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak için eklenir. Boşluğun hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. </li><li> Büyüme ortamının 1.5 mL 6 plaka önceden soğutulmuş (8 ° C), ve agaroz içeren ekler agaroz izin soğutulmuş ortama aktarılır ve 8 ° C&#39;de en az üç dakika boyunca buzdolabında muhafaza edilir jel. </li><li> Son olarak, ekler, 1.5 ml (37 ° C), önceden ısıtılmış büyüme orta transfer ve 37 kuvöz muhafaza ° C, her 48 saatte gerekli ortam değişiklikleri ile. </li></ol> 3. Çift Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Çift hidrojel encapsulation kendi montaj jel kullanırken uygundur. Photocrosslinkable jel, bu durumda PEG, örneğin Puramatrix veya agaroz, öz-montaj jel geometrik tanıtımı için yapısal bir destek olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemlerden bazıları, özellikle photomask jel ve seçim türü, özellikle istediğiniz uygulamayı bağlı olacaktır. <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. Bizim uygulama, hücre hayatta kalmak için, biz sadece hücre görüntüleme yardım Puramatrix silindirik bir sunum seçti. Araştırmacılar, hücre sinyal eğitim kemotaktik moleküllerin difüzyon izin bölmeli bir geometri ilginizi çekebilir. Ayrıca, bir arter kaba bir yaklaşım, kan damarı araştırma olası uygulama temsil etmek için gösterilmiştir. </li><li> Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve duvarları davranın. </li><li> Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. </li><li> Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> PEG boşlukları tüm Fazla medyayı çıkartın. </li><li> Pelet içine istenilen yoğunlukta hücre aşağı spin. Bakım Puramatrix bir tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj başlar başlamaz, önce karıştırma hücre pelletini tüm orta kaldırmak için alınması gerekir. Askıya Alma steril H 2 O seyreltilmiş% 0,15 Puramatrix içinde hücrelerin% 10 sakaroz ile desteklenmelidir. </li><li> PEG içinde boşluklar içinde Puramatrix / hücre / sakaroz karışımı enjekte edilir. </li><li> 1.5 mL eklemek altında büyümenin orta ekleyin ve bir saat için kuvöz içinde jel izin. </li><li> Bir saat sonra ortam değiştirin, ve bundan sonra her 48 saatte ~. </li></ol> 4. Tek Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Tek bir hidrojel kapsülleme hücreleri photocrosslinkable hidrojel içinde incelenebilir bir durum için uygun olacaktır. <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. Hücre sağkalım çalışmalar için, yine bir silindir temsil edecek bir temel dairesel maske seçti. Metodu 4 gösterilen benzer Maskeler tekrar uygun bir araştırma alanı için uygulanabilir. </li><li> Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve davranın. </li><li> Herhangi istenilen konsantrasyonda hücreler homojen dağılımını sağlamak için iyice karıştırılması,% 10 PEG solüsyonu direkt olarak ilave edilebilir. </li><li> Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. </li><li> Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> Değişen her ~ 2 gün, altına ve üstüne ekleme bir büyüme ortamı ile doldurun. </li></ol> 5. İnce Film Hidrojel Polimerizasyon <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. </li><li> Yağmur X kaplı slayt kollajen kaplı polyester hücre kültürü Yağmur-X ile insert, yer ve davranın. </li><li> Insert (6 plaka ekler ~ 250-300 mcL) sadece alt kapağı için yeterli polimerizasyon orta ekleyin. Medya, oda sıcaklığında 30-45 dakika ekleme membran girmesine izin verin. </li><li> Mikropipet veya Kimwipe insert fazla polimerizasyon orta çıkarın. Eklemek tamamen alt kapağı için yeterli miktarda UV-şeffaf yağ ekleyin. Eklemek polimerizasyon orta doyurarak ekleme membran üzerinde ayrı bir tabaka oluşturur petrol için, yeterince uzun süre oda sıcaklığında 15-30 dakika oturmak için izin verin. </li><li> DMD altında ekleme ve slayt yerleştirin. UV ışınlarına maruz kalma PEG crosslinking neden. Çünkü PEG tabakasının inceliği, crosslinking DMD 5.0 Watt / cm 2 olayın en az 15 saniye içinde tamamlanmalıdır. </li><li&gt; Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep eklemek üç kez yıkayın. (Yağlı bir kalıntı sebat bir endişe ise, Tween 20 (% 1) gibi hafif bir deterjan yıkama tamponu eklenebilir.) </li><li> 6-iyi doku kültürü plakası ekleme saklayın. Istenilen konsantrasyonda askıda hücrelere büyüme orta ekle ve istenilen hücre yoğunluğu, hücre kültürü eklemek içinde hücre süspansiyonu elde etmek için yeterli bir hacmi pipetle. Sonra, tamamen hücre canlılığını korumak için (~ 1.5 mL) eklemek için aşağıdaki yeterli büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 48 saat geçtikten sonra herhangi bir unadhered hücreleri çıkarmak için, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep eklemek üç kez yıkayın. Yaklaşık olarak her 48 saatte bir ortam değiştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Çift hidrojel örnekleri içeren DRG eksplantlar Şekil 2&#39;de gösterilmiştir oluşturur. Hücresel göç ve neurite uzantısı hücre müsamahakar çift hidrojel bölgeye inşa sınırlı olduğunu dikkat edin. Şekil 3 çift hidrojel yapıları içinde benzer bir kapsüllü ayrışmış hücreleri gösteriyor. DMD photomask dinamik yapısı nedeniyle, kapsülleme kullanılabilir geometri, optik boyutları ve çözünürlüğü sınırlıdır. Hücre kapsülleme tek bir photopolymerizable hidrojel, PEG içinde de mümkün olduğunu, ölü / canlı canlılığı testi Şekil 4&#39;te kanıtladığı gibi yapıldı. PEG içinde kapsüller PEG sinir hücreleri için ideal bir ortamı temsil etmiyor, sadece bir örnek olarak geliyordu. Bu nedenle, PEG yapıları gerçekleştirilen hücre canlılığı anlaşılır düşük. Son olarak, ince PEG filmler, hücre kültürü ekler, hücre yapışması için desenli sınırlayıcı bir tabaka olarak kullanan örnekler Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. Ayrıca, olası bir &quot;kötü&quot; sonuçlarının örnekleri Şekil 6&#39;da sunulmaktadır. Sonuçlar, olası kullanımlarının laboratuvarda geliştirilen yöntemlerden yalnızca küçük bir bölümünü temsil eder. Onlar bizim yaklaşımımız kolaylığı, çok yönlülük ve canlılığı göstermek amacıyla, araştırmacılar kendi olası adaptasyonlar geliştirmek için &quot;prensip kanıtı&quot; olarak tedavi edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 fotolitografi için kullanılan ışık yolu şematik gösterimi. Ankastre: 45 ° ve 24 ° ayna dizi uçağın altında bir açıyla DMD UV ışık yanar. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 çift hidrojel yapıları içeren DRG Etiketli büyümesi ve yayılması. AD), Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir görüntüler. DRG eksplantlar Puramatrix bulunan ve çatallanma (ler) doğru büyüyen neurites desen dairesel bölgelerinde bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 büyüme ortamında 48 saat sonra canlı bir hücre belirteci ile Calcein AM etiketli hücreleri içeren Çift hidrojel oluşturur. AD) Çeşitli PEG şekiller, ayrışmış DRG nöron (~ 5x10 3 hücre / ml) içeren Puramatrix ile dolu. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Tek hidrojel içeren büyüme ortamında 24 saat sonra (5x10 3 hücre / ml) ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile etiketlenmiş Calcein AM (yeşil) ve ölü hücreleri ile etiketlenmiş canlı hücreler inşa. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Hücre kısıtlayıcı PEG ayrışmış hücrelerin seçici geçirgen destekleyen kollajen kaplı membran uymak için bir &quot;test deseni&quot; kullanılarak ince bir film olarak polimerize. Ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile ölü hücrelerden etiketli ise A, B) Canlı hücreler, Calcein AM (yeşil) ile 48 saat sonra etiketlenir. Minimum hücre adezyon ince PEG filmi içeren alan oluşur. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 istenmeyen sonuçlar Temsilcisi görüntüleri. A) PEG Kısmi polimerizasyon, kullanışsız bir PEG yapı. Yanlış polimerizasyon menisküs, ön-polimer orta, yetersiz miktarda polimerizasyon orta, yetersiz UV ışınlarına maruz kalma ya da optik yanlış odak varlığı nedeniyle oluşabilir. B) Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir Resim. Neurites desenli PEG kanalların dışında da büyümeyi başardık. Bu durum sık sık oluşur Puramatrix enjeksiyon sırasında PEG kısmının üstüne taşıyor.

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li><li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+three+dimensions:+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine.">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li><li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses.">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li><li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+neural+constructs:+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation.">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li><li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties.">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures.">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration.">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li><li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel.">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li><li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds.">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method.">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li><li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels.">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li><li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tectonics:+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems.">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li><li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex,+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds.">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li><li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays.">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li></ol>

Burada açıklanan yöntem basit ve tekrarlanabilir bir hücre kültürü sistemleri isteyen herhangi bir araştırmacı tarafından kullanılan olabilir. Teorik olarak, mevcut photopolymerizable hidrojeller çok çeşitli nedeniyle, çevre tüm doku eksplantlarında da dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipi, kullanmak için izin için uygun olabilir. Ayrıca, çift hidrojel sistemi, kendi amorf şekiller oluşturma eğilimindedir kendini polimerize hidrojeller, sunumu gelişmiş mekansal kontrolü için olanak sağlar. Ortaya çıkan &quot;2.5D&quot; micropatterned hidrojel yapıları uygun mikroskopik değerlendirme sağlayan bir 2D yapılandırma sunulan sinir büyüme için 3 boyutlu bir matris sağlar. Substrat jeller polimerize olan, aynı zamanda, deneysel tasarım daha fazla kontrol için izin, çeşitli olabilir. Yöntemleri cam slaytlar (veriler gösterilmemiştir) polimerizasyonu ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş canlılığı (Şekil 4) Görüldüğü gibi, hücre kültürü geçirgen destekler ile kullanım için optimize edilmiş. Ancak, diğer polimerizasyon yüzeyler farklı uygulamalar için daha uygun olabilir: cam üzerine imalat örneğin Mikroakiskan deneyleri veya hücre agrega oluşumları, kullanılan slaytlar. Bu kültür sistemleri ile tecrübemiz zorluk potansiyel alanların belirlenmesine yol açmıştır. İlk olarak, dikkatli teknikleri, yapıları kısırlık korumak için gereklidir. DMD kurulum hantal doğası nedeniyle, steril koşullar altında polimerizasyon adımları çalıştırmak için zordur. Bu konuda mücadele etmek için, yöntemleri açıklanan durulama adım yardımcı olur ve tüm medya antibiyotik kullanılmalıdır. Ayrıca, polimerize inşasının son şekli kalınlığı ve ön-polimer karışımı sıvı davranışı son derece bağımlı ve jel oluşturur (Şekil 6) çok ince ya da eksik polimerize bir menisküs varlığı neden olabilir. Iki adım, hücre kültürü ekler içinde bir menisküs oluşumunu en aza indirmek için alınabilir. Kalın hidrojeller (&gt; 200 mm), Yağmur-X eklemek iç duvar etrafında basit bir kaplama yeterli. Ancak, ince yapıları (&lt;200 mikron) kısaca, yukarıda açıklanan, bir yağ tabakası hem menisküs en aza indirmek ve serbest radikal polimerizasyonu oksijen su verme reddetmek için gereklidir. Çözünürlük özelliği boyutu giderek daha kalın jeller ile gerçekleştirilen bir azalma ile, kalınlığına bağlı olarak tespit edildi. Kararda ayrıca özellik hidrojel olumlu ya da olumsuz bir rahatlama temsil edip etmediğini bağlı olarak değişmiştir. Ancak, minimum özellik boyutları ile ~ 100 mm optik odaklama gibi sadece mikroskop hedefleri kullanarak ölçekli yapıları için yeterli bir çözünürlük elde etti. Burada açıklanan çift hidrojel yapıları neurite büyüme ve rehberlik temel in-vitro modellerin oluşumu için mükemmel bir temeli temsil ettiği deneyler göstermiştir. Istihdam micropatterning tekniği, mevcut yöntemleri 18,19 bir adaptasyon, ama bizim set-up, tasarlamak, uygulamak için basit bir vurguladı ve, çift hücre kültürü ekler hidrojel yapıları üretimi için optimize edilmiş hücre kültürü ekler de hücre canlılığı geliştirmek için hayati önem önceden yapışık doku eksplantlar etrafında crosslinking. Sonuçların gösterildiği laboratuar kapsamı ile sınırlı olmakla birlikte, bu yayında açıklanan yöntemleri 3D hücre kültürü imalatı için nispeten ucuz, hızlı ve kullanımı kolay bir yöntem arıyor araştırmacılar için yararlı olacağına inanıyoruz modelleri.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Giderek, desenli hücre kültürü ortamları hücresel özelliklerini incelemek için, ilgili bir teknik haline, ve birçok araştırmacı, 3 boyutlu ortamlar için 1-3 in vivo nitelikleri daha iyi taklit in vitro deneylerde temsil etmek için ihtiyaç inanıyoruz. Kanser araştırma 4, sinir mühendislik 5, kalp fizyolojisi 6, ve hücre-matriks etkileşimini 7,8 gibi alanlarda yapılan çalışmalar, hücre davranış, geleneksel monolayer kültür ve 3D yapıları arasında önemli farklılıklar göstermiştir. Hidrojeller nedeniyle çeşitli, çok yönlülük ve 9-12 işlevsellik ile terzi moleküler kompozisyon yeteneği 3D ortamlar olarak kullanılır. Elektrospinning 13, elastomer pulları 14 da dahil olmak üzere hücre destekleyici matrisler olarak yapıları oluşturulması için çok sayıda teknikleri vardır, mürekkep püskürtmeli baskı 15, katkı photopatterning 16, statik photomask projeksiyon-litografi 17, dinamik ve maske microstereolithography 18. Ne yazık ki, bu yöntemlerin birden fazla üretim adımları ve / veya geleneksel hücre ve doku kültürü yöntemleri kolayca adapte ekipman içerir. Bu protokol istihdam tekniği kullanarak UV başlatılan serbest radikal polimerizasyonu yoluyla uyarılan crosslinking geometrik özel poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller, dinamik photomasks oluşturmak için bir dijital micromirror cihazı (DMD), son iki yöntemden uyarlar. &quot;2.5D&quot; yapıları, sinir büyüme için kısıtlı 3D ortamı sağlar. Biz PEG Puramatrix veya agaroz yapılan bir başka şekilsiz ama hücre izin kendinden montaj jel hücre kısıtlayıcı bir bölgedeki tedarik yapısı olarak hizmet veren bir çift-hidrojel yaklaşımı, istihdam. Bu süreç, konvansiyonel hücre kültürü yöntemleri ve substratları ile kullanmak için son derece tekrarlanabilir ve kolay adapte olan bir hızlı, basit bir adım imalat. Tüm doku embriyonik dorsal kök gangliyon (DRG) eksplantlar, neurite akıbet gibi deneysel testleri için çift hidrojel yapıları içine dahil edilebilir. Ayrıca, ayrışmış hücreleri photocrosslinkable veya kendi kendine polimerize hidrojel kapsüllü olabilir, ya da seçici geçirgen destek zarı, hücre kısıtlayıcı photopatterning kullanarak yapıştırılır. DMD kullanarak, hidrojel, kalın ~ 1mm kadar yapıları, ancak ince bir film tabakası (&lt;200 mikron) PEG yapıları serbest radikal polimerizasyon reaksiyonu oksijen su verme ile sınırlı kalmıştır yarattı. Biz daha sonra ince PEG yapısı polimerizasyon izin polimerizasyon sıvı üzerindeki yağ tabakası kullanan bir teknik geliştirdi. Bu protokol, biz microfabricated sinir hücre ve doku kültürleri üretimi için 3D hidrojel sistemleri süratli yaratılmasını anlatmak. Burada gösterdi çift hidrojel yapıları nörobilim hücre sağkalım, göç, ve / veya neurite büyüme ve rehberlik içeren çalışmalar için faydalı in vitro modeller çok yönlü temsil eder . Ayrıca, protokol hidrojeller ve hücrelerin birçok türleri için çalışmak gibi, potansiyel uygulamalar çeşitli ve geniş, her ikisi de.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography at JoVE.com

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K Görüntüleme.  Tulane University. Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Video: Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Ölçüm Minyatür Çift elemanlı deformasyon ölçüm aletlerinin imalat ve implantasyon<em&gt; In Vivo</em&gt; Kemirgenler Gastrointestinal Kasılmalar.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...