Mikroçevresel faktörlerin hücre davranışı üzerindeki etkisi genellikle tek ipuçlarını izole eden aşırı basitleştirilmiş in vitro platformlar kullanılarak incelenir. Yaklaşımımız, bu ipuçlarının çoğunu birleştiren hücre kültürü substratları oluşturur. Bu yaklaşım çok yönlüdür ve çok çeşitli hücre kültürü materyalleri, temas kılavuzluk kalıpları, hücresel okumalar ve proteinler kullanılarak sistematik bir çalışma yapılmasını sağlar.
Prosedür, laboratuvarımızdan iki PSE adayı tarafından gösterilecektir. CAS VAN DER PUTTEN ve MIRKO D'URSO First, ilgilenilen tüm özellikleri içeren bir femtosaniye lazer doğrudan sağ tekniği kullanarak negatif bir cam kalıbı oluşturur. Daha sonra, negatif cam kalıbı dikkatlice bir Petri kabının dibine yerleştirin ve Polidimetilsiloksan prepolimerini tamamen örtmek için negatif cam kalıbın üzerine dökün.
Bu Petri kabını vakum kurutucuya yerleştirin ve vakum pompasını çalıştırın. Bir vakum elde edildikten sonra, kalıp yüzeyi ile Polidimetilsiloksan prepolimer arasındaki arayüzde bulunan tüm kabarcıkları çıkarmak için 5 dakika bekleyin. PDMS prepolimerini fırında gece boyunca 65 santigrat derecede kürleyin.
Kürlendikten sonra, PDMS'nin kenarlarını kaldırmak için bir spatula kullanın. Yeni kürlenmiş pozitif PDMS çipini negatif cam kalıbından çıkarın ve pozitif PDMS çipi negatif cam kalıbına yapışma eğilimindeyse, kaldırırken baskının kenarlarına etanol veya su ekleyin. Daha sonra, pozitif Polidimetilsiloksan çipini, bir damlacık silanizasyon maddesi ile küçük bir şişenin yanındaki bir kurutucuya yerleştirin ve çipi gece boyunca vakum altında bırakın.
5 milimetre kalınlığında çoklu hücre kültürü çipleri üretmek için PDMS prepolimerini negatif PDMS kalıbına dökün. Daha sonra, kurutucuyu kullanarak kabarcıkları çıkarın ve 65 santigrat derecede üç saat boyunca kürleyin. Çipi son boyuta kesmek ve cipsleri oda sıcaklığında saklamak için bir tıraş bıçağı kullanın Cımbız kullanarak substrat pasivasyonu için, çipi plazma Asher'ın sepetine yerleştirin.
Daha sonra, çipin yüzeyindeki hidroksil gruplarını aktive etmek için oksijen plazmasını kullanın ve azot kullanarak külleme odasını boşaltın. Çipi sepetten çıkarın ve küçük bir Polidimetilsiloksan kabına yerleştirin. Şimdi, çipin üstüne 500 mikrolitre Poli-L-lizin eklemek, yüzeyi çözeltiye tamamen batırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırmak için bir pastörlü pipet kullanın.
Ardından, hücre kültürü çipinden 450 mikrolitre Poli-L-lizini bir pipetle çıkarın. Daha sonra, çip yüzey trikülünü 500 mikrolitre 0.1 molar HEPES tamponu ile durulayın. Numunenin kurumasını önlemek için Polidimetilsiloksan çipi üzerinde az miktarda sıvı bırakarak son desen kalitesini koruyun.
Kullanımdan hemen önce, hücre kültürü çipi başına 0.1 molar yığın tamponunda mililitre metoksi polietilen glikozik siyanamidal valerat çözeltisi başına 500 mikrolitre 50 miligram hazırlayın ve numuneyi 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir mikro pipet kullanarak, metoksi polietilen glikozik siyanamidal valerat çözeltisinin 450 mikrolitresini çıkarın. Talaş yüzeyini PBS ile pipetle girip çıkarak beş kez yıkayın.
Tüm ilişkisiz mPEG-SVA'yı kaldırmak için. Cam slaytı floresan vurgulayıcı ile mikroskopun optik yoluna yerleştirin. Mikroskopta floresan moduna geçin ve primo görüntüyü dikkatlice odaklayarak hem logonun hem de metnin odaklandığından emin olun.
Kalibrasyon prosedürünü tamamlamak üzere kalibrasyon verilerini ve desenini görmek için yandaki düğmeye tıklayın. Kalibre ederken sahne alanının Z konumunu not edin ve bu konumu protokolün ilerleyen kısımlarında referans olarak kullanın. Kalibrasyon slaytını sahneden çıkardıktan sonra, sahneye fotoğraf başlatıcının bir damlacığını içeren bir cam slayt yerleştirin ve PDMS hücre kültürü substratını fotoğraf başlatıcı damlacığın içine baş aşağı yerleştirin.
Hücre kültürü substratının yüzeyindeki 3B özelliklerin cam slayta baktığından ve doğru desenlemeyi sağlamak için fotoğraf başlatıcıya tamamen batırıldığından emin olun. Sırasıyla dışbükey veya içbükey yapıların üstüne veya altına odaklanın ve çipin alanında makalede açıklandığı gibi doğru yere odaklanın. Desenleme ayarlarını özelliğe göre ayarlayın ve mililitre başına 1000 milijoule doz seçin.
Desenlemeyi başlatmak için ekranın sağ altındaki oynat düğmesine tıklayın. İşiniz bittiğinde, yeşil renkte görüntülenen deseni gözlemleyin. Bir mikro pipet kullanarak, mililitre başına 10 mikrogramlık bir konsantrasyon elde etmek için 20 mikrogram rodamin etiketli fibronektin şişesine iki mililitre PBS ekleyin.
Protein kümelenmelerini önlemek ve ışıktan korumak için hafifçe pipet kullanın. Bir mikro pipet kullanarak, hücre kültürü çipine 200 ila 500 mikrolitre protein çözeltisi ekleyin. Kuluçka süresini ve sıcaklığını seçtiğiniz proteine bağlı olarak ayarlayın ve numuneyi kapladığınızdan emin olun.
Protein çözeltisini çıkarın ve çipi 500 mikrolitre steril PBS ile beş kez yıkayın. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için PBS'yi hücre kültürü çipinin tüm ilgili özelliklerinin üzerinde birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlediğinizden emin olun. Hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, PBS'yi çıkarın ve çipe 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Ardından, 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Parlak alan mikroskobu altında desen hücre kültürü çipi üzerindeki hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Çizgi desenleri durumunda uzatılmış hücre morfolojilerini arayın.
Ve eğer hücreler desenli alanın dışına yapışmaya başlamışsa, ortamı doğrudan substrat üzerindeki hücrelerin üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyerek bunları çıkarın. Boyamadan sonra, lekeli numuneyi bir cam slayt üzerinde bir PBS damlacığı içinde baş aşağı yerleştirin. Ardından, gerekli ayrıntı seviyesine bağlı olarak, uygun görüntü alımını sağlamak için uygun bir hedefe ve Z aralığına sahip Z yığınları yapın.
3B oluşturma yazılımıyla Z yığınının 3B render'ını oluşturun. İçbükey bir çukur, proteinlerin ışık kaynaklı moleküler absorpsiyonu kullanılarak desenlendi ve maksimum yoğunluk projeksiyonu ve ortogonal görünüm görselleştirildi. Yoğunluk profili, desenli ve desensiz alanlar arasında yüksek desen çözünürlüklü keskin geçişler ve tutarlı protein yoğunluğu gösterdi.
Tek odak düzleminin yanı sıra iki ve üç odak düzlemi yöntemini kullanan modelleme, özelliklerin üstündeki desenlerin mükemmel hizalandığını gösterdi. İçbükey yarı silindirler, dışbükey yarı silindirler, eyer yüzeyi ve PID, çeşitli genişliklerde çizgiler veya eşmerkezli daireler kullanılarak desenlenmiştir. İnsan keratositlerinin iskeletinin içindeki etki, foliden kullanılarak boyanır ve görselleştirilir.
Dermal fibroblastlar desenli içbükey yarı silindir üzerinde kültürlendi ve görselleştirildi. Hücreler çok işaretli hücre kültürü substratını algıladı ve yapıştı ve F-aktin, Vinkülin ve Çekirdekler tarafından görselleştirildiği gibi zamanla canlı kaldı. Ayrıca, hücreler esas olarak fibronektin hatları üzerinde fokal yapışıklıklar oluşturdu.
Rodamin fibronektin varlığında desenli bir içbükey silindir üzerinde kültürlenen insan dermal fibroblastları, çok işaretli substrata yapışmış ve temas kılavuz modeline göre bir hizalama yanıtı göstermiştir. Hizalama yanıtı ve hücre canlılığı tüm kültür süresi boyunca korunur. Bu protokolü uygularken en önemli şey, hücre kültürü çipinin yüzeyinin kurumasını önlemektir.
Farklı substrat malzemelerinin, protein kaplamalarının ve hücre tiplerinin kullanımı ek optimizasyon gerektirebilir. 3D'de birden fazla çevresel ipucu sağlamak, karmaşık mühendis dokularında hücresel organizasyonu yönlendirmek için yeni olanaklar açabilir.
