Bu protokol, istenen şekildeki yüksek doğruluklu protein mikro kalıplarının, özellikle hücre kümelerinin incelenmesi için izole edilmiş desen adalarının tutarlı bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu teknik, herhangi bir şekil ve boyuttaki izole ada mikro desenlerini yalnızca bir adımda yapmak için kullanılabilirken, daha önce bu tür desenleri yapmak iki ayrı adım gerektiriyordu. PDMS'yi, üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi doğru kürleme maddesi ile baz oranında karıştırarak başlayın.
Oda sıcaklığında ve basınçta 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından karışımı 15 dakika boyunca vakum altında gazdan arındırın. PDMS'yi ana kalıba dökün ve gece boyunca kürlenmek için 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre aktarın. Ana kalıbı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Ana kalıp soğurken, 25 milimetrelik sonikat kapaklar 10 dakika boyunca etanol içinde kayar. Hazırlanmakta olan pul sayısı kadar kapak fişi kullanın. Kapak kapaklarını DI suyuyla iyice durulayın ve filtrelenmiş bir hava tabancası kullanarak kurulayın.
Plazma temizleyiciyi yüksek vakum altında kullanarak kapakları bir dakika boyunca plazma ile tedavi edin. Kapak kapaklarının odanın içinde hareket etmesini önlemek için işlemden sonra vakumu yavaşça serbest bırakın. Her bir örtüyü, doğrudan güneş ışığından veya tepegöz aydınlatmasından yoksun bir odada 100 mikrolitre floresan etiketli protein çözeltisi ile kaplayın.
Işıktan ekstra koruma için numuneleri örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Her bir kapak kaymasını DI suyu ile iyice durulayın. Her bir kapak kapağının kenarlarını bir kağıt havluya veya benzer bir emici malzemeye hafifçe vurarak fazla suyu yüzeyden çıkarın.
Kapak kapaklarının en az 30 dakika boyunca karanlıkta açıkta bırakarak tamamen kurumasını bekleyin. Protein kaplı kapaklar kururken, PDMS damgasını bir neşter veya keskin bir bıçakla keserek ana kalıptan çıkarın. PDMS damgalarını yüksek vakum altında iki dakika boyunca plazma ile tedavi edin.
Pulları duman başlığının altında kapaklı bir kaba yerleştirin, ardından her pulu% 100 etanol içinde seyreltilmiş ince% 103-APTMS tabakası ile kaplayın. Kabı pullarla örtün ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Her iki taraftaki her damgayı DI suyuyla iyice durulayın.
Pulları temiz bir kaba koyun ve DI suyunda hazırlanan% 2.5 glutaraldehit ile kaplayın. Pulları örtün ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pulları DI su ile iyice durulayın.
Daha önce tarif edildiği gibi yüzeyden fazla suyu çıkarın ve pulların 30 dakika boyunca ortaya çıkarılmadan kurumasını bekleyin. 30 dakika sonra protein kaplı kapaklar veya pullar tamamen kuru değilse, tamamen kuruması için filtrelenmiş bir hava tabancası kullanın. Pulların desen tarafını, tam temas etmeleri için yeterli basınçla kapak fişlerine itin.
15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ardından PDMS damgalarını kapak fişlerinden dikkatlice soyun. Uygun filtreye sahip bir floresan mikroskop kullanarak, desenli kapakların doğruluğunu kontrol edin.
Desenli kapak fişlerini hemen kullanın veya daha fazla kullanana kadar doğrudan ışıktan uzak tutun. PAA hidrojel öncüsünü hazırlamadan önce, açılmadan önce oda sıcaklığına ulaşmak için akrilik asit NHS esterini buzdolabından çıkarın. % 70 etanol ile sterilize ederek değiştirilebilir bir kapaklı tabak seti hazırlayın, ardından kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininde UV ışığı altında inkübe edin.
Duman başlığının altında, 15 mililitrelik konik bir tüpe DI suyunda hazırlanan 1.25 mililitre% 40 akrilamid ekleyin. Aynı tüpe DI suyunda hazırlanan 175 mikrolitre bis-akrilamid çözeltisi ekleyin. Daha sonra 500 mikrolitre 10X PBS, ardından 2.915 mililitre DI su ekleyin.
Bu öncülün 969 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipet alın ve geri kalanını iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Taze bir mikrosantrifüj tüpünde 50 ila 100 miligram APS ölçün ve DI suyunda mililitre başına 100 miligrama kadar seyreltin. NHS esterini kaputta açın ve bir mikrosantrifüj tüpünde üç miligrama kadar NHS'yi dikkatlice ölçün.
NHS esterini 1X PBS'de mililitre başına bir miligrama seyreltin. Duman başlığının altında, PAA öncülünün 969 mikrolitrelik aliquot'unu içeren mikrosantrifüj tüpüne iki mikrolitre TEMED ekleyin. Hidrojel çözeltisinin pH'ını azaltmak ve NHS esterinin hidrolizini önlemek için 15 mikrolitre bir molar HCL ekleyin.
Tüpe 10 mikrolitre NHS ester çözeltisi ekleyin. Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki adımları uygulayın. 30 milimetrelik kapak kaymasını, 3-APTMS ve glutaraldehit ile işlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde ayarlanmış kapak kapağının orta kısmına dikkatlice yerleştirin ve plastik halkayı üstüne vidalayın.
Bir sonraki adıma hazırlanmak için desenli kapak kapağını minimum ışığa maruz kalacak şekilde ayarlayın. PAA öncü aliquot tüpüne beş mikrolitre APS çözeltisi pipetin, ardından ters çevirin ve karıştırın. Hemen pipetin 35 mikrolitresini bu çözeltinin 30 milimetrelik kapağına yerleştirin.
Desenli kapak kapağını, protein tarafı aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine yerleştirin. Hidrojelde hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Hidrojeli ışıktan koruyun ve 90 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin.
Hidrojel polimerize olduktan sonra, üst kapak kaymasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, jelin yüzeyindeki deseni mahvetmekten kaçınmak için kapak kaymasının geri düşmediğinden veya jelden kaymadığından emin olun. Hidrojelde kalan NHS esterini pasifleştirmek için, jele iki mililitre steril PBS ekleyin ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Jelleri derhal deneyler için hazırlayın veya daha fazla kullanana kadar steril PBS'de dört santigrat derecede steril PBS'de gece boyunca saklayın.
Hidrojeller, kümeler içindeki hücresel çekiş kuvvetlerini görselleştirmek ve ölçmek ve önceden belirlenmiş boyut ve şekle sahip ada desenleri oluşturmak için dolaylı olarak floresan fibronektin ile desenlendi. Desen kalitesi, PDMS damgasının döküldüğü ana kalıbın aslına uygunluğu ile doğrudan ilişkiliydi. Bu yöntem, önceden belirlenmiş şekle sahip izole edilmiş, iyi tanımlanmış ada desenleri üretebilir.
Fibronektin adezyon noktaları sadece adanın istenilen bölgesinde mevcuttu. Bu izole yapışma noktaları adaları, küme şeklinin daha iyi kontrol edilmesini sağladı. PDMS pullarının iki küçük 3-APTMS ile kaplanması kritik öneme sahiptir, çünkü çıkarma yönteminin etkinliğini sınırlarken, çok fazla damga yüzeyinde turuncu bir kalıntı yaratacaktır.
Burada oluşturulan desenler, hem bireysel hücrelerde hem de kümelerde hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılabilir, bu da mekanik homeostazı sürdürme yetenekleri hakkında fikir verir.
