Mikropatterning, hücre şekli ve hücreler arası makinelerin aktivitesi arasındaki bağlantıları anlamak için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir tekniktir. Çeşitli teknikler araştırmacıların hücre şeklini modüle etmesine izin verse de, bu teknikler genellikle bazı biyoloji laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipmanlar gerektirir. Bu video, piyasada bulunan çok sesli görüntüleme sisteminde mikropatterning'i otomatikleştirmek için gereken adımlarda size rehberlik edecektir.
Bu protokolün bir avantajı, özel ekipman kullanımından kaçınmasıdır. Desenler, genellikle mikropatterning'de en çok zaman alan işlem olan foto maskeleri yeniden yorumlamadan kolayca değiştirilebilir. Görüntü işleme aracımız, proteinlerin tarafsız ve otomatik bir şekilde temsili dağılımını yansıtan ortalama hücre görüntüleri oluşturur.
Deneylerimizde coverlips kullanmamıza rağmen, otomatik iş akışı slaytlar ve cam tabanlı yemekler üzerinde desen yapmanıza da olanak tanır. Sistemin otomatik bir şekilde görüntülenerek doğru odak düzlemini ve desenini tanımlaması için uygun mikroskop kurulumu kritik olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir. PVA çözümünü belirtildiği gibi hazırlayın.
Sekiz parça PVA'ya bir bölüm HCL ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin. Çözeltinin iki mililitresini küçük bir Petri kabına dökün ve sıvıya temiz bir ön işlemeli kapak batırın.
Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda beş dakika kuluçkaya yatır. Kapak kapağını çözeltiden dikkatlice çıkarın. Ceketi 40 saniye döndürmek için kapak döndürücü spinner kullanın.
Bu arada, cımbızları temizle. Kapak kapağını bir kutuya aktarın ve gece boyunca dört derecede kurutun. Mikroskop yazılımını açın.
İlk olarak, lazer hattını 750 nanometreye ayarlayın. Ardından Image adlı yeni bir optik yapılandırma ayarlayın. Bu, kapak çizgisini yansıtıcılar aracılığıyla görüntüleyenemizi sağlayan temel optik yapılandırmadır.
Diğer seçenekleri varsayılan olarak bırakın ve uygun hedefi seçin. Bu optik yapılandırma altında donanım ayarlarını yapılandırın. Kızılötesi lazeri stimülasyon lazerimiz olarak ayarlayın.
Görüntüleme için IR lazeri kullanmak için ışın ayırıcıyı ışık yoluna yerleştirin. Galvano tarayıcı birimini ve uygun D tarama dedektörünü seçin. Kapak üzerindeki küçük özellikleri yakalamak için yeterli olan bir tarama boyutu ve çalışma süresi seçin.
IR Lazer Kullan kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Kapak tabanı yüzeyinin parlak, ancak doygun olmayan bir görüntüsünü elde etmek için alım lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Tarama alanı penceresinde, tüm görüş alanını yakalamak için yakınlaştırmayı bire ayarlayın.
Optik yapılandırmayı kaydedin. Şimdi mikroskobun odaklanmasını, yatırım getirisi maskesini yüklemesini ve otomatik bir şekilde desenler üretmesini sağlayacak bir dizi optik yapılandırma kuracağız. İlk optik yapılandırma, mevcut görüş alanına otomatik odaklanmak için kullanılan güven verici bir işaretleyici yazdırmamızı sağlar.
Görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Güven verici işaretleyiciyi yazdırın. Bu adımda yazdırdığımız için, ışın ayırıcıyı ışık yolundan dışarı taşıyın ve uygun bir dikroik ayna ile değiştirin. Zaman kazanmak için en küçük tarama boyutunu seçin.
Bu adımda görüntülemeye gerek olmadığından dedektör hassasiyetini sıfır olarak ayarlayın. Yazdırmayı etkinleştirmek için lazer gücünü artırın. Tarama alanı penceresinde yakınlaştırmayı maksimum olarak ayarlayın ve tarama alanını görüş alanının ortasına yerleştirin.
Şimdi PVA yüzeyindeki düzensizliği hesaba katmak için bir Z-stack deneyi kuracağız. Z konumundaki hareketi göreli olarak ayarlayın. Uygun Z cihazını seçin.
Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Otomatik odaklama. En küçük tarama boyutunu seçin ve tarama alanı penceresindeki yakınlaştırma faktörünü azaltın, böylece görüş alanı güven verici işaretçiden biraz daha büyüktür. Bu, kapak kapağındaki diğer küçük özelliklerin otomatik odaklamayı engellememesini sağlar.
Aygıtlar menüsünde Otomatik Odaklama kurulumu'nu seçin. Z yığını denemesinde tarama kalınlığını buna ayarlayın. Mikroskop bu aralığı tarayacak ve güven verici işaretleyiciyi kullanarak en iyi odak düzlemini bulacaktır.
Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Yatırım Getirisini Yükle. Maske bu optik yapılandırmayla çekilen bir görüntüye yüklendiğinden, tarama boyutunu yatırım getirisi maskesininkiyle aynı şekilde ayarlayın. Çözünürlük ve hız arasında optimum dengeyi sağlamak için 2048 piksel kullandık.
Şimdi kapak tonlarını desenlamak için kullanılan optik konfigürasyonu kuracağız. Baskı güven verici işaretleyici optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Micropattern. Yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın.
PVA'yı alevlendirmek için stimülasyon lazer gücünü artırın. Uygun bir tarama hızı seçin. ND stimülasyon penceresinde, bir ND stimülasyon deneyi ayarlayın.
Zaman çizelgesine birkaç aşama ekleyin ve her biri stimülasyonda ayarlayın. Stimülasyon alanının ve süresinin doğru olduğundan emin olun. Aynı pencerede, her aşamadan önce sahne taşı ana Z işlevini etkinleştirin.
Bu yine Z yönünde herhangi bir sapmayı hesaba hazırlar. Son olarak, kapak kapağında desenleri bulmamıza yardımcı olabilecek görünür bir etiket yapmak için bir optik yapılandırma ayarlayın. Yazdırma güven verici işaretçisi çoğaltın ve yeniden adlandırın, Etiket yüzeyi.
Lazer gücünü önemli ölçüde artırın ve yakınlaştırmayı bire ayarlayın. PVA kaplı kapak kapağını bir tutucuya aktarın. Dik bir mikroskop için PVA yüzeyinin aşağı bakan olduğundan emin olun.
Kapak boruyu stabilize etmek için köşelere su ekleyin. Tutucuyu mikroskop aşamasına monte edin. Hedefi düşür ve aralara su ekleyin.
Mikroskop yazılımında, IR lazer deklanşöre açın ve desenlemeden önce otomatik hizalama gerçekleştirin. Görüntü optik yapılandırmasına geçin. Hedefi yavaşça kapak kılıfı ile yaklaştırırken görüş alanını tarayın.
İlk başta, görüntü son derece soluk görünecektir. Görüntü parlaklığı biraz artana kadar hedefi kapak kılıfı yakınlaştırın. Bu, hedefe bakan kapaklı yüzeydir.
Parlaklık azalana ve tekrar artana kadar hedefi hareket ettirmeye devam edin. Bu, modelleyeceğiz PVA yüzeyi. Kapak kusurları veya toz gibi herhangi bir küçük özelliğe odaklanın ve Z sürücüsünde sıfır ayarlayın.
Etiket yüzeyi optik yapılandırmasına geçin. Yakala'ya tıklayın. Görüntüleme ve taramaya geri dönün.
Cam hasarı etiketin başarıyla basıldığını gösterir. Cam parçacıklarını önlemek için sahne alanını bir ila iki görüş alanına taşıyın. Onaylamak için tarayın.
Aygıtlar menüsünde sahne alanı hareketi makrosunu açın. M ve N değişkenlerini desenlenecek istenen görünüm alanı sayısına ayarlayın. Makroyu kaydedin ve çalıştırın.
Desenleme tamamlandıktan sonra görüntü optik yapılandırmasına geçin ve desenleri tarayın. Her görüş alanındaki desen adaları net sınırlara sahip olmalı ve ışığı eşit olarak yansıtmalıdır. Daha koyu ve düzensiz görünen desenler eksik PVA kaldırmayı önerir.
Bunun nedeni genellikle yetersiz lazer gücü veya yanlış odak düzlemidir. Lazer gücü çok yüksek ayarlanmışsa, PVA'nın kabarcık yapmasına da neden olabilir. Hücreleri kapak örtülerine kapaktan sonra, hücreler yayılmalı ve desenin şeklini almalıdır.
Bu, yaylı tüfek deseni üzerine kaplanlanmış bir insan fibroblastının immünoresans görüntüsüdür. Hücre, aktiin bakımından zengin bir lamellipodia jantı görüntüler. İki tarafı kalın, ventral stres lifleri ve enine yaylarla birbirine bağlanmış sırt stres lifleri.
Miyozin ışık zinciri yoğun lamellipodia jantının arkasına oturdu ve aksin demetleri boyunca çizgili bir desen sergiledi. Özel görüntü işleme aracımızı kullanarak, ilgi çekici proteinlerimizin ortalama bir görüntüsünü oluşturduk. Bu görüntü, yukarıda açıklanan aksin yapılarının çok sayıda desende tutarlı olduğunu gösterir.
Ortalamadan sonra miyozin bireysel yapılarını kaybetmemize rağmen, aksin demetleri boyunca lokalizasyon korunur. Bu videoyu izledikten sonra, en az manuel çalışma ile piyasada bulunan bir multifotoğraf sistemi kullanarak bir mikro desenleme iş akışı kurabilmelisiniz. Tamamlanmamış desenler oluşturmaktan kaçınmak için lazer gücünü kendi sisteminiz için optimize etmek önemlidir veya otomatik odaklama ve mikropatterning adımlarındaki parametreleri ayarlayarak PVA Maksimum verimlilik elde edilebilir.
Hücre morfolojisini içeren hücresel yolların araştırılmasının yanı sıra, bu teknik ilaç taramasına ve hücre şeklindeki varyasyonlara duyarlı diğer uygulamalara da uygulanabilir.
