Yazarlar intravital film, Dr. Jonathan Lindquist yazının dikkatle okunması için optimize yardım için Dr. Lars Philipsen teşekkür ve Gunzer laboratuvar yönteminin geliştirilmesi sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için tüm üyeleri. Bu çalışma MG Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) bağışları ile finanse edilmiştir

1. Enfeksiyon <ol><li> Şişmiş konidya küf Aspergillus (suşu ATCC 46.645) ile desteklenmiş RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ön-inkübasyon tarafından üretilen% 5 FCS (v / v). 2x10 7 dinlenme konidya 5 ml ortamda yeniden süspanse ve 6-iyi doku kültürü plakası (DYP AG; Trasadingen, İsviçre, katalog # 92.006) inkübe 37 ° 7h ° C </li><li> 6-iyi de içeren her Aspergillus; şişme döneminin ardından, sporlar floresan calcofluor beyaz stok solüsyonu (DMSO [25 mg / ml] Sigma Aldrich, Deisenhofen, Almanya, katalog # F3543) 10 ul ekleyerek etiketlenir plaka, son bir calcofluor konsantrasyonu 50 mcg / ml RPMI ulaştı. Nazik karıştırma, sporlar, 37 ° C&#39;de 15 dakika ek bir inkübe </li><li> Bir sonraki adımda, sporlar, 70 mikron hücre süzgeç (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ile filtrasyon ile hasat edilir. Pelet 2 ml PBS ve şişmiş Konidyumların Neubauer odasına sayma tarafından belirlenen toplam sayısı 10 ml PBS (oda sıcaklığında 5 dakika 900xg santrifüj) ile bir kez yıkadıktan sonra yeniden süspanse. Son olarak, spor süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika 900xg aşağı bükülmüş, süpernatantı dikkatle kaldırılır ve pelet nihai konsantrasyonu 100 ul PBS başına 1x107 sporları için yeniden süspanse. </li><li> Enfeksiyon, spor çözüm ul dişi farelerde (C57/BL6, eski 8-10 hafta, Harlan, Almanya) 100 intratrakeal uygulanır. Nötrofillerin yanı sıra dikkat edilmesi gereken ise, lizozim Promotor 1 altında EGFP taşıyan Lys-EGFP farelerin kullanımı tavsiye edilir. 150 ul Ketamin / Rompun çözüm (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya (Ketamin) ve Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] başlayın hayvan tek bir IP enjeksiyonu ile anestezi + 0.5 ml Rompun% [2] + 3.5 ml steril NaCl [% 0.9]). 5 dakika sonra anestezi fare dişleri entübasyon (ek Şekil 1) kolaylaştırmak için rampa (yani bir eğimli yüzey) elastik bir bant ile sabit olabilir. Forseps kullanarak, dil, tek taraflı ve 22G kalıcı venöz kateter (B. Braun AG, Melsungen, Almanya, Vasofix Braunüle) hafifçe kalıcı bir kaz boyun lamba ile aydınlatma altında trakea içine eklenebilir çekilir. Kateterin başarılı ekleme, mekanik ventilatör frekans hayvanın göğüs kafesi düzenli hareketlerini izleyerek tarafından doğrulanmadı. Başarılı entübasyon onaylandığı zaman, 100 ul spor süspansiyon, 100 ul mikropipet kullanılarak uygulanır. Bu ses 1-2 sn içinde herhangi bir ek yardım almadan hayvan tarafından inhale edilmelidir Mekanik olarak 2 dakika boyunca dakikada 250 nefes oranı ve 300 inhalasyon hacmi küçük bir hayvan respiratör (MiniVent Hugo Sachs, Mart-Hugstetten, Almanya) ile enfekte hayvan havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir ul nefes başına (ek Şekil 2). Enfeksiyon hayvanlar kendi kafesine geri döndü ve tekrar ayaktan kadar her 5 dakikada bir gözlenen sonra. Fare aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında ağrı veya sıkıntı herhangi bir kanıt yoktur. </li></ol> 2. Akciğer hazırlık <ol><li> Sporlarla birlikte enfeksiyon 7 saat sonra, hayvanın aşırı dozda tarafından ötenazi izofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Almanya) hareketleri ve solunum 30 saniyeden fazla durdurdu kadar. Bu daha sonra, ikincil bir yöntem olarak klinik ölüm sağlamak ve görselleştirme ve trakea ve akciğerler erişim için izin torakotomi takip edilmektedir. Sonra göğüs, akciğer ve üst solunum yolu açığa çıkarmak için dikkatle açıldı. Sonra başka bir 22G kalıcı venöz kateter maruz epiglot başlayarak trakea içine sokulur. Bu borucuk aracılığıyla akciğerlere 1 ml Omnifix şırınga (B. Braun) ile 1 ml önceden ısıtılmış düşük erime agaroz (2% w / v, Promega, Mannheim, Almanya) ile doldurulur. Trakea, akciğerler dolu olarak kısa bir parça dikiş ipliği ile bağlıdır ve tüm hayvan 4 bir buzdolabı koymak ° C. </li><li> 15 dakika sonra, agaroz katılaşmış, tüm akciğer, trakea itibaren eksize edilir. Bir çift sivri makas kullanarak, sağ akciğer lob daha sonra kaldırılır, alt yüzeyi kısa süre içinde bir yaprak kağıt mendil kurutulur ve daha sonra tüm lob vibratome (Chipping Instruments, İngiltere, 752M Vibroslice hazırlanması blok yapıştırılmış ) fiksasyon için doku yapıştırıcısı (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya, Roti-Coll 1) bir damla. 1 dakika sonra blok önceden soğutulmuş (4 ° C) PBS ile doludur vibratome, kesme odasında yüklenir. Vibratome orta sınıf bir titreşim (10 max 5) ve aynı zamanda orta hızı (5, 10 max.) Böyle bir yatay kesitiakciğer üretilmektedir. Organ üst yarısında daha sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı Kendi kendine yapılan bir düz rondela (iç çapı 1 cm) ile ters ve sabit bir küçük plastik Petri kabı (5 cm çapında), aktarılır dışında her 1 mm (tamamlayıcı şekil 3). Son olarak Petri kabı 10 ml PBS ile desteklenmiş 10 ul DNA boya Sytox Turuncu 5 mcM son bir boya konsantrasyonu [5 mM] (Invitrogen, Almanya) ile doludur. </li></ol> 3. 2-foton lazer mikroskopisi <ol><li> Akciğer örnek içeren Petri kabı sonra tampon bir sıcaklık sensörü kontrollü ısıtıcı (ek Şekil 4) ile 37 ° C ısınmış olabilir, böylece mikroskop objektif altında yüklü. 2-foton mikroskopi sonra 20xNA1.0 suya daldırma lens (Zeiss Jena, Almanya) ile donatılmış bir dik Axio Examiner sahnede Zeiss LSM 710 NLO mikroskop kullanarak tüm kesim yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Görüntüleme için, bölüm boyunca farklı alanlarda tespit yeşil (530 nm) ve kırmızı (580 nm) floresans yanı sıra, ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyal ve 800 nm dalga boyunda bir aydınlatma ile 400 mikron derinliğe kadar taranır mavi calcofluor floresan olmayan harici descanned dedektörleri (NDD) (400-470 nm emisyon). 2-D görüntü ve zaman atlamalı filmleri (1 resim her 5-10 saniye) yanı sıra, tek veya tekrarlayan 3-boyutlu resim yığınlarını sonradan voksel kaplamalar kullanarak ya da tek uzun odak görüntü veya 4-D (zamanla 3D) olarak işlenecek farklı yazılım paketleri. Bu mikroskobik kurulum havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası oluşturur, muazzam bir immünolojik alaka, neredeyse bozulmamış bir ortamda hücresel davranış gözlem sağlar. Hücre motilite, fagositoz ve küf Aspergillus enfeksiyonu takiben endojen nötrofil NET üretim yerinde koşullarda kolayca bu altında incelenebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Eğer yapılırsa düzgün görüntüleme 2 üretecektir - veya 3-renkli dia veya film. Boyama sonrası bir işleme prosedürü yapılır ve böylece özgürce adapte olmasına rağmen, genelde göreceli kanal tespit boya / sinyal, doğal renk yansıtan bir boyama düzenini seçin. Böylece, Sytox boyalar varsa, EGFP-işaretli hücrelerin yeşil lekeli, kırmızı, mantar gibi SHG sinyal mavi ile gösterilmiştir tasvir ve. İlk örnekte (Şekil 1) mavi SHG sinyali ile enfekte olmayan akciğer dokusu lifleri ve kırmızı Sytox sinyal, akciğer yerleşik hücrelerinin çekirdekleri tarafından üretilen vibratome tarafından kesilerek açılır gösteriyor. Hem de alveoler yapıların yanı sıra mantar kitlelerin, mavi renkte görünmesi, çekirdek ve NET&#39;ler kırmızı lekeli ikinci örnekte (Şekil 2) virüslü bir akciğer, gösterilir. Üçüncü örnek (Şekil 3), yeşil, mavi ve kırmızı yapıların yanı sıra nötrofiller de görülebilir Lys-EGFP transgenik hayvan. Nötrofil ve zaman atlamalı dizileri bireysel mantar elemanlarının fagositoz göç tamamlayıcı film gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Enfekte olmayan akciğer dilim 2-renkli bir görünüm 2-foton mikroskopi. Akciğer dilim olmayan enfekte fare C57/BL6 hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülü. Alveoler doku yapısı (A) SHG sinyal burada Sunan akciğer dilim (B) ve iki kanal (C) bir yerleşim hazırlanması sırasında, hücre çekirdeğinin Sytox sinyal açık kesti. (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Akciğerin alt kısmında fibröz doku olarak yukarıdaki akciğer solunum aktif alanlar içinde açıkça alveoler organizasyona kıyasla dilim dikkat ediniz. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Aspergillus enfekte vahşi tip hayvan akciğer dilim 2-foton mikroskopi 2-renk görünümü. 7 saat enfekte C57/BL6 fare akciğer dilim A. önce fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveolar doku (A), DNA NET&#39;ler Sytox sinyal yanı sıra hücre çekirdekleri hazırlanması sırasında (B) akciğer dilim kesilerek açılır ve iki kanal kaplama (C) . (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Lütfen dikkat, mantar kitleler, alveoller ve NET-yapıları açıkça farklı alanlarda sırasıyla E, A ve N harfleri ile işaretlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. 3-renk akciğer dilim Aspergillus enfekte Lys-EGFP hayvan bir görünüm 2-foton mikroskopi Lys-EGFP fare akciğer dilim 7 saat önce enfekteA. fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveoler doku (mavi), hücre çekirdekleri ve NET&#39;ler (kırmızı) Sytox sinyal, yanı sıra yanı sıra çok sayıda nötrofil (yeşil). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Şekil 4" /> Tamamlayıcı rakam 1. Entübasyon için Fare fiksasyonu. Ketamin / Rompun anestezi altında hayvan dişlerini 22G kalıcı venöz kateter ile entübasyon kolaylaştırmak amacıyla elastik bir bant ile sabitlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Şekil 5" /> Tamamlayıcı rakam 2. Mekanik fare ventilasyon entübe fare 100 ul PBS içinde yeniden süspanse 1x10 7 sporların bir uygulama tarafından bulaşır. Mekanik, küçük bir hayvan solunum ile enfekte fare havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Şekil 6" /> Tamamlayıcı rakam 3. Akciğer lob fiksasyon organ sağ akciğer lob ön hazırlıktan sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı bir laboratuvar yapımı düz rondela kullanmak bir Petri kabındaki sabit . <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Şekil 6" /> Tamamlayıcı rakam 4. 2-foton görüntüleme kurulum sağ akciğer lob içeren Petri kabı, boya Sytox Orange DNA eklenmesinden sonra 2-foton mikroskop altında bir ısıtma matı yüklü . Ek film: yaşayan bir mantar enfeksiyonu sonrası akciğer dilim 7 saat 2-foton mikroskopi zaman atlamalı görüldüğü gibi göç ve Aspergillus enfekte akciğerlerde mantar elemanları phagocytosing Nötrofiller Nötrofiller yeşil, mantar elemanları ve SHG mavi ve hücre çekirdekleri gibi NET yapıları kırmızı olarak tasvir edilmektedir. Deney gerçek zamanlı sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mm gösteriyor. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">videosunu izlemek için tıklayın</a>

<ol>
	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

In vivo ya da sağlam organlarda Gerçek-zamanlı 2-foton mikroskopi, son 10 yılda, bağışıklık hücrelerinin fizyolojisi ile ilgili çalışmalarda derin önem kazanmıştır. T-hücre aktivasyonu, lenf düğümleri içinde dinamikleri gibi önemli olaylar ilk 2-4 görünür hale geldiği, bu tekniği ile oldu . Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar da, bu yaklaşımın 5 kullanarak lenfatik dokular efektör hücrelerinin üretimi ilk adımları gibi spesifik hücresel fonksiyonları analiz etmeye başladık . Ancak, bu yöntemi kullanarak bir dizi yeni biyolojik kavramların ortaya olmasına rağmen, hala zorlu ve hiçbir intravital görselleştirme çalışmaları şimdiye kadar yayınlanmış olan hangi önemli sorular vardır. Özellikle bu memeli akciğer için de geçerlidir. Bu organ ilginç yönü, havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası olarak, immünolojik süreçleri memeli vücutta yer aldığı en önemli yüzeylerin biri yapar. Bütün ömrü boyunca her nefeste, istenmeyen parçacıklar olan ve hayatı tehdit eden enfeksiyonlara 6 neden potansiyeline sahip bazı solunması. Savunma mekanizmalarının böyle bir hassas ve nesilleri tükenme tehdidi altında olan bir yerinde sıkı bir ağ bağışıklık yanıtlarını tüm repertuar sergileyen bulunması gereken bu kendi kendini açıklayıcı. Öte yandan, böyle bir &quot;kirli&quot; bir yerde potansiyel patojenlere karşı uyarılan immünolojik mücadele sıkı kontrol olması çok önemlidir. Bağışıklık sisteminin abartılı tepkiler, kitlesel belirsiz immün hücre eylemleri 7,8 uyarılması üzerine organ doku yaralanmasına kendi bedeni zarar yüksek bir risk taşımaktadır . Bu düşünceler ışığında, in vivo koşullarda gerçek altında memeli akciğerlerde hücre davranışı araştırmak için son derece ilginç ve yararlı olacaktır. Ancak, böyle bir sistemin şimdiye kadar başarılı bir çalışma protokolü kurma çözülmesi gereken çok büyük zorluklar açıkça noktaları uygulamaya henüz sahip olduğu bir gerçektir. En zorlu meydan muhtemelen odak istikrar. Nefes sorumlu organı olarak akciğer inhalasyon gerçekleştirmek için alan her üç yönde sürekli hareket altındadır. Bu durum tek başına, ciddi görüntüleme sorunlara neden olur ve bir intravital görüntüleyiciler &quot;kabus&quot; olarak kabul edilebilir. Zaten uzayda herhangi bir boyut için hafif bir hareket, mikroskobik görüntüsü, anlamlı görüntüler oluşturmak için 9 mikrometre hassasiyetle kararlı olması gereken büyük bir bozulan bir etkiye sahiptir. Doğal sıkı yerel odak göz önüne alındığında, 10, 2-foton mikroskopi, odak kararsızlıkları bile daha duyarlı Z-yönünde sadece birkaç mikrometre aralığında belirli bir yapının bir çıkığı olarak tam bir odak kaybına eşdeğerdir ve dolayısıyla başarısız bir deneme. Fare akciğer içinde bağışıklık hücreleri, gözlem için bu çalışmada sunulan protokol, işlevsel sağlam akciğer 11 durum in vivo uygulama değil, yakın bir değildir. Eksplante lenf örneğin görüntüleme lenfositler için ex vivo yaklaşımları , düğümleri, in vivo gözlemler 12 gerçek eşdeğer sonuçlar gösterilmiştir ve bu nedenle 5 derece alakalı. Yaklaşımı ile mümkün olan akciğer dilimleri, yerinde gözlemler, virüslü bir akciğer, kısa bir süre eksizyon sonra gerçekleşecek . Kesme işlemi sırasında 3D bütünlüğünü agaroz matris, akciğer tam kontrollü kesme işlemi sağlamak için önemli bir adım tarafından sağlanmaktadır. Agaroz matris bir katılaşma izin vermek için kısa bir süre için eksplante akciğer soğutmak için gerekli olmasına rağmen, kesme ve doku rewarming sonra hücreleri için yakın fizyolojik koşullara dönmek mümkün. Bu açıkça, bu koşullar altında nötrofillerin son derece aktif ve Aspergillus enfeksiyonu etkili bir şekilde temizlenmesi için gerekli olan çevik fagositler, potansiyellerini tam olarak sergilemek olduğunu göstermek bizim veri gösterilir. Bunlar alveoller iç bölgelerine ulaşmak için epitel engelleri geçerek akciğer dokusunda devriye ve bunun da ötesinde, mantar sporlarının aktif 11 kadar sürebilir. Bu çalışmanın bir anahtar bulgu Aspergillus enfekte organ Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) benzeyen yapılar görünümünü oldu. NET&#39;ler nötrofil 13 yeni savunma mekanizması çok yakın bir bulgudur . Ancak, 2004 yılında ilk açıklamasını bu yana, hayvan modellerinde ya da bu fenomeni gözlenmiştir veya eksik olan insanlarda fizyolojik veya patolojik koşullar sayısı patlayarak 14-16 artan olmuştur. İlginçtir ki, çok çalışma, bu yapıların çok farklı gruplar tarafından harcanan olmasına rağmen, çoğu raporda hala çok açıklayıcı bir seviyede ve çok değilNET sürümü mekanizması ve düzenlenmesi ile ilgili bilinir. Protokolü ile virüslü bir akciğer NET lifler göstermek için ilk kez başardık. Ayrıca, biz, kendi oluşumu veya inhibisyonu 11 için taze işe nötrofil yanı sıra moleküler mantar yapıların önemini göstermek . Bu yöntemi daha ayrıntılı NET oluşumu tek adımları araştırmak için potansiyeli açık bir şekilde göstermektedir. Bir evlatlık transfer deneylerde NET oluşumu becerilerini gözlemlemek için uygun fareler knock-out nötrofil kullanmak örneğin düşünebiliriz. Böylece periferik kan nötrofil göç doğrudan gözlem Organ eksplantasyonunun sonra kan arz eksikliği nedeniyle bu sistem ile mümkün olmamasına rağmen, biz hala bizim protokol görüntüleme sağlayan bir işlemek için değerli ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğuna inanıyorum akciğer enfeksiyonlarına karşı bağışıklık savunma erken veya geç adımlar. Bu nedenle, canlı hayvanların solunum akciğer içinde bu fenomenin incelenmesi yönünde önemli bir adımdır.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Gastrointestinal sistem, akciğer, omurgalı vücut ve çevre arasındaki etkileşim için en büyük ikinci yüzey. Burada, aynı zamanda, normal solunum sırasında inhale birden fazla patojenlerin enfeksiyon kaçınarak etkili bir gaz alışverişi, bakımlı olmalıdır. Bunu başarmak için, savunma stratejileri, humoral ve hücresel immün mekanizmaları birleştirerek mükemmel bir set var. Akut akciğer savunma için en etkili önlemlerden biri ya da inhale patojenleri fagosite veya sitotoksik kimyasalların serbest bırakarak onları öldürmek nötrofil, işe alım. Nötrofil cephanelik için yeni bir ek bakteri veya mantar yakalanan veya inaktive NET serbest hücreleri öldü sonra bile olabilir ekstrasellüler DNA NET&#39;ler patlayıcı sürümüdür. Biz, burada kısa bir süre önce enfekte akciğer içinde göç yanı sıra enfekte doku boyunca ürettiklerini geniş NET&#39;ler görselleştirmek gibi fungal patojenlerin phagocytosing nötrofil biri doğrudan gözlemlemek için izin veren bir yöntem mevcut. Bu yöntem, çok renkli zaman atlamalı 2-foton mikroskopi kalıp Aspergillus ve sınav konidya ile farelerin intratrakeal enfeksiyon 7 saat sonra, kalın yaşayabilir akciğer dilimler hazırlama açıklamaktadır. Bu yaklaşım, bir doğrudan yerli akciğer dokusunda antifungal savunma araştırmak için izin verir ve böylece pulmoner dokunulmazlık ayrıntılı soruşturma için yeni bir caddeye açılır.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Görüntüleme.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.