המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר לארס Philipsen לעזרה עם אופטימיזציה של סרטים intravital, ד&quot;ר יונתן לינדקוויסט עבור בזהירות לקרוא את כתב היד, וכל אנשי המעבדה Gunzer לדיונים הערות מועילות במהלך הפיתוח של השיטה. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) ל MG

1. זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Conidia נפיחות של העובש אספרגילוס fumigatus (זן ATCC 46,645) מופקים על ידי הדגירה טרום ב RPMI 1640 (Biochrom AG, ברלין, גרמניה), בתוספת 5% FCS (v / v). 2x10 7 conidia מנוחה הם resuspended בינוני 5 מ&quot;ל ו מודגרות בתוך צלחת 6-היטב רקמות תרבות (TPP AG; Trasadingen, שוויץ, קטלוג # 92006) עבור 7h על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התקופה נפיחות, הנבגים הם שכותרתו fluorescently ידי הוספת 10 μl של פתרון לבן המניות calcofluor (סיגמא אולדריץ&#39;, Deisenhofen, גרמניה, קטלוג # F3543; [25 מ&quot;ג / מ&quot;ל] ב DMSO) לכל אספרגילוס המכיל היטב 6-היטב צלחת, והגיע ריכוז סופי calcofluor של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​RPMI. לאחר ערבוב עדין, הנבגים מודגרת 15 דקות נוספות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, הנבגים נקצרים על ידי סינון דרך תא 70 מיקרומטר מסננת (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). אחרי כביסה אחת עם 10 מ&quot;ל PBS (צנטריפוגות ב 900xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר) היא גלולה resuspended ב 2 מ&quot;ל PBS ואת המספר הכולל של conidia נפוחות נקבע על ידי ספירה עם תא Neubauer. לבסוף ההשעיה נבג הוא הסתובב לעבר 900xg 5 דקות בטמפרטורת החדר, supernatant הוא הסיר בזהירות, גלולה resuspended הריכוז הסופי של 1x107 נבגים ל -100 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהום, 100 μl של פתרון נבג מוחל intratracheally לעכברים הנשי (C57/BL6, 8-10 שבועות, הארלן, גרמניה). אם נויטרופילים יש לצפות גם השימוש ליס-EGFP עכברים, נושאת EGFP תחת promotor ליזוזים 1 מומלץ. בגין על ידי הרדמה החיה עם זריקה IP יחידה של פתרון 150 Ketamin / Rompun μl (Inresa Arzneimittel GmbH, פרייבורג, גרמניה (Ketamin) ו באייר ויטל GmbH, לברקוזן, גרמניה (Rompun), 1 מ&quot;ל Ketamin [50 מ&quot;ג / מ&quot;ל] + 0.5 מ&quot;ל Rompun [2%] + 3.5 מ&quot;ל סטרילי NaCl [0.9%]). 5 דקות מאוחר יותר העכבר הרדים יכול להיות קבוע עם גומייה על ידי השיניים שלה הרמפה (כלומר, משטח משופע) כדי להקל על אינטובציה (דמות משלים 1). בעזרת מלקחיים, הלשון היא משכה הצידה צנתר ורידי 22g שכינת (B. Braun AG, Melsungen, גרמניה, Vasofix Braunüle) יכול להיות מוכנס בעדינות תחת תאורה קבועה עם מנורה צוואר אווז לתוך קנה הנשימה. הכניסה המוצלחת של הקטטר מאומת על ידי התבוננות תנועה סדירה של בית החזה של החיה עם תדירות ההנשמה המכני. כאשר אינטובציה מוצלחת אושרה, 100 ההשעיה נבג μl מיושמת באמצעות micropipette 100 μl. נפח זה צריך להיות בשאיפה ידי החיה ללא כל עזרה נוספת 1-2 s. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני החיה הנגועים במשך 2 דקות עם הנשמה חיה קטנה (MiniVent, הוגו סאקס, מארס Hugstetten, גרמניה) בשיעור של 250 נשימות בדקה ואת נפח שאיפה של 300 μl לכל נשימה (דמות משלים 2). אחרי החיות זיהום מוחזר לכלוב שלהם נצפו כל 5 דקות עד אמבולטורי שוב. עכברים לא מראים כל עדות של כאב או מצוקה במהלך תקופת הדגירה הבאה. </li></ol> 2. ריאות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 שעות לאחר ההדבקה עם הנבגים, בעל החיים מורדמים ממנת יתר של isoflurane (בקסטר GmbH, Unterschleiβheim, גרמניה) עד תנועות נשימה הפסיקו במשך יותר מ 30 שניות. זהו לאחר מכן על ידי פתיחת בית החזה כשיטה משנית להבטיח מוות קליני ולאפשר גישה להדמיה של קנה הנשימה והריאות. ואז החזה נפתח בזהירות כדי לחשוף את הריאה ואת דרכי הנשימה העליונות. ואז צנתר ורידי אחר 22g שכינת מוכנס לתוך קנה הנשימה החל מכסה הקנה חשוף. דרך אבובית זה הריאות מלאים 1 מ&quot;ל מראש חימם ההיתוך agarose נמוכה (2% w / v, Promega, מנהיים, גרמניה) באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל Omnifix (B. Braun). ברגע לריאות מלאים קנה הנשימה נקשר עם חתיכת קצר של חוט תפירה החי כולו מוכנס לתוך מקרר ב -4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 דקות מאוחר יותר, כאשר agarose יש הקרושה, הריאה כולה הוא נכרת החל לקנה הנשימה. בעזרת מספריים מחודדות, האונה ריאה ימין מוסרת לאחר מכן, על פני השטח התחתונה היא מיובשים בקצרה על דף נייר, ואז כל האונה מודבק לחסום את הכנת (Campden מכשירים, בריטניה, vibratome 752M Vibroslice ) באמצעות טיפת דבק רקמות עבור קיבעון (קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה, רוטי, קול 1). לאחר דקות 1 לחסום את מותקן בתא החנית של vibratome, אשר מלא מראש מצונן (4 ° C) PBS. Vibratome מוגדר רטט אמצע טווח (5 מתוך מקסימום 10.) וגם מהירות בינונית (5 מתוך מקסימום 10). כזה חתך אופקי שלריאה מיוצר. החצי העליון של האיבר הוא הועבר לאחר מכן לתוך פלסטיק קטן צלחת פטרי (5 ס&quot;מ קוטר), שם הוא הפוך וקבוע עם מכונת כביסה מתוצרת עצמית שטוח (1 ס&quot;מ קוטר פנימי), כי הוא מכוסה על ידי קבוצה של חוטי ניילון במקביל, כל 1 מ&quot;מ זה מזה (איור משלים 3). לבסוף צלחת פטרי מלא 10 מ&quot;ל PBS בתוספת 10 μl של צבע DNA Sytox אורנג&#39; [5 mM] (Invitrogen, גרמניה) וכתוצאה מכך ריכוז צבען הסופי של 5 מיקרומטר. </li></ol> 3. 2-פוטון לייזר מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי שמכילה את דגימת הריאות מותקן ולאחר מכן, תחת המטרה מיקרוסקופ כך החיץ ניתן לחמם 37 ° C על ידי חיישן טמפרטורה שבשליטת דוד (דמות משלים 4). 2-פוטון מיקרוסקופית נישא החוצה על פני השטח חתך שלם באמצעות LSM Zeiss 710 מיקרוסקופ NLO על הבמה זקוף בוחן Axio מצויד בעדשה 20xNA1.0 מים טבילה (Zeiss, Jena, גרמניה). עבור הדמיה, אזורים שונים לאורך הקטע נסרקים עד לעומק 400 מיקרומטר באמצעות גל של 800 ננומטר תאורה גילוי ירוק (530 ננומטר) אדום (580 ננומטר) הקרינה, כמו גם את הדור הרמוני השני (SHG) אות ו כחול calcofluor הקרינה (על פליטת 400-470 ננומטר) עם גלאים חיצוניים שאינם descanned (NDD). מלבד 2-D תמונות זמן לשגות סרטים (1 תמונה כל 50-10 שניות), יחיד או חוזרות 3 מימדי ערימות תמונה ניתן לעבד לאחר מכן כמו renderings voxel יחיד או תמונות מוקד המורחבת או 4-D נתונים (3D לאורך זמן) באמצעות חבילות תוכנה שונות. זו ההגדרה המיקרוסקופית מאפשרת תצפית על התנהגות הסלולר בסביבה כמעט ללא פגע, כפי שהיא מהווה נמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, הוא הרלוונטיות החיסונית עצום. תנועתיות התא, phagocytosis ייצור NET ידי נויטרופילים זיהום אנדוגני הבאים עם עובש אספרגילוס fumigatus ניתן לחקור בקלות בתנאים באתרו תחת אלה. </li></ol> 4. נציג תוצאות אם נעשה כראוי הדמיה יפיק 2 - או 3 צבעים שקופיות או סרטים. למרות צביעה נעשה בהליך עיבוד פוסט ועל כן להתאמה בחופשיות, אנחנו בדרך כלל לבחור ערכת צביעה המשקף את הצבע הטבעי של צבע / אות, אשר מזוהה בערוץ יחסית. לפיכך, צבעי Sytox מתוארים אדום, פטריות, כמו גם את האות SHG מוצג כחול, אם קיימת, EGFP שכותרתו תאים מוכתמות בירוק. בדוגמה הראשונה (איור 1) את האות SHG כחול מתאר את סיבי רקמת הריאה הלא נגועים לבין האות אדום Sytox מופק על ידי גרעין של הריאה תושב תאים יחתכו אותי vibratome. בדוגמה השניה (איור 2) הריאות נגוע מוצג, שם שניהם, מבנים מכתשיים כמו גם ההמונים פטרייתי, יופיעו בכחול, בעוד הגרעינים ורשתות מוכתמות באדום. הדוגמה השלישית (איור 3) היא מבעל חיים מהונדס ליס-EGFP שבו בנוסף למבנים כחול ואדום נויטרופילים ירוק ניתן גם לראות. הגירה של נויטרופילים phagocytosis שלהם אלמנטים פטרייתי בודדים רצפי זמן לשגות מוצג בסרט משלים. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. המראה של פרוסת שאינם נגועים ריאה בצבע-2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאות הוכן מתוך עכבר C57/BL6 הלא נגוע צילמו כמפורט בפרוטוקול. מתפרסמות כאן את האות SHG של מבנה רקמות מכתשיים (א), את האות Sytox של גרעיני תאים לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C). שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד &#39;). שימו לב רקמה סיבית בחלק התחתון של הריאות פרוסה לעומת הארגון מכתשיים בבירור בתוך נשימה פעיל בתחומים של הריאה לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע מסוג אספרגילוס בר צבע 2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאה מן העכבר C57/BL6 נגוע 7 שעות לפני כן עם א &#39; fumigatus הוכן צילמו כמפורט בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי בשילוב SHG של הרקמה מכתשיים (א), את האות Sytox של רשתות ה-DNA, כמו גם גרעין התא לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C) . שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד &#39;). לידיעתך, באזורים שונים בבירור ההמונים פטרייתי, alveoli, ו-NET המבנים המסומנים באותיות, F ו-N, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע ליס-EGFP אספרגילוס בצבע 3 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת הריאות של עכבר ליס-EGFP נגוע 7 שעות לפני עםא fumigatus הוכן צילמו כמתואר בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי SHG בשילוב של רקמות מכתשיים (כחול), את האות Sytox של גרעיני תאים ורשתות (אדום), וכן גם נויטרופילים רבים (ירוק). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="איור 4" /> משלימה דמות 1. קיבעון עכבר עבור אינטובציה. תחת הרדמה Ketamin / Rompun החיה קבוע עם גומייה על השיניים שלה כדי להקל על אינטובציה עם צנתר ורידי שכינת 22g. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="איור 5" /> משלימה דמות 2. עכבר אוורור מכני. העכבר צנרר נגוע על ידי יישום זה של 7 נבגים 1x10 resuspended ב 100 μl PBS. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני העכבר נגוע הנשמה חיה קטנה. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="איור 6" /> משלימה דמות 3. האונה ריאות קיבעון. לאחר הכנה של האונה הימנית איבר הריאות הוא קבוע בצלחת פטרי על ידי שימוש מכונת כביסה שטוח מעבדה מתוצרת כי הוא מכוסה על ידי מערכת של חוטי ניילון במקביל. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="איור 6" /> משלימה דמות 4. 2-פוטון ההתקנה הדמיה. צלחת פטרי שמכילה את האונה ריאה ימין מותקן על מחצלת חימום תחת מיקרוסקופ 2-הפוטון לאחר תוספת של ה-DNA Sytox צבע כתום. הסרט משלים:. נויטרופילים נויטרופילים נודדות phagocytosing אלמנטים פטרייתי בריאות אספרגילוס נגוע כפי שניתן לראות על ידי זמן לשגות 2-פוטון מיקרוסקופית של h חי פלח 7 ריאות לאחר ההדבקה עם הפטרייה הם ירוק, פטריות מרכיבים SHG הם כחול, גרעיני תאים כמו גם NET-המבנים מתוארים אדום. השעה האמיתית של הניסוי מוצג בפינה הימנית התחתונה. סרגל מידה מתאר 50 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a>

<ol>
	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

בזמן אמת 2-פוטון מיקרוסקופית in vivo או באיברים שלמים צברה חשיבות רבה במחקרים העוסקים הפיזיולוגיה של תאים חיסוניים במהלך 10 השנים האחרונות. זה היה עם הטכניקה הזו, כי אירועים חשובים כמו הדינמיקה של הפעלת תא T בתוך בלוטות הלימפה הראשון הפך גלוי 2-4. לאחרונה, חוקרים החלו גם לנתח פונקציות סלולריות ספציפיות כמו הצעדים הראשונים בדור מפעיל תאים ברקמות הלימפה שימוש בגישה זו 5. עם זאת, למרות מספר מושגים ביולוגיים חדשים נחשפו באמצעות שיטה זו, ישנם עדיין מאתגרת שאלות חשובות עבורו אין מחקרים להדמיה intravital פורסמו עד כה. יש לציין כי זו חלה על הריאות של יונקים. ההיבט המעניין של האיבר הזה, כנמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, עושה את זה אחד המשטחים החשוב ביותר שבו תהליכים מתרחשים החיסונית בגופם של יונקים. עם כל נשימה על תוחלת החיים, חלקיקים לא רצויים הם נשאפים שבחלקם יש פוטנציאל לגרום לזיהומים מסכני חיים 6. זה מובן מאליו כי במקום כה רגיש וסיכנו רשת הדוקה של מנגנוני הגנה צריך להיות נוכח מציג את רפרטואר שלם של המערכת החיסונית. מצד שני זה מאוד חשוב שהמאבק החיסונית הנגרמת נגד פתוגנים פוטנציאליים מקום כזה &quot;מלוכלך&quot; נתונה לפיקוח הדוק. תגובות מוגזמות של המערכת החיסונית לשאת בסיכון גבוה של פגיעה בגופו על ידי פציעה של רקמות איבר מאסיבי על גירוי של תא החיסון נוקבים פעולות 7,8. לאור המחשבות האלה זה יהיה מעניין מאוד מועיל יש את האפשרות לחקור את התנהגות התא בריאות יונקים תחת נכון בתנאים vivo. עם זאת, העובדה כי מערכת כזו עד כה לא יושמו בהצלחה בבירור מצביע על הקשיים העצומים שיש לפתור בהקמת פרוטוקול עבודה. האתגר התובעני ביותר כנראה הוא יציבות להתמקד. הריאות כגוף האחראי על הנשימה תחת תנועה מתמדת בכל שלושת הכיוונים של מרחב לממש שאיפה. תנאי זה לבד גורם לבעיות הדמיה חמורים יכולים להיחשב imagers intravital &quot;סיוט&quot;. כבר תנועה קלה מימד בחלל יש השפעה מסיבית על הידרדרות להציג את מיקרוסקופיים, אשר צריך להיות יציב עם דיוק מיקרומטר על מנת להפיק תמונות בעלות משמעות 9. בהתחשב להתמקד הדוק מטבעו שלה המקומיות 10, 2-פוטון מיקרוסקופית הוא אפילו רגיש יותר אי יציבות מוקד, כמו פריקה של מבנה מסוים בטווח של רק כמה מיקרומטרים בכיוון-Z שווה לאובדן מלא של המוקד ובכך הניסוי נכשל. פרוטוקול שהוצג במחקר זה לצורך השגחה של תאים חיסוניים בתוך הריאה Murine עדיין לא ביישום vivo, אלא הערכה קרובה למצב ריאה שלם מבחינה תפקודית 11. גישות Ex vivo עבור לימפוציטים הדמיה, למשל הלימפה explanted צמתים, הוכחו להניב תוצאות שוות ערך אמיתי תצפיות vivo 12 וכך הן רלוונטיות מאוד 5. בתצפיות באתרם פרוסות ריאה, אשר אפשרי רק עם הגישה שלנו, יתקיים ריאות נגוע זמן קצר לאחר כריתה. שלמות 3D בתהליך חיתוך מובטחת על ידי מטריקס agarose, צעד חיוני כדי לאפשר תהליך חיתוך מבוקר בדיוק של הריאה. אמנם יש צורך לקרר את הריאות explanted לתקופה קצרה כדי לאפשר התמצקות של מטריקס agarose, ניתן לחזור בתנאים פיסיולוגיים ליד עבור תאים לאחר חיתוך rewarming של הרקמה. זו מוצגת בבירור הנתונים שלנו, אשר מראים כי בתנאים אלה נויטרופילים פעילים מאוד ולהציג את מלוא הפוטנציאל שלהם כמו phagocytes זריז, אשר נחוצים פינוי יעיל של זיהום Aspergillus fumigatus. הם מפטרלים רקמת הריאה עובר דרך אפיתל מחסומים כדי להגיע לחלקים הפנימיים של alveoli פעיל יתר על כן הם תופסים נבגי פטריות 11. ממצא מרכזי של עבודה זו הייתה הופעתו של מבנים דומים מלכודות תאי נויטרופילים (סלים) של אספרגילוס האיבר הנגוע. NETS הם ממצא האחרונות מאוד של הרומן מנגנון הגנה נויטרופילים 13. עם זאת, מאז הדיווח הראשוני שלה בשנת 2004, מספר מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים או בני אדם שבו התופעה נצפתה או חסר כבר בפיצוץ הגדלת 14-16. מעניין לציין, כי כל כך הרבה עבודה כבר בילה על מבנים אלה על ידי קבוצות רבות ושונות כל כך, רוב הדיווחים הם עדיין ברמה תיאורי מאוד ולא הרבהידוע על מנגנון של שחרור NET ורגולציה שלה. עם פרוטוקול שלנו הצלחנו בפעם הראשונה כדי להראות סיבים NET בריאה נגוע. יתר על כן, אנחנו יכולים להדגים את החשיבות של נויטרופילים גייס טרי, כמו גם מבנים מולקולריים פטרייתי עבור המופע שלהם או עיכוב 11. זה מראה בבירור את הפוטנציאל של השיטה שלנו כדי לחקור את אחד השלבים של היווצרות NET ביתר פירוט. אפשר לחשוב למשל להשתמש נויטרופילים מעכברים מתאים עקום החוצה כדי לבחון את יכולתם של היווצרות NET בניסויים העברת המאמצת. לכן, למרות תצפית ישירה של העלייה נויטרופילים מן הדם ההיקפיים אינו אפשרי עם המערכת הזו בשל חוסר אספקת דם לאחר explantation איברים, אנחנו עדיין מאמינים כי פרוטוקול שלנו היא גישה יקר יחסית קל לטפל המאפשר הדמיה של צעדים מוקדם או מאוחר בהגנה החיסונית כנגד דלקות ריאה. זהו, אפוא, צעד חשוב לקראת חוקרת את התופעה בתוך הריאות בנשימה של בעלי חיים.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

לאחר העיכול, הריאות הוא השטח השני בגודלו עבור האינטראקציה בין הגוף חוליות ואיכות הסביבה. הנה, חילופי גז יעיל חייבת להישמר, ואילו באותו זמן הימנעות זיהום על ידי פתוגנים רבים כי הם נשאפים במהלך נשימה רגילה. כדי להשיג זאת, סט מעולה של אסטרטגיות ההגנה שילוב מנגנוני החיסון הלחות ואת הסלולר קיים. אחד האמצעים היעילים ביותר להגנה אקוטית של הריאות הוא גיוס של נויטרופילים, אשר גם phagocytose פתוגנים בשאיפה או להרוג אותם על ידי שחרור חומרים כימיים ציטוטוקסיות. בנוסף האחרונים לארסנל של נויטרופילים הוא לשחרר נפץ שלהם NETS תאי ה-DNA על ידי חיידקים או פטריות, אשר יכול להיתפס או מומת גם לאחר שחרור התאים NET מתו. אנו מציגים כאן שיטה המאפשרת להתבונן ישירות אחד נויטרופילים, נודדים בתוך ריאה נגועה לאחרונה, phagocytosing פתוגנים ופטריות כמו גם לדמיין את NETS נרחב שהם יצרו לאורך הרקמה הנגוע. השיטה מתארת ​​את הכנת פרוסות עבות ריאות קיימא 7 שעות לאחר ההדבקה intratracheal של עכברים עם conidia של העובש אספרגילוס fumigatus ובדיקה שלהם על ידי מיקרוסקופ ססגוניות 2-פוטון זמן לשגות. גישה זו מאפשרת לנו לחקור ישירות הגנה נגד פטריות ברקמת הריאה יליד ובכך פותח דרך חדשה עבור החקירה מפורט של חסינות ריאתי.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Views.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...