Bu makalenin genel amacı, makrofajlar ve opsonize kırmızı kan hücreleri fagositositon üç boyutlu zaman atlamalı mikroskopile görüntülenmesi için hazırlamaktır. Bu yöntem, fagositlerin parçacıkları nasıl yakalayıp yutturacağı gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, parçacık alımının gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak sağlar, daha geleneksel son nokta tahlillerinin aksine, bir parçacığın nasıl olup olmadığının değerlendirilmesi ne kadar zor, bir parçacığın yutulup yutulmadığı nasıI bir değerlendirmeye olanak sağlar.
Genellikle, bu yönteme yeni gelen bireyler hücre yalıtımı prosedürlerine alışana kadar mücadele edebilirler. Bu yöntem için ilk fikri, Fagositonisin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesi için bu konfokal mikroskopinin dönmenin avantajlarını fark ettiğimizde bulduk. Periton makrofajlarını izole etmek için, 3-4 aylık bir farenin periton içine 24 gauge plastik kateter yerleştirin ve lavaj başına kalsiyum ve magnezyum olmadan 4,5 mililitre buz gibi HBSS ile boşluğu iki kez lavajlamak için plastik beş mililitreşlik şırınga kullanın.
Aspire süspansiyonun 14 mililitrelik polipropilen yuvarlak alt tüpe aktarılması. Her iki örnek hasat edildiğinde, aspire santrifüj, ve tam bikarbonatsız RPMI 1640 orta bir mililitre periton hücreleri resuspend mililitre başına altıncı hücrelere yaklaşık altı kat 10 elde etmek için. Daha sonra, ön dolgu slaytlar bir fibronectin kaplı kanal slayt bir rezervuar için tam HEPES takviyeli orta bir mililitre ekleyin ve orta aşağı rezervuar aspire izin slayt eğim.
İstenmeyen hava kabarcıklarını gidermek için, iki rezervuardan birine bir ila iki mililitre taze ortam ekleyin ve bir rezervuar kapağını sıkıca uygulayın. Daha sonra, slayttan hava yıkayarak, gerektiğinde kaydırağı yatırmak için kapağına ritmik başparmak basıncı uygulayın. Tüm hava dışarı atıldığında, kaydırağı kapaksız ortama doğru eğin ve havanın kanala geri çekilmesini önlemek için kapağı çıkarın.
Şimdi pipet hücre çözeltisi birkaç kez kümelenme azaltmak için, ve karbondioksit yokluğunda 37 santigrat derece nemli bir odada iki saatlik kuluçka için slayt bir kanal içine hücrelerin 100 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda sadece gösterildiği gibi tam bikarbonat takviyeli orta ile her slaytta orta içeren HEPES değiştirin. Sonra bir gecede kültür için% 5 karbondioksit ile 37 derece nemli inkübatör hücreleri yerleştirin.
Ertesi sabah iki mililitre yuvarlak alt polipropilen mikrosantrifüj tüp içine taze elde edilen sağlıklı donör kan bir mililitre transfer. O zaman örneği santrifüj edin. Supernatant içeren plazma ve buffy ceket çıkarın.
Ve dikkatle tam HEPES takviyeli orta 100 mikrolitre içeren iki mililitre mircocentrifuge tüp içine tortulanmış kırmızı kan hücrelerinin 100 mikrolitre aktarın. Etiket tüp 1:1 ve seyreltilmiş kırmızı kan hücrelerinin dört mikrolitre yeni bir iki mililitre mikrosantrifüj tüp tam HEPES takviyeli orta iki mililitre içeren transfer. Sonra bu tüpü 4:2000'de etiketle ve her iki seyreltilmiş kırmızı kan hücresi örnek tüpünü de buza yerleştirin.
Periton makrofajlarını etiketlemek için her kanal slaytındaki bikarbonat ortamı hepes ile takviye edilmiş komple ortamlarla değiştirin. Daha sonra, floresan etiketli fare makrofajsının 100 mikrolitresinin, slonun 100 mikrolitrelik kanalının açılmasına eklenebilmesi için, ilginin 100 mikrolitresine özel antikor eklenmesine izin vermek için kaydırağı yatırın. Akıntı rezervuarına akan ortamı aspire edin ve karbondioksit yokluğunda 37 derecede nemli bir odada hücreleri 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Periton hücreleri yavaşça 4:2000 kırmızı kan hücreleri örnek karıştırın ve yeni bir iki mililitre mikrocentrifuge tüp içine hücrelerin 400 mikrolitre transfer etiketli iken, yaklaşık beş ila sekiz dakika boyunca bir laminar akış kaput içinde ısıtmalı alüminyum blok içinde. Hücreler 37 dereceye ısındığında uygun bir kırmızı floresan plazma zarı lekesinin 0,4 mikrolitresini hücrelerle karıştırın. Sonra hücreleri ısı bloğuna geri yerleştirin.
Beş dakika sonra taze HEPES 1.6 mililitre ekleyerek hücreleri yıkayın tam orta ve santrifüj takviye. Kırmızı kan hücresi pelet tanımlamak için tüp döndürün. Bir ila 1,5 mililitrelik pipet ucu kullanarak dikkatle pelet rahatsız etmeden iki cilt içinde supernatant kaldırmak ve taze HEPES 2000 mikrolitre karışımı hücreleri ile tam orta takviye.
Santrifüj ve orta 400 mikrolitre pelet yeniden askıya. Daha sonra Plazma Membran Lekesi için tüp PMS etiket. 20 dakikalık periton hücre etiketleme kuluçka sonunda taze tam HEPES takviyeli orta bir mililitre ile slayt yıkayın.
Kırmızı kan hücrelerini opsonize etmek için PMS örnek tüp fare IGG2B monoklonal anti insan CD235A antikor bir mikrolitre ekleyin. Dakikada bir karıştırma ile 37 derece santigrat sekiz dakika sonra transfer 100 plazma membran lekeli IGG kanal slayt içeren periton makrofaj insan kırmızı kan hücreleri opsonized. En kısa sürede insan kırmızı kan hücreleri eklendi bir dönen disk konfokal mikroskobu üzerinde slayt monte edin.
Sahne kuluçka makinesi ile 37 santigrat derece ye ayarlanır ve hemen hücreleri görüntüleme başlar. Kırmızı floresan insan kırmızı kan hücreleri ile sunulan yeşil floresan makrofajların zaman atlamalı 3D görüntüleme tek parçacık fagositik olayların görüntülenmesi sağlar. Örneğin, bir fare IGG bir makrofaj filopodium tarafından insan kırmızı kan hücresi opsonized yakalama görülebilir.
Yanı sıra, fagositik fincan oluşumu sırasında bir insan kırmızı kan hücresi sıkma. Bu videoyu izledikten sonra fare yerleşik periton makrofajları, floresan etiketli hücreler ve opsonize parçacıklar izole etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
