著者らは、メソッドの開発中に有用な議論とコメントを慎重に原稿を読むための生体内ムービー、ドクタージョナサンLindquistさん、そしてGunzerの研究室のすべてのメンバーを最適化するとヘルプは博士ラースPhilipsenに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術振興（DFG、SFB 854）からMGへの補助金によって賄われていた

1。感染症<ol><li>金型アスペルギルスフミ （株ATCC 46645）の腫れ分生子は、5％FCS（v / v）で添加したRPMI 1640（Biochrom AG、ベルリン、ドイツ）でのプレインキュベーションによって生成されます。 2 × 10 7安静時の分生子を5 mlの培地に再懸濁し、6ウェル組織培養プレート（TPP AG、Trasadingen、スイス、カタログ＃92006）でインキュベートされている37 7H ° Cの</li><li> 6ウェルにも含まれている各アスペルギルスに、腫れ期間の後、胞子は、蛍光calcofluor白のストック溶液（DMSOに[25 mg / mlの]シグマアルドリッチ、Deisenhofen、ドイツ、カタログ＃F3543）の10μlを添加することにより表示されていますプレート、50μg/ mlのRPMIの最終calcofluor濃度に達する。穏やかに混合に続いて、胞子は37℃でさらに15分間インキュベートする</li><li>次のステップでは、胞子を70μmのセルストレーナー（BD Biosciences社、ハイデルベルグ、ドイツ）を通して濾過することにより収穫されます。 10ミリリットルのPBS（室温で5分間900xgで遠心）で1回洗浄した後ペレットを2 mlのPBSとノイチャンバーでカウントすることによって決定腫れ分生子の総数に再懸濁されている。最後に、胞子懸濁液を室温で5分間900xgで停止している、上清を注意深く除去し、ペレットは100μlのPBSあたり1x107胞子の最終濃度に再懸濁される。 </li><li>感染症の場合は、胞子溶液100μlを雌マウス（8-10週齢C57/BL6、、ハーラン、ドイツ）に気管内に適用されます。好中球は、同様に観察される場合は、リゾチームのプロモーター1でEGFPを運ぶのLys - EGFPマウスの使用は、推奨されます。 150μlのケタミン/ Rompunソリューションの単一のIP注射で動物を麻酔することから始めます（Inresa Arzneimittel GmbHは、フライブルク、ドイツ（ケタミン）とバイエルバイタル社、レバークーゼン、ドイツ（Rompun）、1mlのケタミン[50 mg / mlの] + 0.5ミリリットルRompun [2％] + 3.5 mlの滅菌塩化ナトリウム[0.9％]）。 5分後に麻酔マウスは、挿管（補足の図1）を容易にするためにランプ（すなわち傾斜面）に、その歯によってゴムバンドで固定することができます。鉗子を使用して、舌が片側に引っ張られていると22G留置静脈カテーテル（B. BraunはAG、メルズンゲン、ドイツ、Vasofix Braunüleは）穏やかにガチョウの首のランプで恒久的な照明の下で気管に挿入することができます。カテーテルの挿入が成功したことは、人工呼吸器の周波数を持つ動物の胸郭の定期的な運動を観察することによって検証されます。成功した挿管が確認されているときは、100μlの胞子懸濁液を100μlのマイクロピペットを用いて適用されます。このボリュームは1〜2秒の任意の追加の助けなしに動物が吸入してください肺内部の真菌の粒子の強化された分布は、機械的に毎分250回の呼吸の速度と300の吸入量で小動物の呼吸（MiniVent、ヒューゴサックス、3月Hugstetten、ドイツ）で2分間感染動物を換気することによって達成される息当たりμL（補足の図2）。後に感染動物はそれらのケージに戻され、再び外来まで、5分ごとに観察される。マウスは、以下の潜伏期間中の痛みや苦痛の証拠を示していない。 </li></ol> 2。肺の準備<ol><li>動きと呼吸が30秒以上止まっているまで、胞子感染後7時間は、動物はイソフルランの過剰摂取（バクスター社、Unterschleiβheim、ドイツ）により安楽死されています。これは、その後、臨床死を確保し、気管や肺の可視化とアクセスを可能にするために二次的方法として、開胸が続いている。その後、胸は慎重に肺や上気道を公開するために開かれます。その後、別の22G留置静脈カテーテルは、露出喉頭蓋から始まる気管に挿入されます。この細管を通って肺を、1ml Omnifix注射器（B. Braunの）を使用して1ミリリットル予め温めておいた低融点アガロース（2％w / vの、プロメガ社、マンハイム、ドイツ）で満たされている。とすぐに肺が満たされるように気管が縫製糸の短い断片をオフに固定されており、全体の動物は、4℃で冷蔵庫に入れている℃を</li><li> 15分後、アガロースが固化したときに、全体の肺は気管から始まる切り出される。先の尖ったハサミを使用して、右肺の葉がその後削除され、底面は簡単にティッシュペーパーのシート上に乾燥させ、その後全体の葉は、ビブラトーム（カムデンインスツルメンツ、英国、752M Vibrosliceの準備のブロックに糊付けされています）固定（カールロート社、カールスルーエ、ドイツ、ロティ-コル1）のための組織接着剤を一滴も使わず。 1分後にブロックは、あらかじめ冷却（4℃）PBSで満たされているビブラトーム、のカッティングチャンバにインストールされています。ビブラトームは、ミッドレンジの振動（最大10のうち5。）及びそのようなの水平断面その程度の速度（最大10のうち5。）に設定されています肺が生成されます。オルガンの上半分は、それが並列ナイロンスレッドのセットで覆われている自作のフラットワッシャー（1センチメートル内径）、で反転して固定されている小さなプラスチック製のペトリ皿（5 cmの直径）に転送されます離れてそれぞれの1ミリメートル（補足図3）。最後に、ペトリ皿を10 mlのPBSで5μMの最終色素濃度で得られたDNA色素SYTOXオレンジ[5 mMの]（Invitrogen社製、ドイツ）の10μlを添加したが充填されている。 </li></ol> 3。 2光子レーザー顕微鏡<ol><li>肺のサンプルを含むペトリ皿は、バッファが℃の温度センサー制御ヒーター（補足の図4）で37に温めることができるように顕微鏡対物レンズの下にインストールされています。 2光子顕微鏡は、20xNA1.0水浸レンズ（ツァイス、イエナ、ドイツ）を装備した直立アクシオ審査の段階でツァイスLSM 710 NLO顕微鏡を使用して全体の切断面を介して行われます。イメージングのために、セクションに沿って別のエリアが緑（530 nm）と赤色（580 nm）の蛍光だけでなく、第二高調波発生（SHG）信号と検出800nm​​の照明波長を用いて400μmの深さにダウンスキャンされます外部非デスキャン検出器（NDD）と青calcofluor蛍光（400〜470 nmの発光時）。 2次元画像とタイムラプスムービー（1画像ごとに5〜10秒）に加えて、単一または反復的な3次元画像のスタックは、その後使用してボクセルレンダリングまたは単一の拡張焦点画像や4次元のデータ（時間をかけて3D）としてレンダリングすることができます別のソフトウェアパッケージ。この顕微鏡のセットアップでは、それが空気中の病原体のさまざまなエントリのポートを構成すると、膨大な免疫学的関連性のある、ほぼそのままの環境での細胞挙動の観察を可能にします。金型アスペルギルスフミと感染後の内因性好中球による細胞運動、食作用と純生産量は簡単にその場の状況でこれらの下で調べることができます。 </li></ol> 4。代表的な結果または3色のスライドやムービー - 行われている場合は、適切に画像処理は2が生成されます。色づけは後処理の手順で行われるため、自由に適応可能なされていますが、我々は一般的に相対的なチャネルで検出される染料/信号の自然な色を、反映したカラースキームを選択します。現在、EGFP -標識細胞が緑色に染色されている場合このように、SYTOX染料が赤色で描かれ、真菌だけでなく、SHG信号は、青で表示しています。最初の例では（図1）青色SHG信号は、組織の非感染肺の繊維と赤SYTOX信号が肺常駐細胞の核が生成されるビブラトームで開いているカットを示しています。両方、肺胞の構造と同様に真菌塊が、青色で表示される場所核とネットが赤色染色されている間、2番目の例（図2）に感染した肺は、示されている。第三の例（図3）は青と赤の構造に加えて、緑色の好中球も見ることができるのLys - EGFPトランスジェニック動物からのものです。好中球と時間経過のシーケンス内の個々の真菌要素の彼らの食作用の移行は、補足的な映画の中で示されています。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 2色2光子顕微鏡の非感染性肺スライスの外観。肺のスライスは、非感染C57/BL6マウスから調製し、プロトコールに記載のように画像化した。ここで紹介するが、肺胞組織の構造（）のSHG信号である、細胞核のSYTOX信号は、肺のスライス（B）、および2つのチャンネル（C）のオーバーレイの準備中に開いてカット。 （C）の箱入りの領域は（D）に拡大して見られている。上記のように肺の呼吸活性領域内で明確に肺組織に比べて肺のスライスの下部に線維組織に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 2色2光子顕微鏡におけるアスペルギルス感染した野生型の動物の肺のスライスの外観。A.との前に7時間を感染C57/BL6マウスから肺のスライスフミは準備とプロトコルで説明されているように画像化した。示されているのは複合菌の構造とSHGの肺胞組織の（）、DNAのNETSのSYTOX信号だけでなく、細胞核が肺のスライス（B）の準備中に、オープンカット、そして二つのチャンネルの重ね合わせ（C）です。 。 （C）の箱入りの領域は（D）に拡大して見られている。注意してください、はっきりと明確な真菌塊の区域、肺胞、およびNET -構造はそれぞれ、文字F、及びNでマークされます。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 3色2光子顕微鏡におけるアスペルギルス感染のLys - EGFPの動物の肺のスライスの外観。と前のLys - EGFPマウスに感染した7時間の肺のスライスA.フミを用意し、プロトコルで説明されているように画像化した。示されているのは複合菌の構造とSHG肺胞組織の（青）、細胞核とNETS（赤）のSYTOX信号だけでなく、同​​様に多数の好中球（緑）です。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="図4" /> 補足図1。挿管のためのマウスの固定は。ケタミン/ Rompun麻酔下で動物が22G留置静脈カテーテルを挿管を容易にするために、その歯でゴムバンドで固定されています。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="図5" /> 補足図2。機械式マウスの換気。挿管マウスは100μlのPBSに再懸濁した1 × 10 7胞子のITアプリケーションに感染している。肺内部の真菌の粒子の強化された分布は、機械的に小動物の呼吸に感染したマウスを換気することによって達成される。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="図6" /> 補足の図3。肺葉の固定。右肺の葉の調製後の臓器は、並列ナイロンスレッドのセットで覆われている実験室で作られた平ワッシャを使用してシャーレに固定されています。 <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="図6" /> 補足の図4。 2光子イメージングセットアップ。右肺の葉を含むペトリ皿は、DNA色素SYTOXオレンジの添加後、2光子顕微鏡下で加熱マットの上にインストールされています。 補足映画：。菌感染後の生活の肺スライス7時間の2光子顕微鏡タイムラプスで見られるように移行し、 アスペルギルス感染した肺に真菌要素を貪食好中球好中球は緑、真菌要素であり、SHGは青であり、そして細胞の核としてだけでなく、NET -構造は赤で描かれている。実験の実時間は右下に表示されます。スケールバーは50μmを示しています。 <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">ビデオを見るためにここをクリック</a>

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	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

in vivoでまたは無傷の臓器のリアルタイム2光子顕微鏡は、過去10年間の免疫細胞の生理機能を扱う研究で深遠な重要性を増している。それはリンパ節内T細胞活性化の動力学のような重要なイベントは、最初の2から4まで見えるようになったというこの技法を使用していました。さらに最近では、研究者はまた、このアプローチ5を使用してリンパ組織におけるエフェクター細胞の世代の最初のステップのような特定の細胞機能を解析し始めている。 しかし、新たな生物学的概念の数がこのメソッドを使って明らかにされているが、生体内可視化の研究はこれまでに公開されていないいる挑戦的かつ重要な疑問が残っています。特にこれは、哺乳類の肺に適用されます。このオルガンの興味深い側面は、空気中の病原体のさまざまなエントリポートとして、その免疫学的プロセスは、哺乳類の体内で行われる最も重要な面の一つです。全体の寿命上のすべての息をして、不要な粒子は、感染症6生命を脅かすを誘発する可能性を持っているそのうちの一部を吸入している。それはそのような敏感な、絶滅の危機にあるサイトでの防御機構のタイトなネットワークは、免疫応答の全体のレパートリーを示す存在している必要があることは自明です。一方、そのような&quot;汚い&quot;場所での潜在的な病原体に対する誘導免疫の戦いが厳密に制御されていることは非常に重要です。免疫系の誇張反応は大規模な非特異的免疫細胞のアクション7,8の刺激により臓器組織を傷つけることによって自分の身体を傷つけるの高いリスクを負うものとします。 これらの思考に照らして、それはin vivo条件下で真の下で哺乳類の肺の細胞の挙動を調査する可能性を持っている非常に興味深いと役に立つでしょう。しかし、そのようなシステムはこれまで正常に機能してプロトコルを設定するには解決しなければならない大きな困難に明確にポイントを実装されていないという事実。最も要求の厳しい課題は、おそらくフォーカス安定性です。呼吸の責任臓器として肺に吸入を実現するためのスペースの3つすべての方向に一定の動きの下です。単独でこのような状況は、深刻なイメージングの問題が発生し、生体内イメージャ&quot;悪夢&quot;と考えることができます。すでに空間内の任意の次元へのわずかな動きでは意味のある画像9を生成するために、マイクロメートルの精度で安定するように必要な顕微鏡視野、上に大規模な悪化の影響を持っています。その本質的にタイトなローカル焦点を与えられた10、2光子顕微鏡は、焦点不安定性にさらに敏感であるZ方向のわずか数マイクロメートルの範囲内の特定の構造の転位として焦点の完全な損失に相当するためです。失敗した実験。 マウス肺内免疫細胞の観察のために本研究で提示プロトコルは、機能的に無傷の肺11内の事態にも、in vivoでのアプリケーションではなく、近似値ではありません。植リンパの例イメージングリンパ球のex vivoでのアプローチは、ノードは、12とこうして5関連性の高い生体観察で trueに相当する結果が得られることが示されている。我々のアプローチでのみ可能な肺のスライス、のその場観察で 、すぐに切除後の感染肺で行われる。切削加工時の3Dの整合性はアガロースマトリックス、肺の正確に制御切削加工を可能にするために不可欠なステップによって保証されています。それは、アガロースマトリックスの凝固を可能にするために、短い期間のための植肺を冷却する必要があるが、それは組織の切断および復温後の細胞のために近い生理的条件に戻すことが可能です。これは、明らかにこれらの条件下では好中球は非常にアクティブで、 アスペルギルスフミの感染症の効果的なクリアランスのために必要な機敏な食、など、その可能性を最大限に発揮することを示している我々のデータによって示されています。彼らは、肺胞の内側の部分に到達するために上皮障壁を通過する肺組織を巡回し、さらに、彼らは積極的に真菌の胞子11を取る。この作品の鍵の発見は、 アスペルギルス感染臓器に好中球細胞外トラップ（NETS）に似た構造の出現だった。 NETSは、好中球13の新たな防御機構の非常に最近の発見です。しかし、2004年の最初の記述以来、この現象が観察されているか、または欠けている動物モデルやヒトの生理学的または病理学的状態の数が爆発的に14-16に増加している。興味深いことに、そんなに作業が非常に多くの異なるグループによってこれらの構造に費やされているものの、ほとんどのレポートは非​​常に説明的なレベルで残っているため、あまりです。NETのリリースとその調節のメカニズムについては知られています。我々のプロトコルで我々は、感染した肺でNET繊維を表示するために初めてできた。さらに、我々は、その発生または阻害11のたて募集好中球と同様に分子の真菌の構造の重要性を実証することができます。これは明らかに、より詳細にNET形成の一つのステップを調査する手法の可能性を示しています。一つは、養子移入実験でNET形成の能力を観察するためにノックアウト適したマウスから好中球を使用する例については考えることができます。 このように、末梢血から好中球移民の直接観察が臓器植後の血液供給の不足のため、このシステムでは不可能ですが、我々はまだ我々のプロトコルが貴重とのイメージングを可能にするアプローチを処理することは比較的容易であると信じています肺の感染症に対する免疫防御の早朝または深夜のステップ。これは、したがって、生きている動物の呼吸の肺内でこの現象を調査するための重要な一歩です。

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

消化管の後に、肺は脊椎動物の身体と環境との相互作用のための二番目に大きい面である。同時に、正常な呼吸時に吸入されている複数の病原体による感染を回避しながら、ここで、効果的なガス交換は、維持されなければならない。これを達成するために、体液性および細胞性免疫の仕組みの組み合わせ防衛戦略の見事なセットが存在する。肺の急性防衛のための最も効果的な対策の一つは、吸入病原体を貪食や細胞毒性化学物質を放出することによって、それらを殺す好中球の動員、です。好中球の武器に最近追加された細菌やカビがキャッチまたはNET放出する細胞が死んだ後であっても不活性化できるようにするための細胞外DNA - NETSの彼らの爆発的なリリースです。我々は、彼らが感染組織全体で生産されていることを豊富なNETSを視覚化するだけでなく、真菌病原体を貪食、最近感染した肺内移行は、ここには直接好中球を観察できるようにする方法を提示する。方法は、7時間金型アスペルギルスフミと多色タイムラプス2光子顕微鏡によるその審査の分生子を有するマウスの気管内感染後に厚い実行可能な肺のスライスの準備について説明します。このアプローチは、直接ネイティブの肺組織における抗真菌防御を調査することができますので、肺の免疫の詳細な調査のための新しい道を開きます。

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K ビュー.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. 我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。

ビデオ: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

免疫・感染学

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

の分離<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em磁気手段によって&gt;後期感染赤血球

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...