Samuel Shepard, Peter Bazeley, John David Bell ve Genomik MR web sayfalarının yönetimi için müteşekkiriz. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Kariyer ödülü &quot;intron hücresel rolleri İncelenmesi&quot; tarafından desteklenen hibe MCB-0643542].

Perl kullanarak kağıt kullanılan tüm programlar yazılmıştır, ve tüm web sayfaları PHP kullanılarak oluşturulan edilmiştir. 1. Başlangıç ​​Noktası: Http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri / online Genomik MR paketinin ana sayfa açın. Web kaynakları da, &quot;Yardım (How-to/README)&quot; bağlantısını Genomik MR ve benzeri algoritmalar tüm malzemeleri &quot;ilgili kaynaklara bağlantılar&quot; bölümünde listelenen ise bağlantı, programları ile ilgili talimatlar / açıklamalar sağlar. 2. Hazırlık ve Giriş Sırası (ler) yükleniyor. GMRI analiz oturumu başlatmak için FASTA biçimlendirilmiş dizisi (ler) ile bir dosya oluşturun. Bu dizinin kısa bir açıklama ile aynı hat üzerinde bir tanımlayıcı temsil eden &quot;&gt;&quot; karakteri ile başlayan tek bir satır ile bu formatı her nükleotid dizisi öncesinde olmalıdır. GMRI analizi için DNA dizisi, R, Y, N, X, vb Hwever, non-A, T, C gibi karakterlere izin vermektedir, G karakterleri program tarafından işlenecek ve atlanır. Tekrarlayan elemanlarla (&quot;K&quot; lar yerine) &quot;maskeli&quot; hangi dizileri girdi olarak kullanılabilir. Dizisi karakterler büyük küçük harf duyarsız olduğunu unutmayın. <ol><li> Genomik MR ana sayfasında &quot;Başlat veya Devam et&quot; düğmesine tıklayarak bir GMRI oturumu başlayın. Bu nükleotid dizileri yüklenen bir sayfa için kullanıcı alır. </li><li> FASTA biçimlendirilmiş dizileri Kopyala-yapıştır veya &quot;dosya seçin&quot; düğmesini kullanarak yerel bilgisayar dizileri içeren bir dosya yükleyin. </li><li> &quot;Bu dosya ile yeni bir oturum başlatın&quot; düğmesine tıklayın. Bir onay mesajı girişi penceresinin üstündeki &quot;dizisi başarıyla yüklendi&quot; ve ayrıca bir alfanümerik &quot;GMRI tanımlayıcı&quot; sitesi bir &quot;oturum etiketi&quot; olarak adlandırdığı] oturumu için (örneğin b16yMj) almalısınız belirten görünmelidir İlk kullanımdan sonra iki hafta kadar bir oturum almak ve devam etmek için kullanılabilir. </li></ol> NOT: Bundan sonra giriş dizileri &quot;dosya&quot; olarak adlandırılır. 3. Giriş Diziler (isteğe bağlı) Oligonükleotid Frekans Dağılımı alın. &quot;SRI Analyzer&quot; sekmesine (üst satır) giriş dizilerinin tüm oligonükleotit frekansları bir dağıtım almak için tıklayın. İngilizce&#39;deki SRI, kısa mesafeli homojen duruyor. Bu noktada, kullanıcı frekansları hesaplanmış olacak oligonükleotidler en yüksek uzunluğu (9 nükleotidler 2, varsayılan 6 NTS) belirtebilirsiniz. Bu seçim, &quot;Maksimum oligomer boyutu&quot; liste kutusunun içinde istediğiniz seçeneği tıklayarak yapılır . Sonra hesaplama başlatmak için &quot;Dosya Analyze&quot; butonuna basın. Kaba bir temsil giriş sırası kompozisyon hemen bu web sayfasının ortasında kısa bir tablo olarak görünür ve &quot;userfile.comp.tbl&quot; olarak indirilebilir. Bu tablo, sadece giriş dizileri içinde en çok ve en bol oligonükleotidler temsil eder. &quot;Download kompozisyon dosyası&quot; linki ile elde edilebilir &quot;userfile.comp&quot; adlı bir dosya olarak, tüm olası oligonükleotidler tüm frekans tablosu oluşturulur . NOT: SRI analizörü tüm örtüşen oligonükleotidler kümesinin tamamını sayar. 4. Rastgele Diziler Giriş Diziler (isteğe bağlı) olduğu gibi aynı Oligonükleotid kompozisyon oluşturun. (Bu görev için gerekli protokolün 3. adımı tamamlanması). <ol><li> &quot;SRI Jeneratör&quot; sekmesinde (üst satır) rastgele dizileri oluşturan yeni bir web sayfası açmak için tıklayın. Rastgele dizileri bu web sayfasında liste kutusunu kullanarak elde edilecek örneklerin sayısını seçin. Bu örnek dosyaların her biri, &quot;dosya&quot; giriş dizileri olarak aynı sayıda ve uzunluğu rastgele dizileri içerecektir. Ayrıca, bir giriş sırası içeriyorsa, non-A, T, C veya G karakterleri, rastgele bir dizi giriş sırası gibi tam olarak aynı pozisyonlarda &quot;K&quot; lar var. </li><li> Frekansları rastgele dizileri yaklaşık olacağı oligonükleotidler uzun süresini seçin. Bu ekranın merkezinde tabloda istenen oligomer düzeyi (örneğin dört-baz oligonükleotidler için &quot;4-mers&quot;) için radyo düğmesini kontrol seçilebilir. Bu rastgele dizileri giriş dizileri olarak seçilen oligomer düzeyde yaklaşık frekansları, ama aynı zamanda kısa oligomer seviyelerine karşılık gelen frekansları değil, sadece oluşacak burada not edilmelidir. Oligonükleotid küçük dalgalanmalargiriş ve rastgele dizileri frekansları Markov Model rastgele dizilerinin üretimi için uygulanan prosedür nedeniyle mümkündür. </li><li> &quot;Dosya oluşturun&quot; düğmesine tıklayarak programı başlatın. Giriş dizileri büyükse rasgele dizileri oluşturmak için bir kaç dakika sürebilir. Böylece, bu sayfanın en altındaki mavi &quot;İndir&quot; bağlantıları ortaya çıkıncaya kadar bir kullanıcı beklemeniz gerekir. Rastgele setleri gibi, &quot;X rasgele set sayısı ve Y seçilen oligomer düzeyi (örneğin&quot; userfile_rand2_4 &quot;) userfile.randX_Y&quot; gibi adlar ile dosya yerleştirilir . </li></ol> 5. Analizi (MRG), Giriş ve Rastgele Diziler Orta sınıf İnhomojenlik. <ol><li> Nükleotid dizilerinin kompozisyon orta menzilli homojen analiz eden yeni bir web sayfası açılır &quot;MRI Analyzer&quot; sekmesine (üst satır) üzerine tıklayın. </li><li> Analiz etmek liste kutusu (giriş sırası ve rastgele dizileri oluşturulan setleri arasında bir tercih yapılabilir) &quot;Dosya&quot;, analiz edilmesi için bir dizi seçin. </li><li> MRG sağlanan liste kutusu üzerinden analiz edilmesi gereken içerik türünü seçin. (Yedi içerik seçenekler mevcuttur: G + C, G + A, G + T, A, G, C veya T.) </li><li> &quot;Pencere boyutu&quot; liste kutusunda (geçerli aralık 30 - 1000 varsayılan 50 nükleotidler) ile, içerik ve zengin içerik-fakir dizileri ele alınacak olan pencerenin uzunluğu seçin . </li><li> , Içerik ve zengin içerik-fakir bölgeler için üst eşik ve alt eşik, sırasıyla seçin . Bu eşikler penceresinde Geçerli pencereyi Özellikle nükleotidlerin tam sayısı (liste kutusunda numara seçeneği kullanarak) ya da bu nükleotidlerin yüzdesi ile tanımlanabilir (yüzde seçeneği kullanarak) </li><li> Beş seçenek (örneğin: İçerik = GC; Pencere boyutu = 50; Üst eşik = 35; Sıra = &quot;dosya&quot; Alt eşik = 15) yapıldıktan sonra, Dosya düğmesine analiz basarak programı başlatın. Program, seçilen giriş tüm dizileri art arda tarar. Her adımda belirtilen pencere boyutu eşit uzunlukta mevcut sıra bir segment alır ve seçilen içerik nükleotidlerin sayısı ya da yüzde, üst eşiğin üstünde veya alt eşik değerinin altında olup olmadığını hesaplar. Pencere ya kriterlere uygun değilse, bir sonraki üst üste pencere (nükleotid biri tarafından kaydırılır) aynı analizi için seçilir. Dizisi içerik açısından zengin veya fakir kompozisyon için eşik gereksinimleri bir birleştiği yerde bir pencere bulunduğunda, programın çıktı dosyasının sırası bu pencere kaydeder ve grafik çıkışında bir başak oluşturur. Bundan sonra, program bir sonraki örtüşmeyen bitişik pencerede atlar ve Dizinin sonuna ulaşana kadar tarama süreci devam eder. </li><li> Programın tamamlanmasından sonra, çıktı dosyasının bir bağlantı (isim &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; Yukarıdaki örnek için) görünür ve sonuçlarının grafiksel gösterimi (bkz. Şekil 1) web sayfasının ortasında görüntülenir. Aşağıda gösterildiği kilobases uzunluğu (kb), bu grafik ekran userfile tüm giriş dizileri tek bir dize halinde birleştirilmiş ve X ekseni üzerinde yatay bir siyah çizgi olarak sunulmuştur. Giriş dizileri boyunca tüm içerik bakımından zengin bölgeler mavi &quot;yukarı&quot; sivri ve kırmızı &quot;aşağı&quot; ani olarak içerik fakir bölgeler olarak işaretlenmiş. , Içerik ve zengin içerik-fakir pencereleri sayıların toplamı, bu rakamın altındaki efsanesi (sırasıyla 32 ve 19), parenthses gösterilmiştir. Bu rakam, göreceli bolluk ve MRI bölgelerin düzenleme göstermek için hizmet vermektedir. Bu arada, belirli ayrıntıları çıktı dosyası (bkz. Şekil 3) sunulmuştur. Bu dosyada, içerik bakımından zengin veya fakir kriterler ve koordinatları eşleşen tüm nükleotid dizisi bölümleri boyunca üst üste pozisyonlara girdi dosyası göre bir liste olarak bir kullanıcı için mevcuttur. </li><li> MR tetkikinde seçilen dizisi tamamlandıktan sonra aynı web sayfasında bir kullanıcı parametreleri ve / veya girdi dosyaları değişiklikler yaparak yeni bir süreç başlayabilir. Örneğin, aynı MR parametreleri ile daha önce oluşturulan rastgele örnekleme # 1 incelemek için kullanıcı sadece seçeneği analiz etmek ve &quot;userfile_rand1_4&quot; dosyasını seçmek için Dosya değişiklik ihtiyacı var, ve sonra tekrar analiz Dosya düğmesine basın. Yeni bir dosya ve grafik ekran, eskisinin yerini alacak. TÜM sınavların sonuçları ve rakamlar her &quot;oturumunda etikel&quot; (GMRI tanımlayıcı) altında kaydedilir ve son etkinlik iki hafta kullanılabilir olacaktır. Sonuçları / incir kaydetmek içinures kalıcı olarak kullanıcı &quot;Dosyaları&quot; sekmesinde (üst satır) seçin ve bütün oturum ya da gerektiği gibi dosyaları tek tek indirmek gerekir . </li><li> Bu MR Analyzer web sayfası ile bir kullanıcı çalışma <ul><li> (G + C), zengin ve (A + T) zengin bölgeler </li><li> Pürin (A + G) zengin ve pirimidin (C + T) zengin bölgelerinden </li><li> Keto (G + T) ve amino zengin (A + C) zengin bölgelerinden </li><li> A ve A-fakir, zengin bölgelerde </li><li> G-zengin ve G-fakir bölgelerde </li><li> T-zengin ve T-fakir bölgelerde </li><li> C-zengin ve C-fakir bölgelerinden </li></ul></li><li> Genomik MR son sürümü Pürin (R) / Pirimidin zengin bölgelerinden çalışmak için yeni bir seçenek (Y) Z-DNA konformasyonlar oluşturabilecek arda desenler. Şu anda, bu seçenek &quot;Z-DNA&quot; linki mevcuttur ve diğer söz konusu MRG bölge olarak aynı temel üzerinde çalışır. Bir kullanıcı (RY + YR) sayısı için alt ve üst eşikleri seçmelisiniz tarama penceresinde üst üste dinükleotidleri. Program benzer bir grafik çıktı ve pürin ve pirimidin alternatif ile zenginleştirilmiş ve tüketilmiş DNA segmentlerinin bir dosya üretir. Varsayılan Z-DNA bölgeleri yüksek (inceleme F &amp; F 2011), R / Y üsleri alternatif ile zenginleştirilmiş olmalıdır. </li></ol> 6. Genomik MR Paketi (isteğe bağlı) içinde Ek Programlar. Genomik MR kaynak, aynı zamanda çok özel bir rastgele dizileri nesil için iki gelişmiş seçenekler vardır. Onlar, &quot;MR Jeneratör&quot; ve en üst satırındaki &quot;CDS Jeneratör&quot; sekme mevcuttur . <ol><li> MRG jeneratör girdi dosyası aynı oligonükleotid bileşimi (SRI jeneratör benzer) ile randomize dizileri oluşturur. Ancak, ek olarak, randomize dizileri, kullanıcı tarafından belirlenen belirli bir MR desen taklit eder. Bu web sayfası içinde bir kullanıcı bir liste kutusunda, belirli bir taklit eden bir MR desen belirtmelisiniz. Liste kutusunda Bu oturumda MRG analizörü (örn. &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;) tarafından incelenmiş olan tüm desenleri içerir. Bu seçenek ile oluşturulan rasgele bir sıra seçilen giriş dosyası olarak aynı oligonükleotid kompozisyon ve &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; de görüldüğü gibi ve kötü desen de aynı GC-zengin olacaktır. </li><li> CDS jeneratör protein kodlayan dizileri randomizasyon için kullanılır. Bu, kullanıcı tarafından belirlenen giriş kodlu biri olarak aynı amino asit dizilimine korur. Buna ek olarak, program, kullanıcı tarafından seçilen giriş tabloda belirtildiği gibi aynı kodon ve di-kodon önyargıları korur. CDS jeneratör online versiyonu, bir protein dizisi de girdi olarak kabul eder . Program için sadece ana Genomik MR web sayfasından indirmek için mevcut stand-alone Perl scriptleri ile diğer tüm seçenekler sunulmaktadır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol, bir kullanıcı, kompozisyon nükleotid dizilerinin homojen dersleri veriyor. Daha da önemlisi, aynı zamanda giriş dizilerinin yaklaşık bir oligonükleotid bileşimi ile çeşitli randomize dizilerinin üretimi destekler. Genellikle karmaşık ökaryotlar genomik sekansları kompozisyon homojen değildir, daha ziyade, özellikle nükleotidler ile zenginleştirilmiş dizisi segmentleri karmaşık bir mozaik (örneğin, pürin açısından zengin (G + T)-zengin, (A + T) zengin temsil vb.) Bu orta sınıf ölçekli (3-10 bp) desen üst mavi kramponları ve düşük kırmızı sivri gibi içerik yoksul kesimlerin (bkz. Şekil 1 ve 2) gibi zengin içerikli segmentleri seçilen gösterir MRI analizörü grafik çıkışı görüntülendi. Tipik olarak, doğal bir sıra (Şekil 1) herhangi bir içerik açısından zengin ve içerik fakir bölgelerin sayısı aynı oligonükleotid ilgili randomize dizileri bölgeler aynı tip (Şekil 2) sayısından daha yüksek kez sipariş. bileşimi. Nükleotid kompozisyonu orta sınıf homojen olan bu dizi bölümleri kullanıcı için ilgi olabilir. Bunlar, daha fazla araştırma için Genomik MR çıktı dosyalarını mevcuttur . <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 adım 5.7 MRG analizörü grafik çıktı bir örnek. 44 insan intronların bir örnek üzerinde sonuçlar elde edilmiştir. Mavi çubuklar bu intronlar boyunca GC-zengin bölgelerde pozisyonları temsil eder. Kırmızı çubuklar GC-kötü (ya da AT-zengin) MRI bölgeleri temsil eder. Y-ekseni, belirli bir içerik türü için alt ve üst eşikleri içermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Rasgele dizisi &quot;userfile.rand1_4&quot; Şekil 2. MR analizörü çıktı. GraphiSRI jeneratör programı kullanarak rasgele oluşturulmuş bir dizisi içinde MRI cal temsili. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. MR analizörü bir metin çıktı dosyasının başında bir örnek. Programı tarafından tespit edilen tüm içerik ve zengin-fakir içerikli dizileri, en son (dördüncü) sütununda sunulmaktadır. Pencere sayısı olarak ölçülür Onların göreli konumları, ilk sütunda gösterilmiştir. Ikinci ve üçüncü sütunlarında sırasıyla, içerik ve zengin içerik-fakir bölgeler, göstergeleri.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Orta menzilli ölçeklerde homojen nükleotid bileşimi (30-1000 nükleotidler) Bölgeler karmaşık ökaryotlarda genomlarındaki haddinden ve (intergenic bölgeler, intronlar, ekzonlarının çevrilmemiş bölgelerde, tekrarlayan elemanlar) her yerde bulunabilir. Bu bölgelerde sık sık değişik DNA konformasyonlar ilişkilidir. Örneğin, purine-/pyrimidine-rich dizileri DNA triplexes (Y-DNA) oluşturmak için eğilimindedir; pürin / pirimidin bazlar alternatif dizileri Z-DNA konformasyonlar ile ilişkilidir; (G + C) zengin bölgelerde yapısal anormallikler de sergileyebilirler B- (2010 Fedorov &amp; Fedorova tarafından gözden) - DNA ve omurga bölünme eğilimli olabilir elemanı gevşemek DNA (A + T) zengin bölgelerde olağandışı bir yapı oluşturmak olabilir. Bu orta sınıf desen bazıları (örneğin, (G + T) zengin bölgeleri) pek araştırılmış ve hala kapsamlı arama ve tanıma bekliyor. Genomik MR web kaynağın temel amacı, kullanıcılara daha fazla deneysel analizi ve olası fonksiyonları araştırılması için MRG bu bölgelerin belirlenmesi yardımcı olmaktır . Bilgi MRI bölgelerin içine ve gen tahmini programlarının yeni nesil (Shepard 2010) genom fonksiyonları ve özellikleri anlayışımızı geliştirmek ve ilerletmek olabilir.

<ul><li> İnternet Bilgisayar </li><li> Inceleme için nükleotid dizilerini içeren dosyalar. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Sigara kodlama intergenic alanları intronlar ve ekzonlarının çevrilmemiş kesimleri de dahil olmak üzere karmaşık ökaryotlar, genomik bölgelerde kendi nükleotid kompozisyon derinden tesadüfi olmayan ve karmaşık bir dizi paternleri mozaik oluşur. Dizileri (örneğin, (G + T) açısından zengin, pürin açısından zengin, vb üsleri belirli bir taban veya kombinasyonu ile zenginleştirilmiştir uzunluğu 3-10 nükleotidler - Bu desen olarak adlandırılan Orta sınıf İnhomojenlik (MRG) bölgelerinde .) MR bölgeler genellikle gen ekspresyonu, rekombinasyon ve diğer genetik süreçler (2010 Fedorova &amp; Fedorov) yönetmelikte yer alışılmadık (non-B formu) DNA yapılarıyla ilişkilidir. Sırasına homojen ek azaltmak için bu genom dizilerinin işlevsellik ve önemi (Prakash ve ark 2009) destekler eğilimindedir mutasyonlar karşı MRI bölgeler içinde güçlü bir fiksasyon önyargı varlığı. Burada özgürce kullanılabilir internet kaynak göstermek - Genomik MR program paketi (. Bechtel ve ark 2008), içinde çeşitli MRG desenleri bulmak ve karakterize etmek amacıyla genom dizilerinin hesaplama analizi için tasarlanmış . Bu paket, aynı zamanda doğal giriş DNA dizilimleri için çeşitli özellikleri ve yazışma düzeyi ile randomize dizileri üretimi sağlar. Bu kaynak ana hedefi hala pek araştırılmalı ve kapsamlı arama ve tanıma bekliyor kodlamayan DNA büyük bölgelerin incelenmesi kolaylaştırmaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA at JoVE.com

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Biz genom dizilerinin analizi için genel bir hesaplama web sitesi mevcut. DNA dizisi modelleri, çeşitli tesadüfi olmayan bir nükleotid kompozisyonlar ile algılar. Bu kaynak da, farklı karmaşıklık düzeylerine sahip randomize dizileri üretir.

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Görüntüleme.  University of Toledo Health Science Campus. Biz genom dizilerinin analizi için genel bir hesaplama web sitesi mevcut. DNA dizisi modelleri, çeşitli tesadüfi olmayan bir nükleotid kompozisyonlar ile algılar. Bu kaynak da, farklı karmaşıklık düzeylerine sahip randomize dizileri üretir.

Video: Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biyoloji

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Plazma Protein Koruma Kan Alma Kitleri Genomik DNA Ayıklama Pratik ve Yeni Bir Yöntem

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.