Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki tek nükleotid polimorfizmlerini genotiplemek için kullanılabilen sentez tekniği ile bir dizilemedir. Bu yöntem, diğer sıralama yöntemlerine kıyasla uygulama kolaylığı ve maliyet etkinliği açısından avantajlıdır. Mitokondriyal DNA'daki patojenik varyantların heteroplazmi değerlerini belirleyerek bazı mitokondriyal hastalıklar için tanı yöntemi olarak kolayca kullanılabilir.
Başlamak için, genotiplendirilen türler için bir mitokondriyal DNA dizi dosyası elde edin ve tek nükleotid polimorfizminin veya SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun. SNP sahasının yukarı ve aşağı akış yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarım yazılımına yapıştırın.
Polimorfik tabanı vurgulayın, üzerine sağ tıklayın ve ardından analiz edilen SNP tabanını pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlamak için Hedef Bölgeyi Ayarla'yı seçin. Astar seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki Oynat simgesine basın ve yazılımın otomatik olarak astar üçlüsünü, şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pirozanslama makinesindeki sentez ile sıralama için üçüncü astarı oluşturmasını bekleyin. Sağ tıklayın ve tüm astar setlerini korumak için Tüm Astar Setlerini Kopyala'yı seçin.
Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın, Yeni Tahlil'i seçin, ardından alel niceleme testi şablonunu seçin. Analiz edilecek dizayı, dizileme astarının doğrudan aşağı yönündeki nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin.
Dağıtım Sırası Oluştur'a basın ve yazılımın sentez reaksiyonu ile dizilemede dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin. Kaydedin ve test için bir ad verin. Daha sonra, analiz edilecek DNA'yı mikrolitre başına 5 nanograma seyrelterek çalıştırmayı gerçekleştirin.
İlk çalıştırmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun. Daha sonra, amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 5 mikrolitre seyreltilmiş DNA ve 25 mikrolitre reaksiyondan oluşan bir ön dizileme PCR'si gerçekleştirin. Dosya kurulumunu çalıştırmak için, pirosequencer yazılımında Yeni Çalıştır'ı seçin.
Pirosequencer, bir pyrosequencing diski üzerinde tek bir dizileme kuyusunu temsil eden boş bir kare ile 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu aynı anda sıralayabilir. Bir kareye sağ tıklayıp Testi Yükle'yi seçerek tahlilleri yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.
Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu otomatik olarak ayarlayın. Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadığınız sürece çalışma modunu standart olarak ayarlayın. Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun.
Ardından çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin. Pirosequencer'ı hazırlamak için, cihazın ana dokunmatik ekranındaki temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların saat 9 pozisyonunda buluştuğundan emin olun.
USB belleği taktıktan sonra, daha önce hazırlanan çalıştırma dosyalarını yüklemek için Sırala düğmesine basın. Reaktifleri, gerektiği gibi, makinedeki ilgili enjektörlere yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin. Kuyucuklara 3 mikrolitre boncuk yükleyin ve ardından ilgili numuneye dizilenmek üzere her PCR reaksiyonunun 10 mikrolitresini yükleyin.
Numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğine dair göstergeyi arayın. Plaka tutma somununu sökün ve yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalayın.
Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Yeni oluşturulan çalıştırma dosyası USB sürücüsünde göründükten sonra, Sonucu Çalıştır dosyasına çift tıklayın.
Bu, nükleotid birleşmesi üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve ilgilenilen mitokondriyal aleli nicelleştirir. Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen renk puanlarını arayın. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı ve ardından Tam Rapor'u seçerek pirogramları ve çalıştırmanın her bir kutusundan elde edilen sonuçları içeren bir PDF dosyası oluşturun.
Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz. Bu şekilde gösterildiği gibi m. 3243A>G mutasyonu için seçilen her iki setten amplifikasyon primerleri kullanılarak bir PCR amplifikasyonunun agaroz jel elektroforezi.
Burada Het, analiz edilecek neredeyse homoplazmik m. 3243A>G örneğini belirtir. Kalibrasyon için molar standartlar kullanılarak her iki astar setinin performansının bir karşılaştırması bu şekilde gösterilmiştir.
Ölçülen değerler dikey noktalı çizgilerle gösterilir. Test edilen iki tahlilin her birinin ideal bir ölçüme ne kadar yakın olduğunu göstermek için bir X = Y doğrusal fonksiyonu görüntülenir. X eksenindeki hücre çizgilerinin adları, bu tahlil kullanılarak genotiplendirilen çeşitli cybrid klonlarının adlarıdır.
Her iki tahlil kullanılarak bilinmeyen m. 3243A>G heteroplazmisinin dört cybrid klonu üzerinde genotipleme sonuçları burada gösterilmiştir. Sıralama teknik üçlü olarak yapıldı.
Mitokondriyal çinko parmak nükleazı ile tedavi edilen hücrelerin genotipleme sonuçları, tedavi edilmemiş ve alay ile tedavi edilmiş kontroller ve sonuçları üretmek için kullanılan iki MEF hücre örneği PCR replikasından elde edilen pirogramlar ve vahşi tip genotipleme kontrolü burada gösterilmiştir. Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki çeşitli gen terapisi teknolojilerini değerlendirmek için gen terapisi deneyleri için bir okuma olarak kullanılabilir.
