Bu protokol, ultra uzun diziler üretme yeteneğimizdeki teknik boşluğu doldurur. Genomikte mevcut kısa okuma yaklaşımları ile sınırlı olan genom karmaşıklığını incelememizi sağlar. Yöntem performans, sağlamlık, çok yönlülük ve umut verici yeni uygulamalarla entegre etme potansiyeli açısından benzersizdir.
Farklı malzemeler için geçerlidir ve farklı anlık boyutlar için modüle edilebilir. Bu teknik klinik manzaradevrim başladı. Tekrar genleşme bozukluklarında tanı programı birçok mevcut eksikliklerin üstesinden gelmiştir.
Bazı nakil kayıtları daha iyi klinik sonuç için yüksek çözünürlüklü HLA-typing kullandık. Bu yöntemler, kademeli ve karmaşık yapısal varyans gibi daha önce erişilemeyen uzun menzilli bilgiler sağlar. Tek bir testte epigenetik okuma ile birleştiğinde, hassas tıp sağlayacaktır.
Birçok yeni teknikle uzun bir protokol ve son sıralamaya kadar çalışıp çalışmamasını bilmek zor. Örnekleri çalıştırmadan önce eski akış hücrelerine yükleme uygulamanızı öneririm. İşbirlikçiler, bazı tekniklerin kısa okuma yaklaşımlarına kıyasla kafa karıştırıcı olduğunu söylediler.
Özellikle, çıkarma yüksek kaliteli, yüksek molekül ağırlıklı DNA nedeniyle daha nazik. HMW DNA'sının çıkarılmasına başlamak için, ilk olarak 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre likit tampona hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini ekleyin. Sonra, üç saniye boyunca en yüksek hızda girdap.
Ve çözeltiyi 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, lysate iki mikrolitre RNS-A ekleyin. 50 mililitrelik tüpü yavaşça döndürün ve numuneyi bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, lysate fenol-kloroform-izoamyl alkol karışımı fenol tabakasının 10 mililitre ekleyin. Ve bir duman kaputunun altında 10 dakika boyunca 20 rpm bir rotator tüp koyun. Jel tüpler ile santrifüj sonra, dikkatle yeni bir 50 mililitrelik tüp içine supernatant dökün.
Daha sonra, 25 mililitre buz gibi %100 etanol ekleyin ve DNA çökene kadar tüpü elle hafifçe döndürün. Bir kanca yapmak için 20 mikrolitre ucu bükün. Kancayı kullanarak, HMW DNA'sını dikkatlice çıkar ve sıvının düşmesine izin verin.
Daha sonra, DNA'yı 40 mililitrelik %70 etanol içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve DNA'yı yıkamak için tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Mekanik kesme tabanlı kütüphaneyi hazırlamak için, önce tüm DNA'yı almak için 100 mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanın. Daha sonra şırınganın üzerine 27 kalibrelik bir iğne koyun ve tüm DNA'yı yavaşça ve yavaşça tabağa at.
29 kez tekrarlayın. Daha sonra, yeniden askıda manyetik boncuklar 143 mikrolitre ve bir tüp DNA onarım reaksiyon karışımı 143 mikrolitre ekleyin. Yavaşça karıştırmak için altı kez tüp flick ve 30 dakika boyunca 20 rpm bir rotator tüp koymak.
Tüpü 1000G'de oda sıcaklığında iki saniye boyunca santrifüj edin ve tüpü 10 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Daha sonra, tüp hala rafta yken supernatant atın. Taze hazırlanmış 400 mikrolitre ekleyin 70% etanol.
30 saniye bekleyin. Sonra da etanolçıkar. Daha sonra, 1000G'de tüpü oda sıcaklığında iki saniye santrifüj edin ve numuneyi aşağı doğru döndürün.
Tüpü manyetik rafa geri yerleştirin ve artık etanolleri çıkarın. Peleti 30 saniye boyunca havayla kurutun. Daha sonra, tüpü manyetik raftan çıkarın ve 103 mikrolitre T-E tampon ekleyin.
Daha sonra, boncukların tamponla kaplı olduğundan emin olmak için tüpü hafifçe hareket ettirin ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca rotator'a koyun. Son olarak, boncuk pelet için 10 dakika boyunca manyetik raf üzerinde tüp geri yerleştirin. Eluate'nin 100 mikrolitresini 0,2 mililitrelik bir tüpe aktarmak için P200 geniş delik ucu kullanın ve dA kuyruklu ve adaptör ligasyon reaksiyonlarını onarmaya devam edin.
Transposaz parçalanma tabanlı kütüphaneyi hazırlamak için, ilk olarak 0,2 mililitrelik bir tüpe 22 mikrolitre HMW DNA, 10 milimolar Triss, pH 8 mikrolitresi ve %0.02 Triton X-100 ile 1 mikrolitre parçalama karışımı ekleyerek DNA etiketleme reaksiyonu yapın. Daha sonra, reaksiyonu altı kez karıştırmak için P200 geniş delik ucu kullanın ve bir dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçka, bir dakika boyunca 80 santigrat derece takip. Dört santigrat derecede tutun.
Son olarak, 1,5 mililitrelik bir tüpe reaksiyon aktarmak ve hızlı bir şekilde 1 mikrolitre hızlı adaptör karışımı eklemek için P200 geniş delik ucu kullanın. Reaksiyonu altı kez karıştırmak için P200 geniş delik ucu kullanın. Reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın ve sıralamaya devam edin.
Sıralamaya başlamak için önce Nanopore aygıtının kanallarından birine yeni bir akış hücresi yerleştirin. Ardından, beraberindeki sıralama kontrol yazılımında akış hücresinin konum kutusunu işaretleyin. Doğru akış hücre türünü seçin ve denetim akışı hücresinin iş akışını tıklatın.
Akış hücresi QC analizini başlatmak için test başlat düğmesini tıklatın. Daha sonra, 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P1000 pipetle, akış hücresinden kabarcıkları çıkarmak için 30 mikrolitreden daha az tampon çekin. Kabarcıklar tanıtmak önlemek için astar bağlantı noktası üst kapsayacak şekilde astar karışımı 30 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, pipet 800 mikrolitre astar karışımı astar bağlantı noktasına akış hücresi yüklemek için. Sol astar karışımı yaklaşık 50 mikrolitre olduğunda ucu çıkarın ve astar bağlantı noktasının üstüne astar karışımı geri kalanını ekleyin. Daha sonra, P1000 pipet ile, akış hücresine astar karışımı 200 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, yüklemeden hemen önce, DNA kitaplığı üzerinde altı kez pipet yukarı ve aşağı pipet için 80 mikrolitre ye ayarlanmış bir P200 pipet kullanın. Son olarak, kitaplık karışımı damla-bilge örnek bağlantı noktası üzerinden akış hücresine yük ve sıralama ve veri analizi devam edin. Mekanik yamultma tabanlı kütüphane inşaatı için hazır DNA QC analizi yaklaşık 1,9 260-280 saflık oranı ve yaklaşık 2,3 260-230 oranı, iyi bir DNA örneği gösteren sonuçlandı.
Aynı sonuç DNA'ya hazır transposaz parçalanma tabanlı kütüphane yapısı kullanılarak da görüldü. Darbe alanı jel elektroforezi ile iğne-litared HMW DNA boyut kalite kontrolü HMW DNA çoğunluğu 50 kilobases daha büyük olduğunu gösterdi. HG00733 hücre kullanılarak yapılan dört çalıştırmanın sonuçları, mekanik kesme tabanlı bir kitaplığın N50'sinin transposaz parçalanma tabanlı kitaplıktan daha kısa olduğunu göstermiştir.
Ayrıca, dört çalışır 100 kilobases daha uzun uzunluğu ile 2300 üzerinde okuma vardı. Transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelerde, mekanik kesme tabanlı kütüphanelere kıyasla daha kısa hazırlık süresi ile maksimum uzunluk daha uzundu. Mekanik kesme tabanlı kütüphaneler transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelere göre daha fazla toplam okuma üreterek daha yüksek bir verim gösterir.
Her iki kütüphane de tutarlı yüksek kalite gösterdi ve toplam üslerinin %97'sinden fazlası insan referans genomu ile uyumluidi. Beklenen boyut dağılımları, dört çalıştırmanın da 50 kilobaz üzerinde büyük oranda veriye sahip olduğunu, transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelerin ise ultra uzun okuma oranının daha yüksek olduğunu gösterdi. Genel amaç DNA'yı sağlam tutmak, bu yüzden DNA'nın sert bir şekilde işlenmesinden kaçınmak önemlidir.
Yöntemin değerini en üst düzeye çıkarabilecek önemli bir faktör hesaplamalı çözümlemedir. Ekibimiz, yüksek hassasiyetle tüm SV'leri tespit edebilen PICKY adında uzun okunan bir analiz boru hattı geliştirmiştir. Bu karmaşık SVs tespit ve tek molekül düzeyinde yeniden düzenleme ve değişiklikler phasing gibi heyecan verici alanlara yeni yollar açacaktır.
Bu, genom mimarisi anlayışımızı büyük ölçüde geliştirecektir. Fenol çok aşındırıcıdır. Eldiven, güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlüğü, uzun pantolon ve ayakkabı dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman, bir duman başlık ile çalışmak gerekir.
