Protokolümüz önemlidir, çünkü ortak arındırıcı dizilerden izole edilemeyen genomik dizileri tanımlamak için kullanılabilir, ki bu da kısmen bilinebilir. Bu tekniğin ana avantajları ucuz olmasıdır, hem de esnek indirilebilir çoğunlukla ücretsiz yazılım kullanarak. Birçok biyolojik soruya uygulayabilirsiniz.
Potansiyel uygulamalar bakteriyel aşı hedeflerinin belirlenmesi ve dizileri bilinen mikroplardan son derece farklı olan virüslerin belirlenmesini içerir. Bu yöntem, genomik hedef olmadan referans sırası mevcut olduğu sürece, bilinmeyenin deneysel olarak ayrılamayacağı herhangi bir sisteme uygulanabilir. Bu teknik bazı deneme yanılma alır, bu yüzden sabır önemlidir.
Programları çekmekte sorun yaşamanız gerekebilir. Burada tanımladıklarından farklı programlar kullanabilirsiniz. Kullanım kılavuzlarını mümkün olduğunca kullanın.
Hesaplamalı çalışma komut satırı programlamanın nasıl yapılandırıldığına ilişkin temel bir anlayışa bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Başlamak için, illumina adaptörleri ve düşük kaliteli üsleri kaldırmak için Trimmomatic 0.32 kullanın. Varsayılan parametreleri kullanarak trimmomatic output eşleştirilmiş okumalardan yüksek kaliteli birleştirilmiş okumalar oluşturmak için Armut sürüm 0.9.11'i kullanın.
Daha sonra Armut üzerinden üretilen okumaları düzeltmek için Sürüngen sürüm 1.1'i kullanın. Son olarak düzeltilmiş sıraları bir araya getirmek için varsayılan modda Trinity sürüm 2.4.0'ı kullanın. Strand belirli kitaplıklar için SS_lib_type parametresini kullanın.
Çıktı, trinity_output adı verilen yeni bir dizine yerleştirilecek bir FASTA dosyasıdır. nucleotide_reference başvuru sırasının BLAST veritabanını yapın. komut satırında fasta.
BLAST, biraraya getirilen sorguyu başvuru veritabanıyla eşleştirdi. Çıktı dosyası almak için BLAST_results kullanın. txt Python komut dosyaları ile alt sıra işleme adımları için gerekli tabular çıktı oluşturmak için, artan sıkılık için outfmt 6 kullanın, nükleotit veritabanının altı yönlü çevirisini gerçekleştiren çevrilmiş nükleotit BLAST ile BLAST sorgusu olarak montajdan protein dizilerini kullanın.
Sorgu için protein dizileri elde etmek için TransDecoder'ı çalıştırın. Uzun0rfs komutu biraraya sorgu dizileri en uzun açık okuma kareleri tanımlamak için. Şimdi tblastn çalıştırın.
Gerekirse, uygun kod seçeneği ile db_gencode kullanılarak incelenen organizma için doğru genetik kodun seçildiğinden emin olun. Yüksek kaliteli bir protein referansı varsa, tblastn yerine blastp ile eşleşen protein-protein kullanın Protein referansına ait blast veritabanını yapın. Sonucu akış aşağı işleme için bir dosya olarak kaydettiğinden emin olun ve Python komut dosyalarının bunları doğru şekilde ayrıştıradığından emin olmak için tabular çıktıkullanın.
Şimdi, eşleşen dizileri kaldırmak için çıkarma Python komut dosyasını kullanın. Okumaları derlemeye eşlemek için, indirilen ham okumaların sorgu derlemesine eşlemi için BWA-MEM Sürüm 0.7.12 veya bowtie 2'yi kullanın. Önce derlemeyi dizine dizin, sonra okumaların haritasını göster.
Çıktı SAM biçimi olacaktır. Python komut dosyası removeUnmapped çalıştırın. giriş olarak SAM dosyasını kullanarak py.
Bu, eşleşen okumalar yapmadan sorgu dizilerinin adlarını tanımlar ve bunları yeni bir metin dosyasına kaydeder. Önceki adımın çıktısı, txt dosyasındaki dizi adlarının listesidir. Bu dizileri içeren bir FASTA dosyası ayıklayın.
Çıktı bir fasta dosyası olacak. En iyi astar dizilerini el ile belirlemek için Genius'ı kullanın. Herhangi bir tabandan dört veya daha fazla sayıda çalıştırmayı önleyerek, ileri astar için 21 ila 28 baz çifti arasında bir aday sırasını vurgulayın.
Tüm baz çiftleri oldukça düzgün bir kombinasyonu ile bir bölge hedef deneyin. Üç Prime End'de tek bir G veya C yararlıdır, astar çapa yardımcı olur. Adayın bölge olarak tahmin edilen erime sıcaklığının altını görmek için ekranın sağ tarafındaki İstatistikler sekmesine tıklayın.
55 ve 60 santigrat derece arasında bir erime sıcaklığı hedefleyin, tekrarları kaçınarak, ve G C.Uzun çalışır aynı şekilde bir ters astar seçin, 150-250 baz çiftleri üç ileri astar üç astar yer. Astar uzunluklarının eşleşmesine gerek olmasa da, öngörülen erime sıcaklığı ileri astarınkine mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bir menü seçeneğinde bir sıra vurgulanırken Genius'da sağ tıklayarak sırayı tersine çevirdiğinden emin olun.
Alternatif bir yöntem, Sıra penceresindeki üst araç çubuğunda bulunan Primer Design işlevini kullanmaktır. Hedef Bölge altında yükseltmek için bölgeyi yerleştirin. Özellikler sekmesinin altında, istenilen boyutu, erime sıcaklığını ve yüzde G C'yi ekleyin ve astarların oluşturulması için Tamam'ı tıklatın.
Kalan dizinin nicel PCR doğrulaması gerçekleştirmek için, öncelikle sybr Green Master Mix, ileri ve ters astarlar ve su ile toplam 25 mikrolitre hacim için, triplicate her şablon için bir reaksiyon karışımı hazırlamak. Daha önce doğrulanmış sıcaklık ve uzatma süresi tarafından bilgilendirilmiş bir qPCR programı çalıştırın. Son denaturing eğrileri en azından ilk kez astarlar tek bir DNA ürünampampampifikasyon doğrulamak için qPCR istihdam oluşturulmalıdır.
Tüm durumlar için Ct ile Actin'e göre qPCR SYBR Yeşil sinyallerini ölçün, Actin'e göre ct'ye göre iki sinin ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın. QPCR tarafından doğru ürün boyutu tespiti onaylamak için, uç nokta jel elektroforez gerçekleştirin. Burada, 20 dakika boyunca 200 voltta 2% TAE Agarose jel üzerinde 6X Glitterol boya beş mikrolitre ile karışık qPCR ürün 25 mikrolitre çalıştırın.
QPCR'ınız hedef dizileri tanımlamadığınızı gösterirse, tüm döngüyü çevrimiçi bir veritabanından elde edilebilecek yeni bir başvuruyla yineleyin. Bu durumda subtraktif proje erkek ve kadın yetişkin zebra ispinoz mikrop kaplı doku Dan RNA dizilime ile başladı. Sonuç olarak, daha önce tüm genom ek açıklamalarında yer almayan 935 somatik gen tespit edildi.
Hesaplamalı filtrelemeden sonra, kantitatif PCR kuş dokuları arasında algılamada bir fark olmadığı olumsuz bir sonuç verebilir. Tersine, genomik DNA qPCR referansgöre, ilgi dokusunda istatistiksel olarak daha fazla algılama gösterdiğinde, Gerçek Hedef Dizisi nin tanımlanmasını temsil eden olumlu bir sonuç doğrulanır. Burada, alfa snap geninin mikrop ile sınırlı olduğu doğrulandı çünkü somatik dokuda testees DNA'sına göre tükenmişti.
Hesaplama adımlarının her birinde doğru girişleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Hedef sırasını veya dizilerini elde etmek için döngü çıkarma dan birden çok kez geçmeniz gerekebilir. Keşfedilen genler üzerinde çeşitli filogenetik, yapısal ve fonksiyonel analizler yapılabilir.
Bu ek yöntemler genlerin evrimsel ve işlevsel rolleri hakkında fikir verir. Mikrop ile sınırlı bir ötücü kuş kromozomundaki ilk geni belirledik, bu da bu şaşırtıcı genomik elemente olan ilgiyi genişletti. Sonraki çalışmalarda birçok ötücü kuş türünde benzer kromozomlar birçok ek genler içeren gösterdi.
