1. Kas Yaralanma kapsamı Fare Modeller Revealing Koşu Koşu Bandı <ol><li> Çalışan protokol sırasında kullanmak için koşu bandı yüzey açısı oluşturulması. Genel olarak, düz bir seviye veya 7 ° ve 15 ° derece arasında bir açı yokuş aşağı veya yokuş kullanılır. Bazı koşu bandı, diğerleri koşu bandı başka yollarla yükselebilir ihtiyaç duyarken, eğim ayarlamak için entegre aparatları var. </li><li> Koşu bandı altında çalışan protokol sırasında, hayvanların herhangi bir atık toplamak için koşu bandı, hayvanların koymadan önce bir tepsi ya da mavi bir laboratuar yastık yerleştirin. </li><li> Çalışan fareler, koşu bandı çevre acclimated olmalıdır önce. Bu, elektrik şebekesi ve kayış tahrik motoru ancak kemer (yani 0 m / s hız ile) hareket etmiyor 15 dakika boyunca koşu bandı hayvanlar yerleştirerek içerir. </li><li> Motivasyon elektrikli ızgara üzerinde açın. Kullanılan bakliyat şiddeti ve sıklığı genellikle koşu bandı üzerinde kontrol ama bir üreticiden diğerine değişir. Genellikle, maksimum yoğunluğu ise yüksek frekanslı (en azından her iki saniyede bir kez) uyumu artıracak çalıştırmak için fareler motive etmek için gerekli değildir. </li><li> Çalışan protokol başlamak için koşu bandı kemer etkinleştirin. Bir ilk hızı yaklaşık 5 metre / dk, fareler için bir ısınma dönemi için kullanılmalıdır. Genellikle 1-2 metre / dk her dakika koşu bandı başlangıç ​​aşağıdaki ekleyerek, yavaş koşu bandı hızı hızlandırılabilir. </li><li> Hayvanların çoğu protokollerde Uyum deneysel çalışan başlamadan önce ısınma hızında 3 ila 10 gün boyunca bir dizi kısa çalışır (5 dakika) yaparak geliştirilebilir. </li><li> Akut bir egzersiz yorgunluk genellikle maksimum hıza kadar süre ile koşu bandı hızını artırarak içerecektir (genellikle &lt;30 m / m) farelerin tükenme belirtileri göstermeye kadar elde ve muhafaza edilir. Yorgunluk yargılamak için kriterler değişebilir ancak genellikle bir fare, koşu bandı yüzeye dönmeden, elektrikli ızgara, elektrikli ızgara veya arka arkaya 5 saniye zaman yarıdan daha fazla harcama. Bireysel bir fare bitkin sonra koşu bandı kaldırılabilir ve çalışan toplam süre kaydedilebilir. </li><li> Koşu Bandı açısını değiştirme egzersiz yükü (yokuş yukarı bir açı ile) artırmak veya kas lifleri 1 sarkolemmal zarında yırtılma zarar eksantrik kasılmalar (yokuş aşağı açı ile) ikna etmek için akut çalışan çalışmalarda kullanılabilir. Evans mavi boya, hasarlı kas liflerinin 2,3 tanımlamak için bir histolojik boya olarak kullanmak için bu işlemler öncesinde hayvanların içine enjekte edilebilir . </li><li> Dayanıklılık eğitimi çalışan protokoller zaman uzun bir süre (ay) üzerinden hayvan kas veya kardiyovasküler sistem remodeling üretmek amacıyla bir egzersiz yükü. Isınma prosedürü ancak (&gt; 1 saat) maksimum hızı genellikle düşüktür ve çalışma zamanları oldukça uzun olabilir (adım 1.5), yukarıda belirtilen aynı. </li><li> Farelerin çalışan tamamlanmasından sonra kafeslerine iade edilebilir. Koşu Bantları genellikle fareler çalışırken, özellikle uzun protokoller üzerinden, oldukça kirli. Her kullanımdan sonra, genellikle% 70 etanol sprey, koşu bandı temizlemek için gereklidir. </li></ol> UV lazer Hasar ardından 2. İzole kas liflerinin Membran Onarım Kapasitesi Ex Vivo Testi <ol><li> Fare ayak fleksör digitorum brevis (FDB) kas yüzeysel katmanı parçalara ayır. Birincisi, altındaki kas zarar vermemeye dikkat çekerken, orta hat tek açık cilt kesilir yatay kesimler ve cilt kaldırmak. FDB kas (proksimal tendon) düz beyaz tendon kalkaneus kemik bağlı olarak görülebilir. Pervasızca forseps tendon ayrı ve tendon yakın site eki sever, forseps serbest tendon kapmak ve bağlı kalır herhangi bir bağ dokuları kesim sırasında çevre dokulara FDB ayırmak için hafifçe yukarı çekin. FDB bu tendonların derin kas tabakasına bağlanmak kesim tarafından kaldırılmış olabilir bireysel basamak distal tendon şube görünce. </li><li> FDB kas demeti koyun 1 ml kollajenaz çözüm önceden ısınmış 1,5 ml Eppendorf tüp, tüp yatay yönde 37 ° C orbital çalkalayıcı bir bant içinde 37 ° C ve 200 rpm&#39;de 65 dakika süreyle sallamak. Inkübasyon Times, yıpranmış bir görünüm ve kas soluk renk ile gösterilir yeterli sindirim, sağlamak için ayarlanması gerekir. </li><li> 1 ml pipet ile sindirilir paket kesinti olmadan kolayca geçmesine izin vermek için yeterli bir çapa sahip bir kesim ucu ile 2.5 Ca 2 + Tyrode ~ 600 ul içeren bir 1.5 ul santrifüj tüpü içine sindirilmiş FDB paket dikkatlice aktarın . Paket gevşek liflerin sallamak için tüp yavaşça çevirin. </li><li> 30 mcL pipet Kes böylece dpaket pipet yavaşça içine çekmek ve daha sonra çözüm geri itin pipet kullanın (15 arasında çapı 20 mikron) iameter kas demeti daha sadece biraz daha küçük. Liflerin çoğunluğu paket kopuk olana kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir cam alt delta T çanak üzerine istenilen miktarda ve bırak kopuk lifleri, tüp hafifçe çevirerek karıştırın. Yük hacmi, izolasyon ve bir tabak belirli bir protokol için gerekli olan faydalı liflerin sayısı verimlilik üzerine göre değişir. Kalan lifleri ° C ek çalışmalar için yaklaşık 6 saat, 4 tüp içinde saklanabilir. </li><li> Çanak, 5 dakika boyunca rahatsız oturmak için izin verin. Bu lifler çanak cam alt yapışmasına yol açar. </li><li> UV lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskopi cam dipli çanak yerleştirin. &gt; 100X büyütmede faz mikroskobu altındaki lifler normal bir çizgi çizgi desen ve şekil gibi düz bir çubuk varlığını kontrol etmek için dikkat edin. </li><li> 2.5 mcM 5 final konsantrasyon çözüm FM1-43 veya FM4-64 styrylpyridinium boyalar 4 ekleyin. </li><li> Lif, 45 derecelik bir görüş alanı (Şekil 1) sağ alt sol üst açıyla odaklı fiber konumu görüntüleme penceresinde zarar neden. 5x5 piksel, 5 saniye için maksimum güç (80 mW veya daha fazla, 351 / 364 nm) UV lazer kullanılarak plazma membran bir alan (yaklaşık 0.9μmx0.9μm) ışın tedavisi. Işınlanmış bölge plazma membran bölünmüş; kalan fiber (Şekil 1) dışında olmalı, 5x5 kutusunun yarısı lif içinde olması gerekir,. </li><li> 5 dakika kadar, her biri 5 saniye aralıklarla elyaf haline boya giriş görüntüler yakalayın. </li><li> Floresan boya sonunda elyaf haline endocytosed olacak, çanak başına en fazla 3 elyaflar için adım 2.8 tekrarlayın ve herhangi bir veri analizi zorlaştıracaktır. 3 lifleri adım 2,5 &#39;ten sonra yeni bir yemek hazır olmalıdır. </li><li> Yakalanan her kare arası boya giriş miktarını ölçmek için floresan değişimi (mesafe kadar taşınmış / F 0) hesaplarken verileri analiz ediyoruz. Bu gibi kamuya ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) olarak analiz yazılımı kullanarak 2 bir alanda yaklaşık 200 mikron ortalama floresan ölçüm gerektirir. Lifleri arasında bir karşılaştırma için, her kare için aşağıdaki hesaplama yapılabilir: F 0 ilk yakalanan çerçeve (t = 0; yaralanma önce) ilgi bölgenin ortalama floresan mesafe kadar taşınmış / F 0, ve mesafe kadar taşınmış sonraki her çerçeve floresan değişimi (FF 0). </li></ol> 3. Hücre Zarı Onarım Dinamik Process Monitor Hücre Konfokal Görüntüleme Canlı <ol><li> Mikropipetler PYREX kılcal yapılmıştır. Kapiller mikropipet çektirmesi üzerine yerleştirilen ve önceden belirlenmiş bir program (Heat = 695 = 50 çekin; Vel .= 55 gün = 250) tarafından çekildi. </li><li> Mikropipet 3 eksen (xyz) mikromanipülatör bağlanmıştır. </li><li> Hücreler bir cam alt delta T çanak normal yöntemler kullanılarak plazmid DNA ile transfekte. Medya 2.5mm Ca 2 açık olmalıdır + Tyrode tampon önce deneyleri başlar. </li><li> Transfekte hücreler içeren cam yemekleri konfokal mikroskop 40X 1.3NA immersiyon yağı amacı ile bir lazer tarama yerleştirildi. </li><li> Akut canlı hücre hasarı, hücre zarının içine mikropipet ekleyerek yapılır ve sonra hızlı bir şekilde hücre 3,6 mikropipet geri çekmek oldu . 1.54 s / kare bir aralıkta Ardışık canlı hücre görüntüleri elde edildi. </li><li> Saponin indüklenen zarı bozulma testi için, 2.5mm Ca 2% 0.005 &#39;saponin (Sigma) + Tyrode tampon bir ağırlık akış özel monte perfüzyon sistemi 7 ile perfüze edildi. Perfüzyon oranı yaklaşık 1 ml / dak perfüzyon ucu doğrudan görüntülü hücre üstünde olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Fare koşu bandında çalışan bir temsilci, film çekimleri sırasında yapılabilir. Iskelet kas hasarı nedeniyle fare film mg53 / düşük çalışan kapasitesini gösterecektir. Analiz fiber membran onarım kapasitesi, yukarıda ayrıntılı UV lazer hasar protokolü tarafından yol açtığı hasar ölçüde bağlıdır. Bu kapasite, genotip elyaf izole edilmiş olan fare, ekstrasellüler koşulları ve herhangi bir tadilat protein ekspresyonu (transfeksiyon veya enfeksiyon) tarafından etkilenir. Normal vahşi tip fiber boya girişi (Şekil 2a) hafif ve orta sağlayacaktır. Mg53 / elde edilen kas lifi tehlikeye zarı tamir kapasitesine sahip farelerin fiber (Şekil 2b), boya daha önemli giriş gösterecektir. Mikroelektrot yaralanma gösterisi translokasyon MG53 içeren vesi için tipik sonuçlaryaralanma sitede CLES. Şekil 3a ve 3b gösterisi GFP-MG53, hücre zarının içine mikropipet ekleme zarar C2C12 myotubes transfekte. GFP-MG53 mikropipet önce hücre hasarı, plazma zarı ve sitoplazma 3 hem de yer almaktadır. Mikropipet penetrasyon sonrasında, GFP-MG53 içeren veziküller zarar siteleri (ok ucu tarafından gösterildiği gibi) doğru ilerledik. Şekil 3c% 0.005 &#39;saponin, plazma zarı permeabilize bir deterjan ile tedavi edilen bir GFP-MG53 transfekte C2C12 matür gösterir. Saponin tedavi üzerine, GFP-MG53 sitoplazmada hücre zarından transloke. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Weisleder, ve ark. Şekil 1. Fiber hizalama ve yaralanma bölge tanımı. Görünümü ve gösterilen yaralanma bölge tanımı alanı içinde izole kas lifi doğru yönlendirmesi. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Weisleder, ve ark. Şekil 2. FDB lif Görüntüler UV lazer hasar önce yaralanma (0 sn, sol) ve 200 sn yazılan yaralanma (sağda) lifler göstermektedir. Vahşi bir tür fare (a) Elyaf hafif yaralanma göstermektedir. Tehlikeye zarı onarımı ile farelerden alınan lifler (b), girmek için boya izin. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Weisleder, ve ark. Şekil 3. Mikroelektrod ve saponin kültür hücreleri zarar verebilir. Görüntüleri C2C12 myotubes (a, b) ve yaralanma (üstte) ve sonrası yaralanma (alt) önce bir C2C12 myoblast (c) göstermektedir. Mikroelektrot (a, b) yaralandı hücreler yaralanma siteleri (oklar) MG53 translokasyon göstermektedir. Saponin (c) ile tedavi edilen hücreler, hücre zarı MG53 translokasyon göstermektedir.

<ol>
	<li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle.">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence.">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53,+caveolin-3,+and+dysferlin.">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+of+ischemia/reperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair.">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li><li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice.">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice.">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li><li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li></ol>

Koşu Bandı çalışan tedavi edilen hayvanlar için bir egzersiz yükü sağlayan yararlı bir yöntem. Ölçüm kas fonksiyonu için bir metodoloji ya da dayanıklılık kapasitesi olarak sürekli tekrarlanabilir moda 8 yürütmek zor herkesin bildiği gibi gürültülü bir yaklaşımdır. Genel olarak, yorgunluk kez deney grupları arasında önemli farklılıklar, bazı nakavt fare hatları ve 9 yabani tür fareler arasında bu gibi çözmek için bir bitiş noktası olarak kullanılabilir. Deneysel manipülasyonlar, bazı ilaç denemeleri gibi daha ince fark, üreten, bu tekniği ile ilişkili gürültü üzerinde farklılıkları gidermek olmayabilir. Tekrarlanabilirlik ve duyarlılık bu tekniklerin en üst düzeye çıkarmak için çok yakından oturumunda oturum için gerekli koşulları sağlamak için önemlidir. Gün süre hayvanların yanı sıra kullanılan ısınma dönemi koşulları, icra edildiği önemli faktörlerdir ve deneme yargılanma tutarlı kalmalıdır. Gerilme etkileri farelerde belirli suşları diğer suşlar daha koşu bandı üzerinde daha fazla zaman aday ve dayanıklılık egzersizi 10 farklı yanıt olarak, koşu bandı protokollerin tasarımı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Genel bir kural olarak, birçok farelerin bir yorgunluk çalışmada toplam 200-300 metre koşu bandı hızı (m / m başladıktan sonra her dakika için 1 ile 5 m / m başlangıç ​​hızı) sabit artış ile çalıştırmak mümkün olacaktır. Bir dayanıklılık egzersizi için fareler 30 dakika 2 ya da 3 haftada bir kere, 9 ila 12 m / m arasında çalıştırmak olabilir. Ancak, bireysel çalışmalar, genellikle, deneysel bireysel ihtiyaçlarına uygun protokol bazı optimizasyon gerektirir. UV lazer hasar prosedürü, iskelet kas lifleri 3,6,11 zarı tamir kapasitesini ölçmek için etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir . Bu deneylerin başarısı için hayati bir bileşendir izlerse düzenli bir desen ve buruşuk görünmüyor düzgün bir sarcolemma ile düz bir çubuk biçimli bir görünüm ekranı yalnızca kas lifleri kullanmaktır. Diğer kas lifleri seçilirse zarı hasarı Bu deneylerin sonuçları bu lifler ve yorumlama zaten mevcut olabilir komplike olabilir. Işınlanmış bölgenin lif ve tanımı yönünü Şekil 1&#39;de tanımlanmış olması da önemlidir. Bu, böylece lifler arasında karşılaştırma izin tekrarlanabilir büyüklükte bir yaralanma sağlar. Yaralanma tanımlanan bölgenin tamamen fiber içinde yer alıyorsa, bir iç yaralanma sarcolemma kesintiye yerine oluşturulur. Ayrıca, mesafe kadar taşınmış / F 0 için hesaplanan değer faiz ortalama floresan ölçümü için seçilen bölge çok hassastır. Yaklaşık 200μm 2, ve yaralanma sitesi de dahil olmak üzere komşu bir alana uygundur. Yaralanma tanımlanan bölgenin aksine, bu alanda fiber içinde tamamen yalan gerekir. Fiber dış mekan eklerseniz, daha ciddi bir fenotip ile liflerinde mesafe kadar taşınmış / F 0 düşürürken, ortaya çıkan boş bir alanı az boya girişi ile lifleri mesafe kadar taşınmış / F 0 artacaktır . Bu testin duyarlılığı azaltır, böylece lifler arasında karşılaştırma daha zor hale. Mikropipet hasar tahlil için, etkin bir şekilde hücre zarının zarar için mikropipet ve cam alt çanak arasındaki açı yaklaşık 45 derece olmalıdır. Hücreler, yemeğin altına sıkıca bağlı olmalı ve yuvarlak hücreler mikropipet alay sonra ayırmak, büyük olasılıkla bu yana kullanılan olmamalıdır mikropipet hasar için seçilmiştir. Saponin permeabilzation deneyler, penetrasyon testleri mikropipet ile karşılaştırıldığında daha az gerçekleştirmek için teknik olarak zor ve göreceli olarak daha hızlı. Ancak, saponin hasar saponin diffüz ve o çanak diğer hücrelere zarar verir bu yana sadece bir hücre çanak başına kullanılabilir olması da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Kemirgen koşu bandı </td><td> Columbus Instruments egzersiz 3 / 6 veya eşdeğeri </td><td></td></tr><tr><td> % 70 etanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları da dahil olmak üzere ince uçlu forseps, yaylı makas </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml kollajenaz tip I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode tampon (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7.2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + Tyrode tampon (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7.2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık kontrol edilebilen orbital çalkalayıcı </td><td> New Brunswick veya eşdeğeri </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Bulaşık </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> EKK 510 konfokal mikroskop Enterprise 80 mW UV lazer veya eşdeğer konfokal mikroskop ile </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 veya FM4-64 boyalar </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat kılcal Boyutu 0.8-1.0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Parça No 9530-2 </td></tr><tr><td> Mikropipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> model P-97 </td></tr><tr><td> 3 eksen mikromanipülatör </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 lazer tarama konfokal mikroskop veya eşdeğer mikroskop </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Hücre zarının akut yaralanma tamir elemental normal hücresel fizyoloji süreci ve hatalı zarı onarımı, pek çok dejeneratif insan hastalıklara bağlı olmuştur. Membran mühürlenirken makine önemli bir bileşeni olarak MG53 son keşfi, moleküler biyoloji, temel doku onarımı yanı sıra, rejeneratif tıp potansiyel translasyonel uygulamaları için daha iyi bir anlayış sağlar. Burada detaylı MG53 in vivo fonksiyonu olarak izole kas liflerinin içine boya giriş ölçerek ex vivo zarı tamir kapasitesini test etmek için fare modelleri, treadmill egzersiz protokolleri kullanarak kas hasarı tamir keşfetmek ve dinamik bir süreç izlenmesi için deneysel protokolleri kültür hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak MG53-aracılı vezikül kaçakçılığı ve hücre zarı onarımı.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K Görüntüleme.  Robert Wood Johnson Medical School. Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

Video: Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Biyoloji

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...