Bu çalışma McNair Vakfı, NARSAD ve R00NS064171-03 NINDS hibe yoluyla destek tarafından finanse edildi.

1 in situ beyin fiksasyon * Fosfat ile dolu bir 10 ml şırınga (28 gauge iğne) hazırlayın tamponlu salin (PBS). * PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile dolu bir 10 ml şırınga (28 gauge iğne) hazırlayın. PFA / PBS Rezerv post fiksasyon için ek bir 5-10 ml. <ol><li> Avertin veya Nembutal öldürücü bir doz ile deneysel fare intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> Fare sedasyon sonra, etanol ile karın ıslak ve mantar, mum, ya da silikon elastomer diseksiyonu pimleri kullanarak katmanlı bir tepsi dibine fare güvenli. Yukarı bakacak şekilde karnın yüzeye dört pençeleri güvenli - mümkün olduğu kadar geniş yayılıyor. </li><li> Sternum düzeyinde forseps ile cilt tut ve karaciğer maruz çaprazlama kesmek. Kaburga ve diyafram ile yanal ve ardından Kes. Göğüs dokusu kapağını çıkarın ve kalp erişilebilir kadar kesme devam ediyor. </li><li> Pierce ya da makasla kesme, dolaşan kan akıtmak için sağ atriyuma. </li><li> Artık kan dolaşım sistemi, sol ventrikül ile PBS perfüzyon ile yıkayın. </li><li> Aynı iğne deliği erişme, sol ventrikül ile PBS / PFA sonraki perfüzyon tüm fare düzeltin. </li></ol> 2. Diseksiyon ve beyin çıkarımı <ol><li> Cilt, baş, boyun, ve kafatası kafatası açığa anteriora çekerek cilt, kulak kanalı ve göz yörüngeleri etrafında keserek çıkarın. *) 2.5 adımları 2.2) bir örneği için Bkz: Şekil 2 </li><li> Kemik makası kullanarak, göz burun konka kemikler yoluyla soket çapraz olarak kesilmiş. Her iki tarafı için bunu yapın. Kertik gözleri ve koku ampuller önünde olmalıdır. </li><li> Göz çukurlarının her kulak kanalının uzunlamasına kesin. </li><li> Küçük bir diseksiyon makas kullanarak, diğer bir kulak kanalına beyincik üzerinde oksipital kemik plaka kesti. </li><li> Aynı diseksiyon makas ile koku ampuller düzeyi orta hat boyunca anteriora kesti. </li><li> Forseps kullanarak, herhangi bir bağ dokusu, kemik kaldırırken beyin bozulmadan kalır, böylece kaldırmak için özen, beynin her kemik plaka kaldırmak. </li><li> Kırpılmış optik ve kranial sinirler, kesim, üst servikal vertebra ve fiksatif içine beyin kaldırmak. </li><li> 4 1-2 saat Post-fix ° C Yıkama 3 kez 15 dakika PBS içinde. </li></ol> 3. Agaroz gömme <ol><li> Eritin% 2 yüksek mukavemetli, düşük-jel noktası agaroz tip IB (Sigma katalog numarası: A0576), mikrodalga fırın ile PBS salin. </li><li> Erimiş agaroz bir test tüpüne aktarın. Sıcaklık dengeleme kadar sıcak bir inkübatör veya su banyosu (40 ° -41 ° C) test tüpü yerleştirin. </li><li> Tutkal siyanoakrilat yapıştırıcı (Şekil 3A) ile örnek şırınga pistonu üzerine sabit beyin dokusu. Agaroz halka beyin dilimleri sonraki sürümü kolaylaştırmak için doymuş sakaroz-PBS çözüm beyin doku yüzeyine ince bir tabaka fırçalayın. </li><li> Piston konut (Şekil 3B) beyin dokusu ile piston aşağı çizin. </li><li> Pipet veya beyin doku kaplama, sıcak agaroz piston konut içine dökün. Agaroz içine hava kabarcıkları yakalama kaçının. Hava kabarcıkları agaroz dilim kalitesini tehlikeye sokacaktır. </li><li> Soğuk (0 ° -25 ° C) 1 dakika için agaroz (Şekil 3C) ayarlamak için soğutma bloğu ile örnek şırıngayı Kelepçe </li></ol> 4. Compresstome beyin dilim Kesit <ol><li> Compresstome (Şekil 3B) beyin dokusu içeren numune şırınga birleştirin. </li><li> Örnek şırınga çıkış (Şekil 3E) ile yakından jilet kenarına hizalayın. </li><li> PBS solüsyonu ile tampon tankı doldurun. </li><li> Numune şırınga agaroz-beyin doku bloğu a&#39;ya için mikrometre bir kesit kalınlığı öne döndürün. </li><li> Compresstome kontrol ünitesi kesit işlemini başlatmak için &quot;start&quot; butonuna basın. </li><li> İstenen dilim kalınlığını belirlemek elde edinceye kadar tekrarlayın adımları 4.4) 4.5). </li><li> PBS (Şekil 3F) ile dolu şişeleri veya boyama kuyu fırça veya pipet ile Hasat beyin dilimleri. </li></ol> 5. Optik Takas <ol><li> Gliserol vol çözüm: PBS% 75 vol hazırlayın. </li><li> (Ya da pipet), toplanan beyin dilimleri PBS yıkama yarım hacmi kapalı dökün. </li><li> Gliserol / PBS ile temizlenebilir hacmi geri ekleyin. </li><li> 4 nazik karıştırma gelmesini sağlayınız ° C dilimleri lavaboya kadar. </li><li> Son bir gliserol konsantrasyonu% 75 ulaşıncaya kadar) 6.4 adımları 6.2) tekrarlayın. </li><li> PBS içinde% 90 gliserol ile çözüm değiştirin ve gelmesini sağlayınız. * Not: gliserol çözümler eklerken hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Hava kabarcıkları üniforma equilibra engel olacak bu yana, yavaş yavaş çözümler dökün ve hafifçe karıştırınkurulum ve montaj slayt üzerinde yapılacaktır. </li></ol> 6. Dilim görüntüleme için montaj <ol><li> Mikro slayt (SuperFrost Plus, 25 görüntülenebilir alana sığması için açık bir dikdörtgen içine çift taraflı conta yapıştırıcı (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) kesin X 75 X 1 mm, kedi # 48.311-703, VWR ) kenarları 2-3 mm genişliğinde. </li><li> Merkezi bir pipet veya fırça kullanarak yapışkan bant dikdörtgenin içinde beyin dilimleri yerleştirin. Nazik aspirasyon ile aşırı gliserol çıkarın. </li><li> Bir fırça ile istenilen sırayla slayt beyin dilimleri yerleştirin. </li><li> Yapışkan bant üzerine yavaşça alt kapak cam (24 X 60 mm, kedi # 48.383-139, VWR), hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Yapışkan bant ile temas sağlamak için cam kapak üzerine hafifçe basınç uygulayın. </li><li> Slayt ve coverglass arasındaki kenarlarından fazla gliserol aspire. </li><li> Seal net oje kullanarak slayt ve kapak. </li><li> Görüntüleme önce kuru, ya da 4 slayt kutular içinde uzun vadeli saklamak için izin ver ° C. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: İşleme, görüntüleme ve floresan etiketli beyin dokusu analiz nörobiyoloji çalışma için vazgeçilmez hale gelmiştir. Bu araştırmaların çoğu gelişmiş genetik manipülasyonlar hem de düşük ve yüksek çözünürlüklü görüntü analizi ile hedeflenen nöronal altkümelerini muhabir ifade elde etmek için gerekir. Genellikle deneysel ve teknik sınırlamalar aynı hayvan imkansız bu tür verileri elde etmek için, ya da hızlı bir şekilde olun. Bu meydan okumanın içinde floresan görüntüleme yardımlar için optik-temizlenir, yarı kalın beyin bölümlerinin hazırlanması. , Genetiği değiştirilmiş kuduz virüsü ile etiketlenmiş sağlam kalın bir beyin dilim bir örneği ifade EGFP mühendisliği ve epifluorescent ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü Şekil 4&#39;te gösterilmiştir ve sırasıyla Şekil 5 . Epifluorescent görüntüleme için bir Leica M205 FA ve konfokal görüntü alımı için Zeiss LSM 510 kullanılmaktadır. Ekli protokol göreli basitliği nedeniyle, bu yöntem, bir gün daha az bir geri dönüş süresi ile floresan gazetecilere ifade doku yararlı görüntü verilerini verimli yeteneğine sahip, hem de düşük ve yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobu ile uyumlu. Araştırmacı ek postmortem etiketleme yöntemleri, immünohistokimyasal boyama, birleştirmek ya da ince bölümleri seçerse, protokol, buna göre uzar. Ancak, yukarıda açıklanan yöntem bozulmamış beyin hayati muhabir ifade tarama modelleri için basit ve nispeten yüksek verimli bir yöntem temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Akış şeması diagraming fiksasyon, diseksiyon, dilimleme, takas, ve yarı kalın beyin dilim montaj prosedürü. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 sıralı kesme adımları sağlam fare beyin ayıklamak için Diyagramı. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3, beyin dokusu Compresstome kullanarak monte ve dilim Adımlar . A) beyin dokusu superglue kullanarak piston kesme üzerine yerleştirilmesi. B) agaroz gömmek için piston içine monte beyin dokusu aşağı çizimi. C) soğutulmuş bir sıkıştırma bloğu kullanarak bir agaroz beyin fiş katılaşabilme. D) Compresstome kesme odasına agaroz beyin tak ve piston Ekleme. Piston cihaza jilet E) Hizalama. F) Compresstome tampon odasına beyin dilimleri Kesme ve toplama. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 gliserol-temizlenir beyin dokusu gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade frontal korteks ile kalın bir dilim Işık mikroskobu görüntüleri. Bir fare beyin aracılığıyla A) Koronal dilim (200 um kalınlığında) bir viral vektör ifade EGFP etiketli ve düşük çözünürlükte bir epifluorescent Stereoskop kullanarak görüntülü. Ölçeği bar, 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 floresan etiketli katmanı 5 / 6, temizlenmiş kalın bir beyin dilim kortikal nöronların yüksek büyütme görüntü. Z-yığını (150 um kalınlığında) vurgulanan bölgesi (Şekil 4) ile maksimum projeksiyon A) Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü. Ölçeği bar, 25 um.

<ol>
	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Jian-Qiang Kong Bu makalede kullanılan bir ürün üretmektedir Precisionary Instruments, Inc, bir çalışanı.

, Işık mikroskobu, ekran, resim ve bozulmamış beyin dokusu içinde yapay sinir ağları analiz hızla vazgeçilmez bir araç olmuştur ihtiyacı üzerinden soruşturma nöronal alt kümelerini hedef floresan proteinleri kullanarak yaygın bir uygulama göz önüne alındığında. , Kullanıcı dostu, in vivo elektroporasyon teknikleri viral vektörlerin, genetiği değiştirilmiş fare suşlarının gelişimi teknik gelişmeler artık araştırmak için etiketli hücre...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Öğenin Adı</th&gt;<th&gt; Şirket</th&gt;<th&gt; Katalog numarası</th&gt;<th&gt; (Isteğe bağlı)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kemik makas</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16.044-10</td&gt;<td&gt;-Ya da eşdeğeri</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Diseksiyon makas</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14.084-08</td&gt;<td&gt;-Ya da eşdeğeri</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tip IB agaroz</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Precisionary Aletleri</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt; Diğer vibratomes uyumlu</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Çift taraflı yapışkan</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SuperFrost Plus, slaytlar</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kapak cam</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gliserol</td&gt;<td&gt; Merck Kimyasalları A.Ş.</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;-Ya da eşdeğeri</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

, Hem temel ve klinik nörobilim temel bir hedefi, kimlikler, moleküler makyaj, ve hem de normal ve hastalıklı beyin nöronları için karakteristik bağlantı desen daha iyi anlamak için. Bu doğru, büyük bir çaba, yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalar 1-3 bina yerleştirilmiştir . Moleküler genetik ve ışık mikroskobu gelişmeler genişleme nöronal morfolojileri sadece sorgulama yeteneği gelir, aynı zamanda bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağları 4 moleküler ve hücresel makyaj gelmiştir. Kemirgen transgenik ve gen hedefleme teknolojileri yoluyla nöron işareti ve manipüle etme yeteneği büyük gelişmeler olacak 5-6 &#39;program&#39; nöronal komutlara araştırmacılar izin verir. Muhtemelen, en etkili çağdaş nörobilim katkılarından biri hayati gazetecilere giderek genişleyen bir araç kutusu 9 verim 7-8, sonraki mühendislik yanında deniz omurgasızları floresan proteinleri (FP) kodlayan genlerin keşfi ve klonlama olmuştur . Ayrık nöron popülasyonları hedef FP ifade sürücü istismar hücre tipine spesifik promotor aktivitesi genetik hassasiyetle nöroanatomik soruşturma tanıyor. Nöronlarda Mühendisliği FP ifade beyin yapısı ve işlevi anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi. Ancak, derin beyin dokularında, ya da üç boyutlu görüntüleme bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağlar, bir meydan okuma olarak kalmıştır. Yüksek lipid içeriği nedeniyle, sinir dokusu oldukça donuk ve sergiler otomatik floresan. Bu içsel biyofiziksel özellikleri zor onlarca mikron derinliklerde ötesinde standart epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlükte floresan etiketli nöronlar görselleştirmek ve görüntü olun. Bu meydan okuma araştırmacılar aşmak için sık sık seri ince kesitli görüntüleme ve rekonstrüksiyon yöntemleri 10, veya 2-foton lazer tarama mikroskopisi 11 kullanmaktayız. Bu yaklaşımların Şu sakıncaları sırasıyla ilişkili emek-yoğun doku hazırlanması, veya maliyet-engelleyici enstrümantasyon. Burada, floresan etiketli hücreleri optik takas ve görüntüleme ile sabit yarı kalın fare beyin kesitleri görselleştirmek için oldukça hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Ekli protokol yöntemlerini açıklar: 1) intrakardiyak perfüzyon, 2) diseksiyon ve tüm beyin kaldırılması, 3) agaroz, 4 sabit beyin gömme), yeni bir vibratome alet kullanarak hassas yarı kalın dilim hazırlama ile yerinde tespit beyin dokusu gliserol degrade üzerinden, 5) takas beyin dokusu, ve 6), ışık mikroskobu ve z-yığın yeniden yapılanma (Şekil 1) cam slaytlar montaj . Beyin kesitleri hazırlamak için, nispeten yeni bir enstrümantasyon parça olarak adlandırılan &#39;Compresstome VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html) uygulanmaktadır. Bu cihaz, diğer vibratomes fonksiyonu benzer özelliklere sahip bir motorlu avans ve bıçak titreşim sistemi ile donatılmış bir yarı-otomatik mikrotom. Diğer vibratomes aksine, dilimlenmiş doku, paslanmaz çelik silindir içinde bir agaroz fiş monte edilir. İstediğiniz silindir arasında kalınlıklarda doku ekstrüde ve ileriye doğru ilerleyen titreşimli bıçak ile kesilir. Agaroz fiş / silindir sistemi tekrarlanabilir doku, montaj, hizalama ve hassas kesim sağlar. Bizim ellerde, &#39;Compresstome&#39; verim için yüksek kaliteli doku elektrofizyoloji, immünhistokimya dilimleri, ve doğrudan sabit doku montaj ve görüntüleme. Optik temizleme birlikte, burada, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için yarı kalın sabit beyin dilim hazırlık göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices at JoVE.com

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine (BCM). Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Video: A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...