Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Bu eser Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC keşif Grant) ve Savoy Vakfı tarafından desteklenmiştir. OC NSERC bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak)
<ol><li>Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktası aşağı serin (0-4 ° C). Not: Bir düşük sodyum kesme çözüm (ACSF-Sükroz) kullanımı akut dilimleri26yüzeysel katmanları nöronlarda canlılığı korunmasına yardımcı olur.</li>
	<li>0.75 mL kırmızı bir fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren yama çözeltisi hazırlamak ve yeşil sentetik kalsiyum göstergesi (örneğin, Oregon yeşil BAPTA-1; bkz: Tablo 1). Biocytin dahil (bkz. Tablo 1) yama-çözüm post hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre gerekiyorsa.</li>
	<li>Osmolalite 280 ± 5 mOsm çözümü ve pH 7.35 ± 0.5 için ayarlayın. Çözüm her zaman buzdolabında veya buz üzerinde tutun. Not: Seçim kalsiyum göstergesinin dinamik menzili ve incelenen Ca2 + olayların niteliğine esas.</li>
	<li>Micropipette çektirme kullanarak, borosilikat cam kılcal damarlar ( Tablo malzemelerigörmek) dan yama Pipetler ≈ 2 µm bahşiş (3-5 MΩ pipet direnç) ve borosilikat teta-cam kılcal damarlar (bakınız tablo, gelen stimülasyon Pipetler ile hazır olun Malzemeler) 2-5 µm ipucu ile. Not: Pipetler belirli çapı ve şekil yapmak için çekici ayarı çektirme filaman türü ve rampa test sonuçlarını bir cam türü için tarafından belirlenecektir.</li>
</ol>2. Hipokampal dilim hazırlık
<ol><li>Fare anestezi (P13-20; zorlanma ve seks fare ele alınmaktadır deneysel soru tarafından belirlenir) bir inhalasyon narkoz odası içinde bir kağıt havlu üzerine yerleştirilen isoflurane 1 mL ile. Hayvan derinden, hareket ve yavaş solunum eksikliği kanıtlanan anestezi, narkoz odasından kaldırın ve bir Giyotin kullanarak başını kesmek.</li>
	<li>Kafatası kafatası arkasından makas burun için küçük bir çift ile deri kesim tarafından maruz. Mini kemik rongeurs küçük bir çift bregma düzeyde bir delik açmak için kullanın. Ardından makas sagittal dikiş boyunca Kaudal-için-rostral bir kesim yapmak için kullanın. Rongeurs ile her kafatası kapağı ve Asansör yukarı ve dışa doğru her hemisphere kapsayan kafatası kaldırmak için kavramak.</li>
	<li>Beyin tamamen maruz sonra görme sinirini küçük bir spatula ile kesme vuruşu. Beyin kafatasından kaldırmak ve sürekli oksijenli, soğuk ACSF Sükroz içeren bir Petri kabına koydum (sukroz konsantrasyon için bkz: Tablo 1 ).<ol>
<li>Büyük fareler dokudan gereklidir, İntrakardiyak bir perfüzyon kaliteli dilimleri elde etmek için önce beyin çıkarımı buz gibi ACSF Sükroz 20 mL ile dolu bir şırınga (25 G) kullanarak gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hipokampal dilimleri--dan hulâsa hayvan beyin hazırlayın.<ol>
<li>Bir filtre kağıt parçası üzerinde buz dolu bir Petri kabına yerleştirin, filtre kağıdı üzerine beyin transfer beyin chill yaklaşık 2 dakika süreyle izin. İki hemisferlerin incelemek.</li>
		<li>Disseke hemisferlerin (yönlendirmeyi koronal, enine veya yatay dilimler elde etmek için deneysel hedefi tarafından belirlenir) bir vibratome tablo tutkal ve buz gibi oksijenli ACSF Sükroz ile dolu vibratome tepsisine bırakın. 300-µm vibratome soğutucu kullanarak veya vibratome tepsi çevresinde buz yerleştirerek kalın dilim yaklaşık 1 ° C sıcaklıkta olun.</li>
		<li>Düz boya fırça kullanarak, 37 ° C'ye ısıtılmış oksijenli ACSF kurtarma içeren banyo hippocampus (6 dilim başına yarıküre) içeren dilimleri birikir</li>
		<li>Dilimleri için en az 45 dk. ACSF-kurtarma banyoda bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları
<ol><li>Amaç altında konumlandırılmış bir banyoda yerde Hipokampal bir dilim ayarla (büyütme: 40 x, sayısal Diyafram: 0,8) lazer tarama iki fotonlu mikroskop. Sürekli banyo oksijenli ACSF-normal 2.5-3 mL/dk hızında 30-32 ° C'de ısıtılmış sıvı.</li>
	<li>Kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) veya Dodt-SGC mikroskobu bir hücre boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgi bulmak için kullanın. Not: hedeflenen nöron nüfus bağlı olarak bir transgenik fare modeli kolayca ilgi hücreleri bulmak için kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı Floresan ışık kaynağı kullanımı ile yedek olabilir.</li>
	<li>Stimülasyon pipet kırmızı fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren bir ACSF-Normal çözüm ile doldurun.</li>
	<li>(Bir elektriksel stimülasyon birimine bağlı) stimülasyon pipet faiz hücre olarak aynı bölgede yolgösterendir üstüne dilim ayarlayın.</li>
	<li>Böylece ucu doğrudan ilgi hücre yama pipet yama çözüm ile doldurma ve bir kafa Sahne Alanı'na eklemeyi sonra dilim üzerinde ayarlayın.</li>
	<li>Bir şırınga üçlü stopcock sığacak ve yama-pipet plastik tüp yoluyla bağlayın. Sürekli pozitif basınç yama pipet enjekte (≈ 0.1 mL) kullanarak. Stopcock "Kapat" konumda tutun.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü etkinleştirmek ve "VC" butonuna basarak gerilim tipi kelepçe moduna geçin. Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı (örneğin, clampex) Elektrofizyolojik sinyalleri edinmesinin açın ve o sürekli olarak izlemek gerekli olan bir kare gerilim darbe (5 mV, 10 ms), göndermek için "Membran Test" simgesine tıklayın pipet direnç değişiklikler.</li>
	<li>Hedef hücrenin sağ üstteki kadar yama pipet indirin. Yapımı üzerine hücre membran ile iletişim, "açık" pozisyona stopcock kapatarak baskıyı kaldırmak. Not: Hücre zarı ile temas küçük bir artış zaman pipet direnç olarak algılanır (≈ 0,2 MΩ) görülür ve hücre üzerinde küçük bir girinti pozitif basınç tarafından neden olur.</li>
	<li>Hafif bir negatif basınç yazılım tarafından sağlanan pipet direnç 1 GΩ ulaşıncaya kadar stopcock monte boş bir Ģırınga kullanarak düzeltme eki pipet uygulanır. Veri toplama yazılımı 'Membran Test' penceresinde hücre -60, kelepçe mV.</li>
	<li>Hücre açılır ve hücre içi tüm yapılandırma elde kadar negatif basınç uygulayarak devam edin. Bu hücre durum tespiti (gelen 1 GΩ için 70-500 MΩ interneuron türüne bağlı olarak) pipet direnç ve büyük kapasitif geçişler 'Membran Test' penceresindeki görünümünü ani değişiklik üzerine kuruludur.</li>
</ol>4. İki fotonlu Ca2 + görüntüleme
<ol><li>Eksitatör postsinaptik yanıtlarında ilgilenen varsa, GABAA reseptör engelleyici gabazine (10 µM) ve GABAB reseptör engelleyici CGP55845 ekleyin (2 µM) ACSF banyoda.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü, "CC" butonuna basarak geçerli-kelepçe için yama yapılandırma kümesi ve yanıt olarak geçerli depolarize somatik enjeksiyonları hücrenin ateş deseni kaydetmek (0.8-1.0 nA, 1 s). En az 30 dk yama çözümde mevcut göstergeler ile doldurulacak hücre için bekleyin. Not: Hücrenin alt türü tanımlamak için hücre ateş desen ve etkin özellikleri kullanılabilir; örneğin, hücreleri hızlı yükseliyor. Kayıt ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için) kediler başlamadan önce Difüzyon yoluyla stabilize etmek için gösterge konsantrasyon için önemlidir.</li>
	<li>AP uyarılmış kediler<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak görüntüleri alma başlatın. Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun. Görünür bir yanıt sağlamak için AP backpropagation verimliliğini önemli ölçüde mesafe GABAergic interneurons22ile düşebilir gibi proksimal dendrite (≤ 50 µm) öncelikle, seçin.</li>
		<li>'Dikdörtgen Aracı' görüntü alma yazılımı kullanarak hedeflenen bölgesine yakınlaştırmak ve geçiş "xt" (Lınescan) modu. Pozisyon karşısında faiz dendritik Şubesi tarama. Lazer yoğunluğu denetleyicileriyle edinme yazılımında İki fotonlu lazer temel yeşil Floresans fototoksisite önlemek için sadece biraz görünür nerede en az güç düzeyinde ayarlayın.</li>
		<li>Elektrofizyoloji veri toplama yazılım 'Protokol' pencere ve görüntü alma yazılımı, istenen süre istenen genlik somatik bir geçerli enjeksiyon içeren bir kayıt deneme oluşturun.<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak, "kaydı Başlat" düğmesini tıklatın ve floresan sürekli olarak 1-2 s. tekrarı için resim alma 3 - 10 kez elde etmek. Bekle en az 30 s duyarlilik önlemek için tek taramalar arasında. Linescans bir dendrite boyunca birden çok noktalarda alınıyor, onları sipariş etkilerinden korunmak için rasgele sırada almak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically uyarılmış kediler<ol>
<li>Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun.</li>
		<li>Stimülasyon pipet faiz dendrite yukarıda dilim yüzeyinde ayarlayın. Yavaş yavaş stimülasyon pipet yerine, tüm hücreli yapılandırma rahatsız edici önlemek için hareket en aza indirin. 10-15 µm dendrite üzerinden, pipet getirin.</li>
		<li>Görüntü alma yazılımı sinaptik microdomains aspiny dendrites konumunu görmek için geçin 'xt' (Lınescan) modu ve hat boyunca faiz dendritik dalı konumlandırın.</li>
		<li>'Protokol' penceresi (Toplam Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı) ve görüntü alma yazılımı, stimülasyon birimi deneme başladıktan sonra tetikleyen bir kayıt deneme oluşturun.</li>
		<li>Satın alma yazılımı kullanarak 30 bekleyen 3 - 5 kat, 1-2 s. tekrar Alım için sürekli dendrite boyunca taramak için "kaydı Başlat" düğmesine tıklatın s duyarlilik önlemek için taramalar arasında. Not: Tarama uzunluğu uyarılmış etkinliğin Kinetik bağlı olarak ayarlanabilir, ancak duyarlilik önlemek için indirilmelidir ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için).</li>
		<li>4.5.5 farklı koşullarda (örneğin, farklı yoğunluk/uzunluğu stimülasyon, giriş bir farmakolojik engelleyici, vb) bağlı olarak ele alınıyor sorularınıza arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Hücre sağlığı bozulan belirtileri gösterdiğinde satın durdurmak: -45 aşağıda depolarizasyon mV, temel Ca2 + düzeyi, dendrites (örneğin, blebbing, parçalanma; bkz: Tablo 2 morfolojik bozulma artış sorun giderme için).</li>
		<li>Hücre morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipet konumunu kaydını tutmak için bir yığın Z -kırmızı kanalı hücreye alması. Satın alma yazılımı kullanarak 'xyz' modu, tüm işlemler dahil tüm hücreyi görüntüye yığın üst ve alt sınırları ayarlayın. 'Adım boyutu' 1 µm ayarla ve "Start kayıt" düğmesini kullanarak yığın alma işlemini başlatın.</li>
		<li>Ne zaman Z-yığın alma tamamlandığında, tüm odak planları yığının üst üste ve alım kalitesini doğrulamak için yazılımda "Maksimum projeksiyon" seçeneğini kullanın. Sonra yavaş yavaş dışarı dilim yama pipet geri çek.</li>
		<li>Post hoc morfolojik tanımlama için dilim düzeltmek için hızlı bir şekilde dilimi bir düz boya fırça kullanarak banyodan kaldırın ve arasında iki filtreyi bildiri, ACSF dolu bir Petri kabına yerleştirin. ACSF % 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm ile değiştirin ve 4 ° C oda veya buzdolabı bulaşık gece bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immünhistokimya Post Hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre için
Not: PFA fiksasyonu 1 geceden sonra dilimi fosfat tampon (PB) sodyum azid (%0,5) ile ilâ 1 ay depolanabilir.
<ol><li>Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik çözüm (TBS) Triton X-100 (% 0.3) ile dilim koyun ve 4 yıkama (5-10 dk her) gerçekleştirin.</li>
	<li>TBS-Triton içinde dilimi koymak % 0,3 ile % 10 normal keçi serum (NGS) 1 h için.</li>
	<li>Dilimi koymak TBS-Triton içinde % 0,3 ile % 1 NGS bir Streptavidin Birleşik fluorophore (örneğin, Alexa Fluor 546 Birleşik Streptavidin, 1: 200) için kuluçka gecede.</li>
	<li>4 yıkama TBS. içinde kez (5-10 dk)</li>
	<li>Dilimleri mikroskop slaytlar ve görüntü confocal mikroskop kullanarak bağlayın. Tam hücre yeniden sağlamak için bir Zelde-yığın (adım boyutu: 1 µm) 20 x amacı istimal. Alexa-546-Birleşik bir etiket görüntüleme için kullanım 543 nm lazer ve 515-560 nm algılama filtre ayarlayın.</li>
</ol>6. kedi analizi
<ol><li>Kırmızı ve yeşil kanallardan Lınescan görüntülerde faiz (ROIs) bölgelerinden Floresans verileri ayıklar ve gürültüyü azaltmak her koşul için birden fazla yinelenen değerlerin ortalamasını. Not: Lınescan Alım dendrite gerçekleştirildiğinde, dendritik microdomains (2-5 µm) karşılık, birden çok ROIs veri ayıklamak mümkün olduğunu ve böylece Ca2 + sinyal Bölünebilme çalışma izin.</li>
	<li>Her yatırım Getirisi için Ca2 + genlik değişimler hızlı: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Not: Burada G yeşil kanaldan; Floresans değerdir G0 temel floresan yeşil kanal öncesi stimülasyon döneminde değerdir; R kırmızı kanal18floresan değerdir. İki fotonlu uyarma son derece lokalize ve önemli bir arka plan oluşturmaz, arka plan Floresans çıkarma gerekli değildir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.

Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitimi için iki fotonlu Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca2 + çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde girişleri entegre ve soma ile iletişim kurmak için mükemmel bir araç yapar. Ancak deneme süresi göz önüne alındığında, özellikle dikkat hücre sağlık için böylece dendrites duyarlilik önlemek için düşsel lazer güç kullanımını sınırlama tarafından ödenmesi gerekiyor. Bu aynı zamanda yakınlaştırma düzeyini azaltmak, tarama süresi azalan ve artan inceden inceye gözden geçirmek hız resim alma sırasında elde edilebilir. İnterneuron dendrites görüntüleme ek zorluklar tanıttı. Dendrites bu hücreler yok dikenleri gibi dendrite tarama postsinaptik Ca2 + microdomains lokalizasyonu kolaylaştırmak için önerilir. Buna ek olarak, bir yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi göz önüne alındığında, daha küçük ve daha yavaş--dan o piramit hücreleri dendrites içinde oluşturulan Ca2 + yükselmeler interneuron dendrites içinde. Bu Ca2 + sinyal Kinetik uygun şekilde açıklamak için bireysel linescans yeterince uzun bir süre yanı sıra ortalama için birkaç Lınescan görüntüleri elde etme gerektirir.
İki kutuplu teta-cam elektrot kullanarak yerel elektrik stimülasyonu dendritik postsinaptik Ca2 + microdomains karakterizasyonu için yararlı bir araç temsil eder. Ancak, hala farklı "en anpasan" aksonlar belirli bir bölgesinde bulunan etkinleştirebilir. Aktif girişleri sayısı bu durumda bilinmeyen ve sadece ek Hesaplama araçları kullanarak tahmin edilebilir. Aynı anda birden çok bireysel sinapslarda uyarılması için sağlayan iki fotonlu Glutamat uncaging27, yerel dendritik Ca2 + yanıt almak için iyi bir alternatif temsil eder. Bu yöntem eksitatör postsinaptik yapıları (dikenleri) açıkça tanımladığınız, asıl hücrelerinin çalışma için yaygın olarak kullanılan ancak iyi interneurons, hangi genel olarak düşük omurga yoğunluk var çalışma için uygun değil. İnterneuron dendrite boyunca uncaging Glutamat asıl hücrelerine uygulanan gibi kaçınılmaz etkinleştirmek9,10yorumlamak zorlaştırır, sinyal verme Ca2 + birden çok extrasynaptic mekanizmaları gözlemler.
Son on yılda iki fotonlu Ca2 + görüntüleme için geliştirilmiş zamansal çözünürlük optik teknolojileri gelişmeler teklif etti. En umut verici acousto optik yansıtıcılar (AODs)28,29ile rasgele erişim mikroskobu (rampa) biridir. Tarama geleneksel raster rampa seçili makas-in ilgi yüksek frekansta atalet-Alerjik AODs hızlı hız yanında etkin tarar. Doğrusal bir desen koyulur Puan sınırlı olmadığından birden fazla dendritik dalları, eş zamanlı çalışma için idealdir. Ancak, AODs tarafından sunulan daha yüksek zamansal çözünürlük milisaniye aynı odak planı içinde yüzlerce süren Ca2 + olayları görüntüleme gereksiz olabilir. Ayrıca, Puan faiz aynı yapısı içinde tarama konum nedeniyle mikro-sürüklenir dilim müstahzarları iyi dilim kalitesi için gerekli olan yüksek perfüzyon oranı ile ilişkili denetimi için zor olabilir. Bu nedenle, bu makalede sunulan yüksek zamansal çözünürlük (500-700 Hz) Lınescan tabanlı Alım yöntemi Ca2 + sinyalleri bireysel dendritik dallarında Imaging hala tercih edilir.

Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum1' bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca2 + görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.
Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu2den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.
Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri3görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca2 + görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda4arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca2 + oldu, sağlam doku5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca2 + görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites5,6,7,8,9,10,11' sinyal Ca2 + .
Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü'nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca2 + yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal12 açık ve nispeten genel Ca2 + geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri13' te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca2 +harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca2 +-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs6,14,15. Son olarak, belirli koşullar11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca2 + olaylar oluşturulabilir.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca2 +-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca2 + dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca2 +-duyarsız boya ile yeşil Ca2 + göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca2 +-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca2 + görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca2 +], [Ca2 +]017 dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır , 18. Ayrıca, Floresans değişikliklerimutlak Ca 2 + konsantrasyonları19açısından kalibre edilmesi.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca2 + görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca2 + dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca2 + göstergeleri son derece mobil eksojen Ca2 + hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca2 + göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.
Biz iki fotonlu Ca2 + görüntüleme yöntemi Ca2 + dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 incelenmesi için uyarlanmış , 22. asıl nöronlarda erken Ca2 + görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri20 farklı olan fonksiyonel Ca2 + mekanizmaları çeşitli vitrin , 23 , 24. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca2 + geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca2 + daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca2 + dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.
Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

Kalsiyum (Ca2 +) görüntüleme intrasellüler Ca2 + sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA2 + dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca2 + sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca2 + arada yoluyla, yerel Ca2 + dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca2 + geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitim için uygulanır.

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, şekil 1Bmesafe bağımlı düşüş göstergesi) artan mesafe olarak backpropagating APs tarafından indüklenen kediler genliği bir düşüş görülmektedir. (Alexa Fluor 546 Streptavidin Birleşik kullanarak) immünhistokimya sonra biz biocytin hücre etiketleme almak ve kaydedilen nöron bistratified hücresi olarak stratum oriens ve stratum radiatum (şekil işgal bir akson ile tanımlamak başardık 1 C). ikinci denemede stimülasyon pipet distal dendritik siteye getirildi. Dendrite tarama, biz o zaman elektrik stimülasyon aksonlar geçiş yanıt olarak verilen dendritik dalında (şekil 2A-C) postsinaptik Ca2 + sinyal genliği değerlendirmek başardık. Postsinaptik kediler komşu dendritik microdomains (Bölüm 1-6; arasında farklılık Şekil 2B), hangi Ca2 + sinyal başlatma ve/veya farklı postsinaptik mekanizmaları dahil bölgeden yayılması ile ilişkili olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig1.jpg"> Resim 1: AP uyarılmış Ca2 + geçişler temsili örneği. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron (13 µm) yığını (20 µM). Beyaz çizgiler linescans uzunluğu ve konumunu gösterir. C.top izlemesinde gösterilen yerlerde elde edildi kediler gösterilen (B) izleri somatik geçerli enjeksiyonuyla deneme kayıt sırasında oluşturulan kısa AP tren gösterir. Zaman ölçeği üzerinde gösterilen tüm izlerini aynıdır. (C) maksimum projeksiyon confocal Z-biocytin hücre etiketleme gösterilen yığını. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56776/56776fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig2.jpg"> Resim 2: bir patlama elektriksel stimülasyon (100 Hz değerinde 3 uyaranlara) tarafından uyarılmış postsinaptik Ca2 + geçişler. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron gösterilen yığını (148 µm). Beyaz ok uçları aksonal Terminal interneuron bir sepet hücredir düşündüren piramit katman içinde gidin. Nerede stimülasyon elektrot yerleştirildi dendritik şube gösteren (B) tek odak düzlemi. Kesikli çizgi (C1 ve C2) gösterilen Lınescan konumunu gösterir. (C) görüntüleri (1; kırmızı bir Lınescan sonucunu gösteren Alexa-594; 20 µM) ve yeşil (2; Oregon yeşil Bapta-5N; 300 µM) kanalları. Görüntüleri Ca2 + geçişler (kediler) gösterilen 30 µm. (D) izleri C2 hücresindeki görüntülenen kesimleri içinde elde edildi yanıt yayılmasını analiz etmek için daha küçük bölümler halinde binned. En iyi izleme elektriksel stimülasyon somatik düzeyinde görüntüleme duruşma sırasında kaydedilen gerilim cevaben gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56776/56776fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Çözüm</td>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Konsantrasyonu (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-Normal</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-kurtarma</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-sükroz</td>
			<td>KCl</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sükroz</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">K+-yama çözüm tabanlı</td>
			<td>K+- glukonat</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphocreatin di (tris) tuz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP-Tris</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>GTP-Tris</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biocytin</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa-594</td>
			<td>0,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oregon yeşil-BAPTA-1</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: çözüm tarifleri. Bileşikler ve konsantrasyonları iletişim kuralı sırasında kullanılan çözümleri için.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sorun</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yapamaz-e doğru yama sağlıklı nöron</td>
			<td>Onay işaretleri dilimleri sağlıksız için: çekmiş veya şişmiş hücreleri, görünür hücre çekirdeği, vb. Eğer öyleyse, dilimleri atmak. Ayrıca yama-pipet direnç ve yama-çözümün osmolalite doğrulayın; değerleri uygun aralığında değilse bunların yerine.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrites sinyalini Floresans düşüktür</td>
			<td>Hücreyi doldurmak uzun bekleyin. Bir tıkanıklık hücreye Difüzyon yama-çözüm tutuyor yama-pipet negatif basınç az miktarda uygulamak deneyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektriksel stimülasyon Ca2 + yanıt evoking değil</td>
			<td>Bir eşya Elektrofizyolojik kayıt varlığı için kontrol edin. Eğer yok, onay için bir kısa-devre/uyarıcı birim arızası. Varsa, stimülasyon yoğunluğu artırmak veya stimülasyon pipet daha yakın dendrite için hareket. Stimülasyon elektrot ve dendrite arasındaki mesafe 8 um dendrites doğrudan depolarizasyon sinaptik yanıtları okurken önlemek için aşmaması gerektiğini kaydetti için olduğunu.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uyarılmış Ca2 + sinyal da yüksek/karışırlar Ca2 + göstergesi</td>
			<td>Lazer gücü düşür. Birden çok hücreyi sorun devam ederse, farklı bir göstergesi Ca2 + kullanın, ile bir alt Ca2 + ilgi.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temel Ca2 + sinyal deneme sırasında giderek artmaktadır</td>
			<td>Bireysel taramalar arasında daha uzun bir süre bekleyin. Temel artıyor, durdurmak satın alma; Bu hücrenin sağlık büyük olasılıkla kötüleştiğini gösterir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taramalar sırasında Ca2 + sinyal genliği azalır</td>
			<td>Lazer güç azaltmak veya (varsa) vınlamak dışarı.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrite ("blebbing") taramadan sonra parçalanan</td>
			<td>Lazer gücü düşür yakınlaştırabilir veya uzaklaştırabilirsiniz. Blebbing için hedeflenen dendrite sınırlı ise, başka bir dendrite seçin ve lazer gücü azaltmak / vınlamak dışarı. Birden çok dendrites blebbing varsa, satın alma durdurmak.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Floresan sinyallerini "tarama haddimi piyango sonra geliyor"</td>
			<td>Dilimi hareketinde ACSF perfüzyon hızını azaltarak azaltın. Önce yama, yapmak emin dilimi güçlü bir ağ tarafından yerinde sabittir.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: tablo sorun giderme. Deney Imaging bir Ca2 + sırasında ortaya çıkabilecek ilgili genel sorunların çözümleri.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Görüntüleme.  Université Laval. Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biyoloji

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Davranış

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...