Yazarlar süreç geliştirme ve cihaz imalat değerli destek için ChiLab, malzeme ve Microsystems laboratuvar - Politecnico di Torino - DISAT, Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza ve Dr. S L Marasso, bizzat kabul etmek istiyorum. Victor Racine Quantacell üzerinden tartışma ve görüntü işleme desteği için teşekkürler. GFP LifeAct fareler ile bize sağlamak için hayvan tesisin Institut Curie destekleri için fare ve Pablo Vargas ve Ana-Maria Lennon (Institut Curie) Isabelle Grandjean ve Manon Chartier için sana şükrediyoruz. Olivier Thouvenin Institut Langevin ve Clotilde Cadart, Larisa Venkova ve Matthieu Piels üzerinden Institut Curie - UMR 144, Floresans dışlama yöntemi anlamada yardım için minnettarız. Nihayet, Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) teknolojik platform desteklerinden dolayı microfabrication içinde teşekkür ederim. Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi gelişmiş Grant No 321107 tarafından "Çello," kısmen desteklenen PSL Université (SwithNeuroTrails Projesi), ANR Investissement d'Avenir ve IPGG Labex ve Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Birim görüntüleme nöronların uzun ve ince uzantıları bu hücreler nedeniyle FXm tekniği için bir meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir. Bu iletişim kuralı aynı nöron görüntüleme için adanmış mikrosıvısal aygıt türü türevleri açıklar.
Mikrosıvısal tasarım yönleri, yanında objektif seçimi Floresans dışlama görüntüleme için esastır ve yanal çözünürlük ve görüntü netliği arasında bir denge anlamına gelir. 13 ' te odak derinliğe kadar Oda yüksekliği daha küçük önde gelen yüksek bir NA görüntüleme odak gerçekleştirdiyseniz ve ben nesnenin kontur arasında yeterli bir kenar boşluğu bırakıldığı takdirde birim ölçü duyarlık için zararlı olmadığını gösterilmiştir nterest ve entegrasyon yüzeyi sınırları. Ancak, odak derinliği yüksek bir odası kullanımı faiz nesnelerin kenarlarını foton difüzyon, hangi düzgünleştirir nedeniyle görüntü netliği bozar. 3 µm yüksek odası imalatı bu yanal bulanıklaştırma azaltılmış ve son derece iyi tanımlanmış floresan dışlama görüntüleri bile yüksek NA kullanarak sağlanan (0.8) 40 X hedefleri nöronal dalları yüksek yanal çözünürlük ile görselleştirmek için.
Montaj çip bir kritik adım, özellikle söz konusu olduğunda 3 µm yüksek chambers, ama dikkatli işleme 4.1.2 içinde açıklandığı gibi çatı çöküşü önler. Bu ince odalarına ilişkili hacim oranı yüksek yüzeye de zamanla Dextran konsantrasyon kararlılığını gündeme. Biz Dextran yüzey emilimini kuluçka bir geceden sonra önemsiz kontrol ettirin: PBS tarafından Dextran değiştirdikten sonra yoğunluk farkı ayağı ile arka plan arasında yaklaşık 1000 arasında ilk yoğunluğu kontrast başına 1 oldu Bu iki bölgenin Dextran huzurunda. Nöronların alt coverslip hem PDMS çatıda uygun unutmayın. Desenli coverslips (ne zaman PDMS odası içinde yapışkan molekülleri kuluçkaya değilYani ), kaplama olarak kullanarak bu nedenle kesinlikle odası dibinde yerelleştirildiğinde bu etkisi kaybolur.
Gerçeğini yöntemi, Yani dextran endositoz, büyük sınırlandırılması biridir çok sınırlı nedeniyle zorlu onların morfolojisi dışında nöronlar FXm için oldukça uygundur bu hücrelerde. Bir 10 seçtiğimiz kDa formülasyonu uzun bastırmak için aralığı (saat) herhangi görünür endositoz olayları.
Sonuç olarak, FXm kavramsal sadeliği bir dizi nanometric PDMS pürüzlülük ve micrometric odası yükseklik veya eşitsizlik için düzeltmek için arka plan düzeltme gibi mevcut protokolü tarafından çözüldüğünü deneysel sorununu tarafından dengelenir sütunlar arasında PDMS tavan. Ancak, floresan orta sınırlamak için yakın mikrosıvısal odası kullanımı birkaç belirli kısıtlamalar etkili yüzey hücre adezyon veya merkezden soma dışlamak için zorunluluk için kullanılabilir düşüren destek ayağı, ihtiyaç gibi verimleri odası nöronal uzantıları yüksek çözünürlüklü gözlem için erişilebilir hücre bölgelerinde kısıtlar en yüksek netlik ile gözlemlemek için. Bu yöntemin olası bir evrim optik bir tarafından değiştirilmesi bu fiziksel doğumdan kurtulmak olacaktır. Hafif levha mikroskobu yeni gelişme avantajlı FXm ile gelecekte birlikte.

Hücresel biriminin kesin bilgi hücre boyutu homeostazı tek hücreli mikroorganizmalar 1 ve daha genel olarak Mitotik hücre 2' deki sayısında tarafından tahrik son yıllarda artış dikkat çekti. Ancak, hücre hacmi için nöronlar paradigmatik bir örnek teşkil da sonrası Mitotik hücreler için ilgili sorunu.
Gerçekten de farklı ölçekler ve zaman-Puan fizyolojik ve patolojik olayların önemli bir imza elektriksel aktivite (milisaniye ölçek) 3 ' e geri dönüşü ile ilişkili geçici aksonal deformasyon gelen nöronal hayatında birimdir nöronal nörodejeneratif hastalıklar (insanlarda yılda) 4, asemptomatik aşamasında meydana gelen şişlik. Ancak, gün veya hafta (bağlı olarak düşünülmüş organizma) nöronal büyüme sırasında bir ara zaman ölçeği içinde en büyük birim değişikliği oluşur. Nöronların uzun ve karmaşık morfolojisi arasında hangi katları sorunlara yol açtı hücre boyutu düzenlenmesi. Aksonal uzunluğu ve çapı gerçekten sıkı bir şekilde düzenlenmiş vivo içindeher nöronal tip 5,6için belirli değerleri vardır.
Vivo, adrese karmaşık bu sorunları da basitleştirilmiş bir şekilde ele alınması tüp bebek. Bu amaçla adanmış Birim ölçümü için hızlı bir yöntem yeterli büyüme dinamikleri (Yani bir zaman ölçeğinde dakika) ve uyumlu saatler veya günler içinde gözlem ile takip etmek gereklidir. Yılda bir hücresel birim içinde vitrodoğrudan veya dolaylı erişim sağlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Hücre imar confocal görüntüleme üzerinden onlardan biri, ama bu yöntem yaklaşık 500 nm 7sınırlı Aksiyel çözünürlüğe gösterilen süre etiketleme ve tekrarlanan pozlama ışık anlamına gelir. Bu iki son sakıncaları kısmen kafes ışık sayfalık mikroskobu 8isimli daha sofistike ve son yöntemi tarafından üstesinden vardır unutmayın. Atomik kuvvet mikroskobu kullanılan 9 oldu ama bu tarama yöntemi tarafından yavaş ve sıkıcı özüdür. Ayrıca, fiziksel temas ile hücre gerektirir nöronlar 10aşırı yumuşaklığını dikkate alınarak ölçüm ile etkileşebilir. Empedans veya rezonans kullanarak dolaylı yöntem istihdam için 11farklı hücre türleri ama yetersiz yapışkanlı hücrelerin nöronlar gibi genişletilir.
En umut verici yöntemlerden birini hücreleri floresan bir boya ile dolu bir yakın odasında dışlanan hacmi ölçüsü temel alır. Floresans dışlama yöntemi (FXm) hiçbir etiketleme gerektirdiğinden, prensip olarak basittir ve hücre popülasyonlarının potansiyel olarak alt optik Aksiyel çözünürlüğü ile hızlı, uzun vadeli optik görüntüleme için uygundur. Gürültü çeşitli kaynaklardan bu nihai çözüm sınırlamak daha doğrusu, z çözünürlükte maksimum floresan yoğunluğu odasında kameranın dinamik alanı tarafından bölünmüş kültür (Yani bölgedeki hücreleri yoksun) bağlıdır. Bu yöntem çok güçlü geçirme yapışık hücreleri 12 hacmi takip etmek veya birim değişikliği sırasında mitoz iyice 13açıklandığı gibi memeli hücrelerinin çalışma olmuştur. Ancak, nöronlar için onların geniş yaklaşım alt micrometric süreçlerini göz önünde bulundurarak FXm metodolojik bir meydan okuma teşkil.
Burada düzgün FXm odaları imalatı için yüksek hassasiyetli birim ve nöronal dalları ve dinamik yapılar büyüme koni gibi nöronal büyüme dahil yüksekliği ile erişmek için önde gelen bir yöntem mevcut.
Chambers Aksiyel çözünürlük iyileştirmek amacıyla ölçmek için nesne daha benzer boyutlara sahip olmalıdır. Bu nedenle, biz üç farklı yükseklikte Merkezi ölçüm Odaları tarafından karakterize farklı FXm cihazlar tasarlanmıştır. En ince (3 µm) yüksekliği neurite ölçüm için adanmış: hangi çevre 15 µm yüksek orta odası içinde kalmak soma, bu düşük yükseklik dışlar. Daha kalın Merkezi chambers (10 ve 12 µm) bütün hücre büyüme takip için yeterince yüksek. Cihazın Ayrıca Merkezi odasının her iki tarafında bulunan iki rezervuarlar içerir. Dört enjeksiyon delik (ıh) böylece uygulanır ve aşağıdaki gibi belirlenir: diğer iki rezervuarlar besleme ise hücresel süspansiyonlar çipin tanıtmak için giriş ve çıkış hizmet.
İlk fabrikasyon kalibrasyon coverslips bilinen geometri fotorezist yapıları kullanarak yükseklik ölçüleri için var. Biz-sonra yansıma ücretsiz büyüyen nöronlar, ama aynı zamanda morfolojik kısıtlanmış nöronlar yapışma micropatterns.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Birim nöronların farklı zaman ölçeklerde fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Nöronlar oldukça benzersiz hücre ile ilgili onların genişletilmiş ramified türleri morfoloji ve sonuç olarak ses ölçüm için birkaç metodolojik sorunlar yükseltmek. Vitro nöron büyüme özel durumda seçilen metodoloji dakika zaman ölçekten saat veya gün için tam alanlı gözlem ile birlikte alt micrometric eksenel çözünürlük içermelidir. Confocal görüntüleme, elektrikle tabanlı ölçümleri veya Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücre şekli yeniden yapılanma gibi diğer yöntemlerinden farklı olarak, son zamanlarda geliştirilen Floresans dışlama yöntemi (FXm) bu zorlukları karşılamak için potansiyele sahiptir. Ancak, onun ilke olarak basit olmasına rağmen birden fazla ayarlamaları ve adanmış bir metodoloji nöronlar için yüksek çözünürlüklü bir FXm uygulanması gerektirir. Burada Floresans dışlama, düşük-pürüzlülük çok bölmeleri mikrosıvısal aygıtlar ve nihayet yerel nöronal birim vitro ölçümleri elde etmek için micropatterning kombinasyonuna göre bir yöntem mevcut. Aygıt tarafından sağlanan yüksek çözünürlüklü nöronal işlemleri (neurites) yerel birim ve belirli bazı yapılar büyüme koniler (GCs) gibi nöronal büyüme dahil hacmi ölçmek izin verdi.

1 ve 2 bölümlerinde açıklandığı imalat sürecinin sonucu şekil 1Agörüntüleri tarafından resimli-1B ve şekil 1 ceğrisi. Şekil 1 d PDMS çip, Yani orta ve 20 µm yüksek sonraki orta odası iki farklı temsilcisi alanı pürüzlülük değerlerini görüntüler. Pürüzlülük yaklaşık 7 faktör tarafından bir düşüş yerine SU-8 fotorezist kazınmış Si gofret kullanarak elde edilmiştir. O zaman, FXm ilk 10 µm yüksek odası içinde bilinen geometri (şekil 2A) fotorezist şerit üzerinde uygulandı. Görüntü işleme ve yoğunluk yükseklik dönüşüm sonra (bkz. şekil 2Bgrafik) kesit bu Şerit (şekil 2C) boyunca üzerinde gerçekleştirilen FXm profilleri sağlar istenilen yükseklik profilleri (şekil 2B). Şekil 2B mekanik profilometrisi ve FXm yöntemleri kullanılarak elde profilleri arasında karşılaştırma gösterir. Kenar ve yayla değer, dahil olmak üzere bu profiller, doğrulama yöntemi çok benzer. Not FXm veri saçılma olarak daha fazla şekil 3 ve şekil 4, değerlendirildi yönteminin son çözünürlük temsilcisi değildir ama çok zayıf bir olası etkisini önlemek için düşük yoğunluklu sonuçlarından istihdam Auto-Floresan, GFP kanaldaki fotorezist.
O zaman, biz neurites 3 µm ve 10 µm yüksek chambers (şekil 3) gözlenen. Yaklaşık 18 arka plan gürültü standart sapmasıdır nm yoğunluğu için yükseklik dönüşüm ve arka plan düzeltme sonra. Bu değer biraz yüksek--dan fiziksel PDMS yüzeylerde döküm silikon yüzey pürüzlülüğü (12 nm, şekil 1 dtablo bkz:) ama SU-8 kalıpları PDMS üzerinde ölçülen pürüzlülüğü elde daha çok daha düşük. Bu sonuçlar ayağı oyuncular için SU-8 fotorezist delik açmak yerine silikon gofret kuyu sondaj, katma değer vurgulayın. Düşük bir değer şekil 3Aiçinde görüntülenen bir birimdeki bir yüksek sinyal-gürültü oranı ve çok net görüntüler sağlar. Böyle görüntüleri alınabilmesi için veri örneği, biz 1,6 µm (Yani 10 piksel) geniş neurite hacmi hesaplanan (bkz. şekil 3Bgrafik) dilim. Bu veri doğrusal bir uyum içinde bir ilk yaklaşım kullanarak verir ortalama neurite yükseklik değeri yaklaşık 400 nm 500 nm aksonal çapı bulundu 10 gün içinde eski pups içinde corpus callosum 5 örneğin ile karşılaştırılmak üzere,. Ayrıca micropatterns oluşan seri olarak abutted 2 µm ve uzunluğu 30 µm 6 µm geniş çizgili yapıştırılması ile FXm birlikte. Amacımız neurite genişliği etkisi 3D şeklini çalışma olmuştur. Şekil 3 c 10 µm yüksek odasında elde edilen bütün nöron görüntünün yanlış renkte bir 3D temsil gösterir. Soma en büyük şerit ekstremite üzerinde bulunan, ancak Neurites 2 µm ve 6 µm geniş çizgili, yayılıyor. Yükseklik profilleri içinde üç farklı kesit çizildi. Şekil 3Aiçinde görüntülenen grafik ile tutarlılık içinde yüzey neurite genişliği (3D şekil) ile kesit artışı üzerinde entegre.
Biz de büyüme Koni (GC) 3D yapılar üzerinde duruldu. Şekil 4 A-B hangi dallı alt yapılarını vurgulamak bir 3 µm yüksek odasında, elde edilen iki farklı GC profillerini görüntüler. Buna ek olarak, GCs bir 12 µm yüksek odasında hacmi dinamikleri takip etmek zaman hata deneyler yapılır. Şekil 4 c daralma bir döngüsü ve birkaç dakika onlarca zaman ölçeğini içinde belirli bir GC reaktivasyonu görüntüler. GFP-lifeact fare kullanımı sayesinde, büyüme koniler GFP emisyon dalga boyu içinde lokalize (510 nm)--dan onların yüksek aktin konsantrasyon. Dalga boyu belirlenen yüzey dextran emisyon dalga boyu, 647 üzerinde entegre etmek için kullanılan nm GC birim hesaplamak için. Şekil 4 d sonunda yaklaşık 6 µm3değerini üzerinde ortalanmış üç farklı nöronlar GC birim farklı zaman noktaları ve konumu itibariyle dağılımı gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Şekil 1: FXm PDMS chambers. (A) şemaları microfabrication son kalıp önde gelen dört farklı ana adımları. Giriş, çıkış ve su depoları konumunu belirtilir. Ölçek çubukları: 1 mm. (B) PDMS FXm odası bir optik profilometer kullanılarak elde görüntüsü. Bu görüntü 10 µm yüksek sütun ve 3 satır ve yüksekliği 20, 50 ve 90 µm ara odaları içeren orta odası gösterir. Ölçek çubuğu: 500 µm. (C) (B) çizilmiş iki kesik çizgiler boyunca çipin kesit görünümü. Sarı/altın: kesiti boyunca sütunlar, mavi: kesit sütunlar arasında. (D) PDMS pürüzlülük değerleri ölçülen üzerinde 50 × 50 µm2 alanları silikon ve 20 µm yüksek SU-8 orta odası kalıp demek (oklar bu alanların konum için bakınız). Ortalama değerleri üç farklı alanlarda ölçümleri elde edilmiştir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Şekil 2: Kalibrasyon fotorezist şerit ilgi nesnesi kullanarak FXm yönteminin. (A) bir 10 µm yüksek odasında alınan GFP-floresan görüntü 10.000 MW dextran 488 emici dolu nm'de 1 mg/mL. (B: arka plan, P: ayağı). Gözlem kuru 40 X NA 0,8 amacı ile. Ölçek çubuğu: 50 µm. (B) doğrusal kalibrasyon hukuk fotorezist geçiş A. (C) floresan yoğunluğu profil (A), görüntülenen mavi Kesikli çizgi düzeyde elde gösterilen iki renkli dikdörtgenlerin ortalama yoğunluğu elde Şerit (0,45 µm yüksek pozitif fotorezist). (D) mekanik profilometer (siyah nokta) ve FXm Yükseklik (B) (mavi noktalar) veri dönüştürme sonra yoğunluğu elde profilleri karşılaştırılması. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Şekil 3: Neurite birim görüntüleme. (A) Neurite soma sonraki 15 µm ara odasında bulunan Merkez 3 µm yüksek odanın içine uzanan. 488 10.000 MW dextran emici kullanılarak gerçekleştirilen görüntüleme nm ve 40 X, NA 0,8 kuru amaç. İlave arka plan azaltma rutin olayları kullanımdan sonra iki neurites ve sağdaki grafik çizmek için seçilen elde. Ölçek çubukları: 30 µm. (B) Neurite dilim birim neurite genişliği bir fonksiyonu olarak elde edilen (A) gösterilen 22 profillerinden (ortalama 10 piksel, Yani 1.6 µm "neurite dilim" Tarih olarak). Düz çizgiyi başlangıç noktası geçen yamaç 0,4 µm lineer bir uyum gösterir. (C) bir yapıştırıcı şerit üzerinde desenli bir neuron yanlış renk imajı art arda 2 µm ve 6 µm geniş kütükleri (beyaz olarak temsil edilen) yaptı. Ölçümler 10.000 MW dextran 647 emici dolu bir 10 µm yüksek odasında yapılmıştır nm ve 40 x NA kullanarak 0,8 kuru amaç. (D) yükseklik profilleri aynı tutmak (C), gösterilen renkli kesik çizgiler için karşılık gelen renk kodu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Şekil 4: statik ve dinamik büyüme koni görüntüleme. (A-B) 3 µm yüksek odasında yükseklik dönüşüm ilişkili Albümdeki görüntülenen sarı çizgiler boyunca yoğunluk sonra elde edilen büyüme koni yükseklik profilleri de içerir. 10.000 MW dextran 488 emici ile dolgu kullanılarak gerçekleştirilen gözlem nm ve 40 X, NA 0,8 kuru amaç. (C) bütün nöron görüntüleme 12 µm yüksek odasında 10.000 MW dextran 647 emici dolu nm. Gözlem iki floresan kanallarında yapılan: GFP büyüme koni yerelleştirme (Kesikli sarı çizgiler) ve floresan dışlama birimden GC hesaplamak için CY5 için. Kesikli sarı çizgilerle dahil yüzey GC birim hesaplamak için kullanıldı. Grafik, iki temsilcisi farklı zaman noktalarda GFP ve CY5 kanaldaki GC birim varyasyon zaman ve ilişkili türleri Morfoloji üzerinde gösterir. Tüm verileri bir 40 x NA kullanarak satın alınan 0.8 kuru amaç her 3 dk. ölçek çubukları: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>1:8 µm katman maskesi</td>
			<td>2:30 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pozlama enerji</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>2 dk 30 sn</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Merkez TMMOB yüksekliği 12 mikron içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 20, 50 ve 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>Maske 1:10 µm tabaka</td>
			<td>2:30 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pozlama enerji</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>2 dk 30 sn</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: yüksekliği 10 mikron merkezi bir odası içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 20, 50 ve 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>1:12 maske µm tabaka</td>
			<td>2:32 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 5 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çekim hızı</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 5 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>3 dk.</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: yüksekliği 3 μm kalınlığında bir orta odası içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 18, 50 ile 90 µm.
Ek veri 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Şematik PDMS aygıt (DRIE maskesi ve maskeleri 1-3) imal için kullanılan maskeler. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 2: dosyasını "masks_neuron_volume_chips.dxf". DRIE maskesi ve maskeleri 1-3 imal etmek izin elektronik dosyaları. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Fotorezist çizgili fotolitografi için kullanılan maskeyi imal etmek izin elektronik dosyaları. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 4: conversion_mattotiff.m dosya <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 5: importfilevol.m dosya <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Cilt hücrelerinin fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Biz tam alan ölçüm-in vitro nöron birim neurites ve dinamik yapıları nöronal artışa örtülü analizi için gerekli alt micrometric eksenel çözünürlük ile sağlayan bir floresan dışlama yöntemi açıklanmaktadır.

Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.0K Görüntüleme.  Université PSL, CNRS. Cilt hücrelerinin fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Biz tam alan ölçüm-in vitro nöron birim neurites ve dinamik yapıları nöronal artışa örtülü analizi için gerekli alt micrometric eksenel çözünürlük ile sağlayan bir floresan dışlama yöntemi açıklanmaktadır.

Video: High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...