Biz minnetle, Dr önemli katkılar kabul. John Anderson, Andrew Ana ve bu çalışmanın Shirley Tirrell. Bu çalışma Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme (U50/CCU116806-01-1) ve ABD Tarım Bakanlığı (58-6615-1-218, CONH00768 ve CONH00773) hibe kısmen desteklenmiştir.

1. Sivrisinek sıralama ve kimlik <ol><li> Aşağıdaki prosedürler canlı sivrisinek ile çalışmak için eğitilmiş personel tarafından adanmış bir biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) laboratuar açık bir laboratuvar tezgahı üzerinde yapılmaktadır. &quot;Soğuk zincir&quot; prosedür boyunca korunur. </li><li> 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda sivrisinek toplama torbası koyarak erişkin sivrisinek canlı anestezisi. Kuru buz içeren bir izolasyonlu konteyner Transfer toplama torbası. Kapağını kapatın ve knock-down tam emin olmak için 1-3 dakika boyunca karbon dioksit sivrisinek maruz. </li><li> Kuru buz bir yatağın üzerine yerleştirilen bir ön-soğutulmuş tavada üzerine anestezi sivrisinek dokunun. Plastik kısmı su bardağı ince forseps ve yerinde kullanarak birbirinden ayrı dişi sivrisinekler. Kapak ve ıslak buz üzerinde yer bardak ile kaplayın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu (10-60X zoom) yardımı ile dış sivrisinek morfolojisi dayalı açıklayıcı taksonomik tuşlarını kullanarak türlerin sivrisinek tanımlamak elektronik bir soğuk masaya monte edilebilir. </li><li> Bakır BB içeren 2 ml ek kapaklı şişeleri ≤ 50 bireylerin havuza sivrisinek türü tespit birleştirin. Şişeler, benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenir. </li><li> Tüm sivrisinekler belirlenmesini takiben, şişeleri etiketli torbalara yerleştirilmiş ve kuru buz içeren plastik bir soğutucu düzenlenecek. </li><li> Sivrisinek havuzları virüs testi kadar -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol> 2. Biyogüvenlik sivrisinek virüs izole etmek için düşünceler <ol><li> Aşağıdaki işlemleri 1 çevreleme bu seviyede çalışmak için eğitilmiş personel tarafından bir biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) laboratuvar yapılmaktadır. Laboratuvar olanakları, ekipman, prosedür ve uygulamaları, kurumsal, eyalet ve federal gözetim ve denetimine tabidir. Aşağıdaki protokoller denemeden önce uygun eğitim ve onay isteyin. </li><li> , Tek kullanımlık önlük, eldiven, yüz kalkanları ve solunum gibi her bir işlem için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li><li> Çalışma yüzeyleri tamamladıktan prosedürler öncesinde ve sonrasında% 70 alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSC) hücre kültürleri ve potansiyel olarak bulaşıcı malzeme ele alınır. </li><li> Sivrisinek havuzları bir BSC içine yerleştirilen bir karıştırıcı değirmen homojenize. </li><li> Sivrisinek homojenatlarında sıkı bir aerosol mikrosantrifüj santrifüj. Bu yordamı BSC içinde gerçekleştirilir mümkün değilse işletme ve santrifüj örnekler alınırken, operatör bir maske takmalıdır. </li><li> Pipetler ve BSC (biyogüvenlik kabini) malzeme taşıma pipetlemeyin ipuçları önce otoklav% 10 çamaşır suyu ile ıslatılmış. Tüm laboratuar atık bertarafına kadar önce otoklavlanarak dekontamine. </li></ol> 3. Vero hücrelerinde hazırlanması <ol><li> Çamaşır suyu içeren atık behere konfluent Vero hücreleri (Klon E6) büyük bir doku kültürü balonuna (175 cm 2) Durusu kültür ortamı. </li><li> 5 ml PBS kısım ve hücre tabakası üzerinde ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun balonun kenarları boyunca girdap ekleyerek Vero hücreleri yıkayın. </li><li> Durusu PBS atık behere. </li><li> 2,5 ml tripsin-EDTA ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun hücre tabakası üzerinde girdap ekleyin. </li><li> 37 5 dakika boyunca inkübatörde balon ° C&#39;de,% 5 CO 2. </li><li> Alt yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için yavaşça sallamak ve girdap şişesi. Hücreleri kolayca kaydırarak; hücreleri kolayca kaydırarak yoksa ek bir 1-5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 Minimal Essential Medya mL (MEM),% 5 fetal sığır serumu (FBS), serolojik pipetlemeyin kullanarak ve pipetlemeyin ekle yukarı ve aşağı hücre kümeleri break up için 10-20 kez. </li><li> Toplam hacmi 22.5 mL için ek bir 15 mL MEM,% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 40 küçük doku kültürü şişeleri (25 cm 2) dik iki rafları (20 şişeler / raf) olarak yerleştirin. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde şişelerin bulunduğu raflara yerleştirin ve şişe kapakları önünde yerleştirerek, şişesi kapakları kaldırmak. </li><li> MEM,% 5 FBS serolojik pipetlemeyin kullanarak her balona 4 mL koyun. </li><li> Her balona (~ 01:06 bölme oranı) şişesi kapakları değiştirin 0.5 mL askıya hücreleri koyun. </li><li> Geri kalan hücre süspansiyonu (~ 2.5 mL) içeren orijinal büyük doku kültürü şişesi,% 5 FBS MEM, 50 ml ekleyin ve inkübatör şişeyi geri. Aynı büyük doku kültürü şişesi 5 pasajlar yeniden kullanılabilir ve daha sonra yeni bir balon değiştirmek için set-up olmalıdır. </li><li> Yığınlar halinde tepsiye yerleştirin küçük doku kültürü şişeleri. Medya düzgün flaks alt kapsadığını emin olmak için Swirl tepsi. </li><li> 37 kuvöz küçük şişeler ° C,% 5 CO 2 ve% 80-90 konfluent kadar bir gecede büyümek yerleştirin. </li></ol> 4. Sivrisinek havuzları hazırlanması <ol><li> Sivrisinek havuzları test işlemleri sırasında soğuk tutun. Önceden soğutulmuş kullanın.rafları ve dondurucu karıştırıcı değirmen kasetleri, buz reaktifler ve soğutmalı santrifüj sivrisinek havuzları işleme. </li><li> Yeri tüpler önceden soğutulmuş dondurucu raf sivrisinek içeren ve 1 - 1,5 ml PBS-G sivrisinekler, her tüp. </li><li> Dondurucu karıştırıcı değirmen kaset al. Sonra her kaset içine koyun ve 24 tüplü karıştırıcı değirmen güvenli. </li><li> 4 dakika 25 devir / saniye örnekleri homojenize. Mikser değirmen sivrisinek dokuyu bozan, yüksek hız ve her tüp içinde bir metal BB tüpler sallar. </li><li> 7,000 rpm hızında 6 dakika için borular santrifüjleyin. </li><li> Dondurucu raflar yerleştirmek tüpler Vero hücre içine inoküle kadar. </li></ol> 5. Sivrisinek havuzu homojenatlarında Vero hücreleri Aşılanması <ol><li> Yeterli confluency ve hücre sağlığını sağlamak için her bir serinin en az bir doku kültür şişelerinde inverted mikroskop altında kontrol edin;% 80-90 kapsama alanı hakkında bekliyoruz. </li><li> Hat kadar her sivrisinek havuzu karşılık gelen üyelik numaraları ile bir raf ve etiket şişeler 20 küçük doku kültürü şişeleri. </li><li> Kapaklar ve atık behere doku kültürü şişeleri medya süzün en gevşetin. Balonuna yeterli medya tamamen kat hücre tek tabaka bırakın. </li><li> Ilgili doku kültürü balona her işlenmiş sivrisinek havuzu süpernatant kısım 100μL. </li><li> Kültür şişesi kapağı yerine takın ve sıkın. </li><li> 35-40 rpm&#39;de 5 dakika (oda sıcaklığı) çalkalamalı kültür şişeler düz yatırın. </li><li> 20 doku kültürü şişeleri BSC bir raf ve yerinde dik pozisyona dönün. </li><li> Bir seferde 3 doku kültürü şişeleri Sır, serolojik bir pipet kullanarak her bir balona 4 mL büyüme ortamı dağıtmak; kapakları yerine. </li><li> Pipet ucu kültür şişelerinde boyun veya dudak temas etmediğinden emin olun. Temas şişesi ile yapılır, gerektiğinde pipet uçları değiştirin. </li><li> 37 inkübe doku kültürü şişeleri ° C,% 5 CO 2. </li></ol> 6. Vero hücreleri virüs büyüme Eleme <ol><li> Ekran, 3-7 gün sonrası aşılama, viral enfeksiyon belirtileri, sitopatik etki (CPE), doku kültürü şişeler inoküle. </li><li> Görme şişeler bükerek, CPE ve / veya kirlenme hücre kültürleri incelemek ve medya inceleyerek balonun altındaki havuzları. Hücrelerin CPE sırasında bozulabilir ya da büyüme, maya, mantar, veya bakteriyel kontaminasyon nedeniyle medya bulutlu görünecektir. </li><li> Ters bir mikroskop altında bulutlu medya sergi hücre kültürleri yeniden inceleyin. Virüsler hücreleri deforme olmaya ve kültür şişeler düşebileceği neden olacaktır. Görünür kirleticiler, örneğin maya, diğer bakteri, mantar ya da ağır sivrisinek enkaz, hücre kültürleri 0.22μM şırınga filtresi sayesinde orijinal sivrisinek havuzu geçerek yeniden test edilmektedir. </li><li> Aseptik serolojik bir pipet kullanarak etiketli cryotubes virüs pozitif hücre kültürleri medya 1-2 mL dağıtılıp. </li><li> Virüs kültürler -80 saklanan ° C uygun tanı testleri ile tespit kadar. </li></ol> 7. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> MEM,% 5 FBS. 4 L gg H 2 0 son bir hacmi 37.6 gr toz MEM eritin. Çözüm medya şişe ve otoklavda 500 ml alikotları içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik her bir şişe 26 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 5.2 mL L-Glutamine, 5.2 ml anti-biotic/mycotic ve 10.4 ml% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS-G. 16 g NaCl, 0,4 g KCI, 2.3 g Na 2 HPO 4, 0.4 g KH 2 PO 4, ve% 0.5 fenol Red 4 ml, 1000 ml dd H 2 0 içine çözülür . 2 N NaOH (gerekirse) 7,1-7,4 pH ayarlayın. Ayrı bir beher, ısı 600 kaynamaya H 2 0 ml. Hot-plate çıkar, 10 gr jelatin ekleyin ve çözülür. PBS çözüm çözünmüş jelatin solüsyonu ekleyin ve 2 L dd H 2 O. ile son ses seviyesini ayarlamak 100 ml solüsyon şişeleri ve otoklav içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik olarak 42.8 mL ısı ile inaktive edilmiş tavşan serumu ve 1.4 mL anti-biotic/mycotic ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS hücre yıkayın. 400 mL gg H 2 O. 50 ml 10X Dulbecco&#39;nun PBS 2 N NaOH ile pH 7.1 &#39;e ayarlayın. Dd H 2 O. ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın 0.2uM vakum filtre ünitesi ile filtre çözüm. 5 ml alikotları 8 ml vidalı kapaklı tüpler içine koyun. 4 ° C saklayınız </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar 4 taksonomik ailelerden gelen virüslerin Dokuz farklı 1997-2010 (Tablo 1) Connecticut eyalet çapında sürekli gözetim sırasında toplanan sivrisinekler kurtarıldı. Bu virüsler Beş insan hastalığı, Batı Nil virüsü ve doğu at ensefaliti virüsü olan en önemli patojenlerin neden olduğu bilinmektedir. Yeni keşifler toplanan sivrisinekler WNV ilk izolasyonKuzey Amerika, 1999 2 2005 4 2000 3 kuzeydoğu ABD&#39;de Potosi virüsün ilk izolasyon, ve New England&#39;da La Crosse virüsünün ilk izolasyon. <table border="1"><tbody><tr><td> Virüs </td><td> Aile </td><td> No izole </td><td> No yerlerde </td><td> No yıl denetliyor </td><td> Insan hastalığı </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Batı Nil virüsü </td><td> Flaviviridae </td><td> 1.002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Orta şiddetli, ateş, ensefalit </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Doğu at ensefaliti virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Şiddetli, ensefalit </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Kanyon virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Hafif ve orta şiddette, ateş, menenjit </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosi virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Iki belgelenmiş durumda şiddetli, ateş, nörolojik hastalık Hafif </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Orta şiddetli, ensefalit </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flanders virüs </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Virüsler Vero hücre kültürü yöntemi ile alanında toplanan sivrisinekler algılandı. Sivrisinekler 1997-2010 Connecticut eyalet çapında gözetim sırasında toplanmıştır.

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

Vero hücre kültürü testi virüs bir çeşitlilik için ekran alan toplama sivrisinekler için etkili bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu özellikle hedef bir veya bir kaç ilgi virüslerin moleküler yöntemler tezat. Ayrıca, Vero hücre kültürü tahlil eşit değilse, RT-PCR 7 daha hassas ve gelecek çalışmalar için referans koleksiyonu saklanır virüs izolatları ile bize sunuyor bulduk . Bununla birlikte, hücre kültürü sistemleri, birçok durumda uygun olmayabilir. Bu yaklaşım, ek ma...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat, NaHCO 3,% 7.5 Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Toz gerekli minimum orta (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco&#39;nun Kullanıcı PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Tavşan serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero Hücreleri (Klon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Küçük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Büyük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Bakır kaplı BB, 4.5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mikser Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack dondurucu raflar </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Sivrisinekler Batı Nil virüsü, dang virüs ve chickungunya virüs gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı virüsler iletir. Bu virüslerin çoğu endemik aralıklarında yoğunlaştı ve yeni bölgeler için genişletilmiş, bu tehditlere yanıt vermek için, etkin bir gözetim ve kontrol programları gerektiren var. Virüs etkinliğini izlemek için bir strateji endemik sitelerinden çok sayıda sivrisinek toplama ve viral enfeksiyon için test içerir. Bu makalede, biz nasıl işleneceğini süreci tanımlamak ve Vero hücre kültürü yöntemi ile bulaşıcı bir virüs için sivrisinek alanında toplanan ekran. Sivrisinekler tuzak konumu ve türlerine göre sıralanır ve ≤ 50 bireyler içeren havuza gruplandırılmıştır. Pooled örnekleri karıştırıcı değirmen ve sulu faz konfluent Vero hücre kültürlerinde (Klon E6) üzerine inoküle kullanarak tamponlu salin içinde homojenize edilir. Hücre kültürleri 3-7 sonrası aşılama ve hücre kültüründe yetişen herhangi bir virüs uygun tanı testleri tarafından belirlenen gün sitopatik etki izlenir. Bu yaklaşımın kullanılması, Connecticut, ABD toplanan sivrisinekler 9 farklı virüsler izole var, ve bunlar arasında, 5 insan hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Bu virüsler Üç (Batı Nil virüsü, Potosi virüs ve La Crosse virüsü), Kuzey Amerika ya da 1999 yılından bu yana New England bölgesi için yeni kayıtlar temsil eder. Geniş bir çeşitlilik virüs tespit yeteneği hem sivrisinek nüfus yılında kurulan ve yeni çıkan virüslere izlenmesi için kritik öneme sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay at JoVE.com

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Görüntüleme.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Video: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...