Biz Dr teşekkür ederim. Tanzanya&#39;dan sivrisinek örnekleri sağlamak için Glasgow Üniversitesi UC Davis ve Dr. Katharina Kreppel Anthony Cornel ve Laura Norris. Biz Zambiya sivrisinek örnekleri paylaşmak için Halk Sağlığı Johns Hopkins School Bayan Smita Das Dr. Douglas Norris teşekkür ederim. Biz de tahlil tasarımı eğitimi için Veteriner Genetik Laboratuvarı&#39;nda Bay Lee V. Millon teşekkür ederim. Bu çalışma R01AI 078.183 ve R21AI062929 hibe Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. PCR Amplifikasyonu <ol><li> Bir 1.5ml mikrotüp tüm PCR primerleri (ek Tablo S1 bakınız) karıştırın. Her bir SNP iki primer (ileri ve geri) sahiptir. Her bir PCR primeri stok konsantrasyonu, 100 uM muhafaza emin olun. (Ek Tablo S2 bakınız) tezgah hata ve süresini azaltmak için pipetle 500-1.000 reaksiyonlar için yeterli primer karışımı olun. Arzu edildiği takdirde, -20 ° C&#39;de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için alikotları hazırlamak. </li><li> Üreticinin protokolü (Tablo 1) &#39;de tarif edildiği gibi PCR kokteyli hazırlanır. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir. Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye için PCR hafifçe kokteyl ve santrifüj içeren tüp. </li><li> Bir her kuyuya, PCR kokteyli 3 ul koyun 96 plaka olmayan etekli. Bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> Her bir çukura sivrisinek uygun genomik DNA, 2 ul ekle. Not: m genomik DNA elde Süreci<html> osquito dokular (baş / göğüs, karın veya tüm vücut) Diğer edebiyatlarında 29-32 açıklanmıştır. (Baş / göğüs içinde Plasmodium) enfektif sivrisinek kan (karın) içinde Plasmodium olanlar ayırt etmek için uygun bir DNA ekstraksiyon protokolünü seçin. Biz genellikle sivrisinekler vücut parçaları (baş / göğüs veya karın) çıkarılan DNA kullanmak, yani DNA konsantrasyonu 0.05-2ng / ul değişir. Toplam DNA giriş üreticinin tavsiyesine (5-10ng / rxn) daha düşük olsa da, biz genellikle sağlam SNP tüm genom amplifikasyon olmadan DNA örneklerinin% 98 çağrıları olsun. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. </li><li> PCR amplifikasyonunun yapılması için aşağıdaki PCR protokolü kullanarak: (1) 94 ° C sıcaklıkta 2 dk için, (2) 94 ° C&#39;de 30 saniye, (3) 1 dakika 30 saniye için 56 ° C, (4) 72 ° C (5) tekrar aşama (2) - (4) 45 çevrim için, (6), 1 dakika ve 4 ° C&#39;de beklemeye için 72 ° C. </li></ol>Yurt &quot;&gt; 2. SAP Tedavi <ol><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde, SAP enzim çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). Bir plaka 96 örnekleri işleyin. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir. </li><li> Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye için SAP enzim hafifçe çözeltisi ve santrifüj tüpü. Her kuyuya, SAP enzim solüsyonu 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. 40 dakika boyunca (1), 37 ° C, (2) 85 ° C, 5 dakika için enzimler inaktive edildi (3) 4 ° C&#39;de tutun, aşağıdaki gibidir: plaka inkübe edin. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, işleme devam etmeden önce -20 ° C&#39;de plaka saklayın. 2 hafta içinde saklanan plaka işleyin. </li></ol> 3. SNP Uzatma <ol><li> Numune levhası, SAP, muameleden sonra dondurulur, bu devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar çözünmesine izin. </li><li> Uzatma primer karışımı (Ek Tablo S2) hazırlayın. Her SNP bir EXTE vardırnsion astar. 500 mcM her uzatma astar stok konsantrasyonunu tutun. İsteğe bağlı olarak, -20 ° C de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için kısım. </li><li> 96 reaksiyon hacmi% 20 bir çıkıntı içerir, Tablo 3&#39;de tarif edildiği gibi uzatma karışımı hazırlayın. </li><li> Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye boyunca hafifçe uzantısı kokteyl ve santrifüj tüpü. Her kuyuya uzatma kokteyli 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, levha Thermocycle. Bu noktada, kütle spektrometrisi devam ya da 2 haftaya kadar -20 ° C de plaka saklayın. </li></ol> 4. Klima SNP Uzatma Ürün Kütle Spektrometre Analiz Optimize <ol><li> Örnek plakası SNP uzantısı sonra donmuş ise, devam etmeden önce oda sıcaklığına çözülme sağlar. </li><li> Bunu conta reçinenin, 15 mg transferuzatılmış kaşık kullanarak gamze plaka üzerine INER. Gamze plaka kuyu içine reçine yaymak için kazıyıcı kullanın. Reçine yaymak için gamze plaka üzerinde yan yana gelen kazıyıcı Sweep. Reçine, her kuyuda olduğundan emin olun. </li><li> Kazıyıcı kullanarak gamze plaka kapalı aşırı reçine kazıyın. Reçine en az 20 dakika gamze plakasında bekletin. Reçine, gamze plaka standı örnek plakasının her bir kuyunun HPLC dereceli su 41 ul ekleyin icar ederken. </li><li> Yavaşça gamze plaka üzerine örnek plaka ters, yerleştirin. Gamze plaka kuyulardan numune plaka kuyular hizalar gamze plaka küçük yuvarlak yazı, karşı örnek plaka sıfırlar emin olun. </li><li> Reçine örnek plaka kuyu içine gamze plaka düşer, böylece birlikte numune plaka ve gamze plaka Holding, onları hafifçe çevirin. Reçine numune plaka içine düşer, böylece gamze plaka dokunun. Di emin tüm reçine olunmple plaka örnek plaka kuyu içine düşer. 30 saniye boyunca 3.200 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde örnek plaka döndürün. Rotator örnek plakası uzun ekseni etrafında 360 ° döndürmek gerekir. </li><li> 5 dakika boyunca 3.200 xg&#39;de örnek plaka santrifüjleyin. Bu adımdan sonra, bir sonraki adıma geçmeden önce 2 hafta -20 ° C&#39;de örnek plaka saklayın. </li></ol> 5. MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre gibi SpectroCHIP gibi bir bioarray üzerine klimalı SNP uzatma ürünü aktarın. Bu aşama için MassARRAY Nanodispenser kullanın. </li><li> Transfer tamamlandığında, tahliller ve plakalar tahlil veritabanında kurulacak nasıl tanımlar. Her plaka özel tahlil tasarımı (Ek Tablo S3) bağlanan benzersiz bir kimliğe sahiptir, öyle ki tahlil ve plakaları adlandırın. </li><li> Deney ve plaka tanımlandıktan sonra, bir kütle spektrometresi kullanılarak spektrumları kazanır. </li></ol><ol><li> Böyle Typer Analyzer veya TyperViewer (Sequenom) gibi gerçek zamanlı PCR analizi veri yorumlama yazılımı kullanarak veri analizi yapın. Her iyi örnek düzeni, kitle spektrogram içeren .xml formatında veri elde, adı da dahil olmak işaretleyici bilgileri, ilgili SNP her varyant için beklenen kütle ve herhangi bir hata veya her reaksiyon ile ilişkili uyarı mesajları. Elde edilen kütle Spektrogram&#39;ın için Şekil 2 bakınız. </li><li> . Ve her genotip için izin tolerans / Varyans (gürültü oranı büyüklüğü veya sinyali) algılama eşiği ayarlayarak SNP genotip kümeleme analizi yürütmek 3 04.707-KDR 2. SNP genotip kümeleri bir örneğini göstermektedir. </li><li> Bir elektronik tablo programı içine çıkan SNP genotip aramaları verin. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

- Uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi 33-37 zaman PCR amplifikasyonu, karides alkalin fosfatazı (SAP) Reaksiyon SNP uzantısı, uzatma şartlandırma ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma MDA beş ana adımdan oluşur. İlk PCR amplifikasyon adımı yeterli şablon DNA SNP uzatma aşamasında sunulacak böylece her SNP yan DNA güçlendirir. SAP reaksiyonu aşağıdaki SNP uzatma adımı engelleyebilir kullanılmayan dNTPs nötralize eder. SNP uzatma SNP lokusu ve kitle-modifiye terminatör n?...

Anopheles arabiensis Anopheles coluzzii ve Anopheles gambiae Afrika 1 malarya iletilmesinden sorumlu başlıca vektörlerdir. Bu üç tür morfolojik 2 ayırt edilemez ve sadece moleküler deneyleri 3-9 ile ayırt edilebilir. Buna ek olarak, rutin epidemiyolojik ve nüfus genetiği çalışmaları yardım için yapılan birçok mansap tahliller vardır. Bu Türleşmenin adaları 10-12 (1), bir genotip analizi, (2) bir amino asit kodonu para geninin pozisyonda inci 1014 olmayan ayn SNP tanıyan bir genotipleme deneyi (knock-down direnç veya KDR SNP) 13 yer alır -18 (3), parazit tespiti, PCR 19-23 ve sivrisinek midguts 24,25 konak-spesifik DNA (4) taraması. Biz amacı ile, tek bir çoklu tepkime Tüm bu deneyler birleştiren çok deteksiyon deneyi (MDA) geliştirmiştirAfrika&#39;da sıtma vektörlerin epidemiyolojik önemli özelliklerini alyzing. MDA tahlili, çok sayıda (1) bir tür tespit edilmesi için markörler olarak kullanılmışlardır (A arabiensis, Anopheles gambiae, A. coluzzii veya üç) başka (yok) KDR SNP temsil, (2) bir insektisit direnci içerir (L1014F ve L1014S her ikisi de) iki ana sıtma parazitlerinin, (3) bulunması, Plasmodium falciparum ve P. Vivax, ve bir, kuş ve memeli altı konaklardan (4) kan kaynağı. Geleneksel olarak, bu deneyler, farklı polimeraz zincir reaksiyonları yapılmıştır. Tüm bu deneyler geleneksel PCR platformu kullanılarak yapılır, 8-10 PCR reaksiyon deneyleri yürüten ve jel elektroforezi adımlarını eşlik gerektirir. Burada sunulan MDA yöntemi bütününde yaklaşık 5 saat sürer iken belgeleyen sonuçlarına hazırlık Her birey PCR reaksiyonu, 4-5 saat sürer. Bu, tek başına işgücü maliyetlerinde% 90 tasarruf eşdeğerdir. MDA Burada sunulan 5 $ maliyetinumune başına 33 SNP genotiplemesi için. Bu önemli ölçüde daha az pahalı bir numune başına yaklaşık 1,50 $ maliyeti tek agaroz jel bazlı tahlillerde daha azdır. MDA kapsamındaki tüm özelliklerini tespit Tahliller numune başına $ 12-15 bir maliyetle 8-10 ayrı agaroz jel bazlı testlerin en az gerektirecektir. Dahası, MDA ölçüde her parazit veya ana bilgisayar kaynak tespiti için en az üç işaretçileri kullanarak bir yanlış pozitif veya negatif üretme şansını azaltır. Kullandığımız bir platform sıtma vektörleri ile sınırlı değildir, ancak bu tıp, veterinerlik ve temel biyoloji 26-28 gibi çok geniş bir uygulama çeşitli kullanılabilir. Derinlemesine örneklerinin büyük (100s sırasına göre) numarası içeren dernek çalışmaları veya popülasyon genetiği çalışmaları aynı anda birden fazla belirteçler için maliyet-etkin testler tarama gerektirir. Iki veya daha fazla ayrı PCR deneyleri kullanan çalışmaların çoğu düşük maliyetle daha hızlı sonuçlar için MDA uygulamak. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

Anofel gambiae türleri kompleksi Afrika&#39;da sivrisinek ileten önemli sıtma içerir. Bu tür, tıbbi önemi vardır, çünkü çok sayıda özellikleri tipik olarak epidemiyolojik çalışmalarda yardımcı olmak için moleküler tahliller kullanılarak karakterize edilir. Bu özellikler türler kimlik, insektisit direnci, parazit enfeksiyonu durumunu, ve ana tercihi vardır. Anopheles gambiae kompleksinin popülasyonları morfolojik olarak ayırt edilemez olduğundan, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), geleneksel türleri tanımlamak için kullanılır. Türü bilinmektedir sonra, çok sayıda alt-deneyler, rutin daha özelliklerinin ortaya konması için uygulanır. Örneğin, bir para-geninde KDR olarak bilinen mutasyonlar DDT ve piretroid böcek karşı direnci tasdik etmektedirler. Buna ek olarak, enzime bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ya da Plasmodium paraziti DNA tespit PCR deneyleri, sivrisinek dokularda mevcut parazitlerin tespit etmek için kullanılır. Son olarak, bir combinatioPCR ve sınırlama enzim sindirimleri konakçı spesifik DNA sivrisinek bloodmeal tarama ile bir ev sahibi tercih (örneğin, hayvan, kan ile insan) aydınlatmak için kullanılır. Tek seferde 96 ya da 384 numune için tek bir çoklu reaksiyon genotipleme 33SNPs Yukarıda adı geçen bütün deneylerde bir araya getiren çoklu tespit deneyi (MDA) geliştirdik. MDA türleri Plasmodium algılama ve ana kan tanımlanmasına yönelik olarak çoklu işaretleri içerir için, yanlış pozitif ya da negatif üretme olasılığı önemli ölçüde özelliği başına sadece bir işaretçi de ihtiva önceki deneylere azaltılır. Bu sağlam ve basit tahlil maliyet-etkin ve mevcut tahlillerin zaman bir kısmını bu anahtar sivrisinek özellikleri algılayabilir.

Türler tanımlama: Bir örnek, üç türün biri değilse aşağıdaki 5 SNP birlikte. Üç SNP (01073-213, 04679-157 ve 10.313 üç tür (A. arabiensis, A. ve A. coluzzii gambiae) (Tablo 4) tespit -052) yükseltmek için başarısız. insektisit direnci çıkarım için kdr genotipi: Para voltaj-kapılı sodyum kanalının 1014 inci kodon kdr ...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Evolution

Speciation and Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

13.0K Görüntüleme.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.