Agradecemos la importante contribución de los Dres. John Anderson, Andrew principal y Shirley Tirrell a este estudio. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (U50/CCU116806-01-1) y el Departamento de Agricultura de EE.UU. (58-6615-1-218, CONH00768 y CONH00773).

1. Mosquito clasificación e identificación <ol><li> Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un banco de laboratorio abierto en una dedicada nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) de laboratorio por personal capacitado para trabajar con los mosquitos viven. Una &quot;cadena de frío&quot; se mantiene durante todo el procedimiento. </li><li> Anestesiar a vivir los mosquitos adultos mediante la colocación de bolsa de recolección de mosquitos en un congelador de -20 º durante 5 minutos. Transferencia de bolsa de recolección de un recipiente aislado que contiene hielo seco. Cierre la tapa y exponer a los mosquitos a los de dióxido de carbono durante 1-3 minutos para asegurar la completa precipitación. </li><li> Toque mosquitos anestesiados en una sartén previamente enfriado colocado sobre una cama de hielo seco. Separado los mosquitos individuales femeninos con unas pinzas finas y colóquelas en tazas de parte de plástico. Cubrir con tazas de tapa y coloque en hielo. </li><li> Identificar los mosquitos de las especies mediante claves taxonómicas descriptivo basado en la morfología externa de mosquitos con la ayuda de un microscopio de disección estéreo (10-60X de zoom) montado sobre una mesa chill electrónico. </li><li> Combine identificado especies de mosquitos en las piscinas de ≤ 50 personas en 2 ml tapa complemento viales que contienen una BB de cobre. Los viales están etiquetados con un identificador único. </li><li> Tras la identificación de todos los mosquitos, los viales se colocan en bolsas etiquetadas y se mantiene en un refrigerador de espuma de poliestireno que contengan hielo seco. </li><li> Tienda de criaderos de mosquitos en un congelador -80 ° C hasta que las pruebas del virus. </li></ol> 2. Bioseguridad consideraciones de aislar el virus de los mosquitos <ol><li> Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en una de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) por el personal de laboratorio que están capacitados para trabajar en este nivel de contención 1. Las instalaciones de laboratorio, equipos, procedimientos y prácticas están sujetas a la supervisión institucional, estatal y federal y la inspección. Buscar la formación adecuada y aprobación antes de intentar los siguientes protocolos. </li><li> Use el equipo de protección personal (PPE) para cada procedimiento, tales como batas desechables, guantes, protectores faciales y respiradores. </li><li> Desinfectar las superficies de trabajo con el 70% de alcohol antes y después de completar los procedimientos. </li><li> Cultivos celulares y el material potencialmente infeccioso se manejan en un gabinete de bioseguridad clase II (BSC). </li><li> Criaderos de mosquitos se homogeneizan en un mezclador de molino que se coloca dentro de un BSC. </li><li> Homogeneizados de los mosquitos se centrifugan en una microcentrífuga hermética a los aerosoles. Si este procedimiento no puede llevarse a cabo dentro de un BSC, el operador debe usar un respirador al manejar y recuperar muestras de la centrífuga. </li><li> Pipetas y puntas de pipeta de manejo de materiales en el BSC (gabinete de bioseguridad) se sumergen en lejía al 10% antes de la esterilización en autoclave. Todos los desechos de laboratorio es descontaminado en autoclave antes de su eliminación. </li></ol> 3. Preparación de las células Vero <ol><li> Los medios de comunicación decantar la cultura de un frasco grande de cultivo de tejidos (175 cm 2) de las células Vero confluentes (clon E6) en el vaso los residuos que contengan lejía. </li><li> Lavar las células Vero mediante la adición de una alícuota de 5 ml de PBS y agitar sobre la capa de células ya lo largo de los lados del frasco, asegurándose de cubrir bien toda la monocapa. </li><li> PBS se decanta en el vaso de residuos. </li><li> Añadir 2,5 ml de tripsina-EDTA y se arremolinan sobre la capa de células asegurándose de cubrir bien toda la monocapa. </li><li> Incubar frasco en la incubadora durante 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Agite con cuidado y el matraz agitar para eliminar las células de la superficie inferior. Las células se deslice con facilidad; incubar un adicional de 1-5 minutos si las células no son fáciles de deslizar. </li><li> Añadir 5 ml de medio mínimo esencial (MEM), 5% de suero fetal bovino (SFB), utilizando una pipeta serológica y pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces a disolver los grumos de células. </li><li> Añadir otros 15 ml de MEM, 5% de SFB para un volumen total de 22,5 ml y mezclar bien. </li><li> Lugar 40 frascos pequeños de cultivo de tejidos (25 cm 2) en posición vertical en dos bastidores (20 frascos / rack). </li><li> Coloque los bastidores que contienen frascos dentro de la cabina de bioseguridad y de remover las tapas frasco, colocar las tapas directamente en frente de los frascos. </li><li> Prescindir de 4 ml de MEM, 5% de SFB en cada frasco con una pipeta serológica. </li><li> Coloque 0.5 ml de células suspendidas en cada frasco (~ 1:06 relación de división) Vuelva a colocar las tapas matraz. </li><li> Agregar 50 ml de MEM, 5% de SFB al original frasco grande de cultivo de tejidos que contienen la suspensión de células restantes (~ 2,5 mL) y el retorno frasco a la incubadora. El mismo frasco grande de cultivo de tejidos puede ser reutilizado hasta 5 pasos y luego un nuevo frasco debe ser puesta en marcha en su lugar. </li><li> La cultura el lugar de tejido pequeños frascos apilados en la bandeja. Remolino de la bandeja para asegurarse de que los medios de comunicación de manera uniforme cubre la parte inferior del matraz. </li><li> Colocar frascos pequeños en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 y crecer durante la noche hasta el 80-90% confluente. </li></ol> 4. Preparación de los criaderos de mosquitos <ol><li> Mantener criaderos de mosquitos frío durante los procedimientos de prueba. El uso de pre-enfriadobastidores congelador y cassettes molino mezclador, reactivos helada, y una centrífuga refrigerada en el tratamiento de criaderos de mosquitos. </li><li> Se colocan los tubos que contienen los mosquitos en un estante del congelador antes de la helada y añadir 1 a 1,5 ml de PBS-G a cada tubo de mosquitos. </li><li> Recuperar molino mezclador-cassettes del congelador. Lugar 24 tubos en cada cinta y luego se asegura en el mezclador de molino. </li><li> Homogeneizar las muestras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. El molino mezclador sacude los tubos a alta velocidad y una BB de metal dentro de cada tubo altera el tejido del mosquito. </li><li> Tubos centrífuga durante 6 minutos a 7.000 rpm. </li><li> Se colocan los tubos de nuevo en el congelador hasta bastidores inoculados en células Vero. </li></ol> 5. La inoculación de células Vero con homogeneizados de pool de mosquitos <ol><li> Marcar al menos una frasco de cultivo de tejidos de cada serie en microscopio invertido para asegurar la salud adecuada confluencia y celular; esperar cerca de 80-90% de cobertura. </li><li> Línea hasta 20 frascos pequeños de cultivo de tejidos en un rack y frascos con números de adhesión correspondientes de cada grupo de mosquitos. </li><li> Afloje las tapas y la mayoría se decanta de los medios de comunicación de los frascos de cultivo de tejidos en el vaso de residuos. Deje suficiente material en el recipiente por completo monocapa de células abrigo. </li><li> 100μL alícuota del sobrenadante de cada grupo de mosquitos procesados ​​en el matraz de cultivo de tejidos correspondientes. </li><li> Vuelva a colocar y apretar la tapa cultura matraz. </li><li> Coloque los frascos de cultivo plano en agitador durante 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm. </li><li> Retorno del 20 frascos de cultivo de tejidos a la posición vertical en un rack y el lugar en el BSC. </li><li> Destapando tres frascos de cultivo de tejido al mismo tiempo, prescindir de cuatro medios de cultivo mL en cada frasco con una pipeta serológica, recoloque las tapas. </li><li> Asegúrese de que la punta de la pipeta no hace contacto con el cuello del matraz la cultura o el labio. Cambie la punta de la pipeta cuando sea necesario si se hace contacto con el frasco. </li><li> Incubar frascos de cultivo de tejidos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 6. Revisión de células Vero para el crecimiento de virus <ol><li> Pantalla inoculados frascos de cultivo de tejidos en busca de signos de infección viral, el efecto citopático (CPE), a partir de 3-7 días después de la inoculación. </li><li> Inspeccione visualmente los cultivos celulares para la CPE y / o contaminación por la inclinación de los frascos y examinar los medios de comunicación que las piscinas en la parte inferior del frasco. Los medios de comunicación van a aparecer nubes que las células se deterioran durante el CPE o debido al crecimiento de las levaduras, hongos, o la contaminación bacteriana. </li><li> Volver a examinar cultivos celulares que muestran los medios de comunicación nublado bajo un microscopio invertido. Los virus causan que las células se deforman y se desatará a partir de los frascos de cultivo. Cultivos celulares con contaminantes visibles, la levadura, por ejemplo, otras bacterias, hongos o restos de mosquitos pesados, son de nuevo a prueba al pasar la piscina mosquito original a través de un filtro de jeringa 0.22μM. </li><li> Asépticamente prescindir de 1.2 mL de los medios de comunicación de virus de los cultivos celulares positivos en criotubos etiquetados con una pipeta serológica. </li><li> Cultivos de virus se almacenan a -80 ° C hasta el momento identificados por las pruebas de diagnóstico apropiadas. </li></ol> 7. Preparación de los reactivos <ol><li> MEM, el 5% de SFB. Disolver 37,6 g de MEM en polvo en un volumen final de 4 litros de dd H 2 0. Prescindir de solución en 500 ml de alícuotas en frascos de medios de comunicación y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 26 mL inactivado por calor suero fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic ml, y 10,4 ml de 7,5% de bicarbonato de sodio a cada botella. Almacenar a 4 ° C. </li><li> PBS-G. Disolver 16 g de NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g de Na 2 HPO 4, 0,4 g de KH 2 PO 4, y 4 ml de 0,5% de rojo fenol en 1000 ml dd H 2 0. Ajustar el pH a 7,1-7,4 con NaOH 2 N (si es necesario). En un vaso separado, el calor 600 ml de H 2 0 a hervir. Eliminar de la placa caliente, agregar 10 g de gelatina y disolver. Añadir la solución de la gelatina disuelta a la solución de PBS y ajustar el volumen final de 2 L con dd H 2 O. Vierta 100 ml de solución en botellas y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 42,8 ml de suero inactivado por calor conejo y 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Almacenar a 4 ° C. </li><li> De lavado PBS celular. Agregar 50 ml de 10X Dulbecco PBS a 400 ml dd H 2 O. Ajustar el pH a 7.1 con NaOH 2N. Ajustar el volumen final de 500 ml con dd H 2 O. Filtrar la solución con la unidad de 0.2uM filtro de vacío. Se distribuye en alícuotas de 5 ml en 8 ml con tapa de rosca tubos. Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 8. Resultados representante Nueve diferentes de virus a partir de 4 familias taxonómicas fueron recuperados de los mosquitos recolectados durante la vigilancia continua del estado de Connecticut 1997 a 2010 (cuadro 1). Cinco de estos virus causan enfermedad en humanos, los patógenos más importantes son el virus del Nilo y la encefalitis equina del este virus. Los nuevos descubrimientos son: el primer aislamiento del virus del Nilo Occidental de los mosquitos recolectados enAmérica del Norte en 1999 2, el primer aislamiento del virus de Potosí, en el noreste de EE.UU. en 2000 3, y el primer aislamiento del virus La Crosse en Nueva Inglaterra en 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Familia </td><td> N º cepas </td><td> No. localidades </td><td> Número de años en detectarse </td><td> Las enfermedades humanas </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Virus del Nilo Occidental </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Moderada a severa, fiebre, encefalitis </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Equina del este virus de la encefalitis </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Encefalitis severa, </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> No se conoce </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> De leve a moderado, fiebre, meningitis </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosí virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> No se conoce </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> De leve a severa, fiebre, las enfermedades neurológicas en los dos casos documentados </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> No se conoce </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Moderada a severa encefalitis, </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flandes virus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> No se conoce </td><td></td></tr></tbody></table> Los virus Tabla 1. Detectado en mosquitos recolectados en campo por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos fueron colectados durante la vigilancia a nivel estatal en Connecticut 1997 a 2.010.

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	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

De células Vero ensayo de cultivo sirve como un método eficaz para los mosquitos pantalla de campo recogidos por la diversidad de virus. Esto contrasta con los métodos moleculares que apuntan específicamente a uno o unos pocos virus de interés. Por otra parte, hemos encontrado que la prueba de cultivo celular Vero es, si no también más sensible que la RT-PCR 7 y nos proporciona cepas de virus que se almacenan en nuestra colección de referencia para futuros estudios. Sin embargo, los sistemas de cultiv...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio NaHCO3, 7,5% sol.. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Polvo medio mínimo esencial (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10 veces más de Dulbecco PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Suero de conejo </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Las células Vero (clon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Pequeños frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Grandes frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, de 175 cm2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> De cobre recubierto de BB, de 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> IsoPack bastidores congelador </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Los mosquitos transmiten una serie de virus distintos incluyendo importantes patógenos humanos, tales como virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus de chickungunya. Muchos de estos virus se han intensificado en sus rangos endémica y se expandió a nuevos territorios, que requieren de programas efectivos de vigilancia y control para responder a estas amenazas. Una estrategia para controlar la actividad del virus consiste en recolectar una gran cantidad de mosquitos de los sitios endémicos y ponerlos a prueba para la infección viral. En este artículo se describe cómo manipular, transformar, y la pantalla de campo recogidos por los mosquitos del virus infeccioso por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos son ordenados por ubicación trampa y especies, y se agrupan en las piscinas que contienen ≤ 50 personas. Muestras agrupadas se homogeneizan en solución salina usando un mezclador de molino y la fase acuosa se inocula en cultivos de células Vero confluentes (clon E6). Los cultivos celulares son monitoreados por efecto citopático a partir de 3-7 días después de la inoculación y cualquier tipo de virus en cultivos celulares son identificados por los ensayos de diagnóstico apropiadas. Mediante la utilización de este enfoque, hemos aislado nueve virus distintos de los mosquitos recolectados en Connecticut, EE.UU., y entre ellos, 5 son conocidos por causar enfermedades humanas. Tres de estos virus (virus del Nilo Occidental, el virus de Potosí y La Crosse virus) representan nuevos registros para América del Norte o de la región de Nueva Inglaterra desde 1999. La capacidad de detectar una amplia variedad de virus es fundamental para control establecidos y los virus de reciente aparición en la población de mosquitos.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Se describe un método para procesar y la pantalla de campo recogidos mosquitos para una diversidad de virus mediante el ensayo de cultivo de células Vero. Mediante el empleo de esta técnica, hemos detectado nueve virus distintos de 4 familias taxonómicas de mosquitos recogidos en Connecticut.

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K vistas.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Se describe un método para procesar y la pantalla de campo recogidos mosquitos para una diversidad de virus mediante el ensayo de cultivo de células Vero. Mediante el empleo de esta técnica, hemos detectado nueve virus distintos de 4 familias taxonómicas de mosquitos recogidos en Connecticut.

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Investigación

Inmunología e Infección

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modelo de cultivo primario de células Bursal de pollo Ex Vivo para estudiar la patogenesia de la enfermedad Bursal infecciosa Virus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificación de ratón y anticuerpos humanos repertorios por secuenciación de próxima generación

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Suero humano Anti-Acuaporina-4 inmunoglobulina G detección por análisis Cell-based

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...