אנו בתודה להכיר תרומות חשובות של בני הזוג. ג&#39;ון אנדרסון, אנדרו ראשי ושירלי Tirrell למחקר זה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (U50/CCU116806-01-1) לבין משרד החקלאות האמריקני (58-6615-1-218, CONH00768 ו CONH00773).

1. יתוש מיון וזיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנהלים הבאים מבוצעים על הספסל מעבדה פתוח ייעודי biosafety רמה-2 מעבדה (BSL-2) על ידי צוות אשר מאומנים לעבוד עם יתושים לחיות. &quot;קר שרשרת&quot; נשמר לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי לחיות יתושים בוגרים ידי הנחת שקית איסוף יתוש למקפיא -20 מעלות במשך 5 דקות. אוסף העברת התיק מיכל מבודד המכיל קרח יבש. סגור את המכסה ולחשוף יתושים פחמן דו חמצני במשך 1-3 דקות על מנת להבטיח להשלים עקום למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש יתושים הרדים על מחבת מראש צונן שהונח על מצע של קרח יבש. הפרד יתושים נקבה בודדים באמצעות מלקחיים בסדר מקום כוסות פלסטיק חלק. מכסים עם מכסה כוסות ומניחים על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי יתושים למינים באמצעות מפתחות טקסונומיות תיאורי מבוסס על מורפולוגיה יתוש חיצוני בעזרת מיקרוסקופ לנתח סטריאו (10-60x זום) רכוב על שולחן צמרמורת אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מינים שזוהו יתוש לתוך בריכות של ≤ 50 אנשים ב 2 Snap-כובע צלוחיות מ&quot;ל המכיל BB נחושת. בקבוקונים מסומנים עם מזהה ייחודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זיהוי של יתושים כל, צלוחיות ממוקמים שקיות שכותרתו שנערך צידנית קלקר המכילים קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בריכות יתושים בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לבדיקת וירוס. </li></ol> 2. Biosafety שיקולים לבודד את הנגיף ביתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנהלים הבאים מבוצעות במעבדה biosafety רמה-3 (BSL-3) על ידי צוות אשר הוכשרו והוסמכו לעבוד ברמה זו של ההכלה 1. מתקני מעבדה, ציוד, נהלים ושיטות עבודה כפופים לפיקוח מוסדי, המדינה, הפדרלי בדיקה. חפשו את ההכשרה אישור מתאים לפני שתנסה הפרוטוקולים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלבש את הציוד המתאים מגן אישי (PPE) עבור כל הליך כגון שמלות, כפפות חד פעמיות, מגן פנים, הנשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את משטחי העבודה עם אלכוהול 70% לפני ואחרי השלמת ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרביות תאים חומר זיהומיות פוטנציאל מטופלות II מחלקה biosafety הממשלה (BSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכות יתושים הם הומוגני במפעל, מיקסר כי הוא ממוקם בתוך BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenates יתוש הם centrifuged ב microcentrifuge אירוסול צמודים. אם הליך זה לא ניתן לבצע בתוך BSC, המפעיל צריך ללבוש ההנשמה בעת ההפעלה ואחזור דגימות בצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipets וטיפים pipet שינוע של BSC (biosafety הממשלה) הם טבול באקונומיקה 10% לפני מעוקר. לבזבז כל מעבדה הוא לחטא על ידי מעוקר לפני סילוק. </li></ol> 3. הכנת התאים Vero <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת למזוג מאחד בקבוק תרבות גדול רקמות (175 ס&quot;מ 2) של תאים Vero ומחוברות (Clone E6) לתוך כוס פסולת המכילה אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים Vero ידי הוספת aliquot 5 מ&quot;ל של PBS ו מערבולת מעל שכבה של תאים לאורך צידי הבקבוק והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לתוך כוס PBS פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA ו מערבולת מעל שכבה של תאים והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוק באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נערו בעדינות ואת צפחת מערבולת להסיר תאים מפני השטח לתחתית. התאים צריכה להחליק בקלות; דגירה נוסף 1-5 דקות, אם התאים אינם בקלות להחליק וליפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיה Essential מינימלי (מ), 5% בסרום שור העובר (FBS), באמצעות pipet סרולוגיות ו pipet מעלה ומטה 10-20 פעמים כדי לשבור את גושי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוספת 15 מ&quot;ל ממ, 5% עבור FBS בהיקף כולל של 22.5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 40 בתרבית רקמה צלוחיות קטנות (25 ס&quot;מ 2) זקוף שני מתלים (20 צלוחיות / מתלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדפים המכיל צלוחיות בתוך ארון biosafety ולהסיר כמוסות בקבוק, הצבת כמוסות ישירות מול צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 4 מ&quot;ל של מזכרות, FBS 5% לתוך בקבוק כל שימוש pipet סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 0.5 מ&quot;ל לתוך תאים מושעה בקבוק אחד (~ 01:06 יחס פיצול) החלף כמוסות בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל של מזכרות ספורט, 5% FBS בחזרה את הבקבוק המקורי רקמות גדולות התרבות המכילה את ההשעיה תא הנותרים (~ 2.5 MLS) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור. תרבות אותו בקבוק גדול רקמה ניתן שימוש חוזר עד 5 קטעים ואז בקבוק חדש אמור להיות הגדרת להחליף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מקום קטן רקמות צלוחיות בערימות על מגש. מערבולת את המגש על מנת לוודא כי אמצעי התקשורת באופן אחיד מכסה את החלק התחתון של פלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלוחיות קטנות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולגדול לילה ומחוברות עד 80-90%. </li></ol> 4. הכנת בריכות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור בריכות יתושים קר במהלך הליכי הבדיקה. השתמש טרום מצונניםבמקפיא מתלים מערבל-טחנת קלטות, קר כקרח ריאגנטים, ו צנטריפוגה בקירור בעת עיבוד בריכות יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות המקום המכיל יתושים למעמד טרום צונן הקפאה להוסיף 1-1.5 מ&quot;ל PBS-G על צינור אחד של יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר מערבל-טחנת קלטות מהמקפיא. מקום 24 צינורות לתוך קלטת כל כך בטוחים הטחנה מערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize דגימות במשך 4 דקות במהירות של 25 מחזורים / שנייה. הטחנה מערבל מנענע את צינורות במהירות גבוהה BB מתכת בתוך צינור זה משבש את רקמת יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 6 דקות בסל&quot;ד 7000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות המקום בחזרה מתלים במקפיא עד מחוסן לתאי Vero. </li></ol> 5. הרכבה של תאים Vero עם homogenates בריכה יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אחד לפחות בקבוק תרבות רקמה כל סדרה תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי להבטיח בריאות confluency ותא נאותה; לצפות על כיסוי 80-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקו עד 20 צלוחיות קטנות בתרבית רקמה במעמד וצפחות ​​תווית עם מספרים ההצטרפות המקביל ממאגר כל יתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר כובעים ביותר למזוג של התקשורת מתרבות צלוחיות רקמה לתוך כוס פסולת. השאירו התקשורת מספיק בקבוק כדי monolayer לחלוטין תא מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100μL של supernatant ממאגר כל יתוש מעובד לתוך בקבוק רקמות המקביל תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג והדק בקבוק כובע תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lay צלוחיות תרבות שטוח על שייקר במשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר) בשעה 35-40 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 20 צלוחיות תרבות רקמות תנוחה זקופה במעמד ומניחים BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתחה את המיכסה 3 צלוחיות תרבות רקמות בבת אחת, לוותר על 4 התקשורת צמיחה מ&quot;ל לתוך בקבוק אחד באמצעות פיפטה סרולוגיות; להחליף כובעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד שקצה פיפטה לא קשר את הבקבוק תרבות הצוואר או שפתיים. שינוי עצות פיפטה לפי הצורך אם הקשר הוא עשה עם הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתרבית רקמה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 6. הקרנת תאים Vero לצמיחה וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך מחוסן תרבות צלוחיות רקמות סימנים של זיהום ויראלי, השפעה cytopathic (CPE), 3-7 ימים לאחר חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק תרביות תאים עבור CPE ו / או זיהום על ידי הטיית צלוחיות ובחינת המדיה בריכות בתחתית הבקבוק. התקשורת יופיעו מעונן כמו התאים להתדרדר במהלך CPE או בשל הצמיחה של שמרים, פטריות, או זיהום חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון מחדש בתרביות תאים כי התערוכה התקשורת מעונן תחת מיקרוסקופ הפוכה. וירוסים יגרמו התאים להיות מעוותים יהיה להשתחרר מן צלוחיות תרבות. בתרביות תאים עם מזהמים לעין, כגון שמרים, חיידקים אחרים, פטריות או פסולת יתוש כבד, הם שוב נבדק על ידי העברת בריכה יתוש המקורי דרך פילטר מזרק 0.22μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לוותר על 1-2 MLS של מדיה וירוס חיובי בתרביות תאים לתוך cryotubes שכותרתו בעזרת פיפטה סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות וירוס מאוחסנים ב -80 ° C עד שזוהו באמצעות מבחני אבחון מתאים. </li></ol> 7. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממ, 5% FBS. ממיסים 37.6 גרם של אבקת ממ בכרך האחרון של L 4 של dd H 2 0. לוותר על פתרון לתוך 500 מ&quot;ל aliquots בבקבוקים מדיה החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 26 מ&quot;ל חום מומת בסרום שור עוברית, 5.2 מ&quot;ל-L-גלוטמין, 5.2 anti-biotic/mycotic מ&quot;ל, ו - 10.4 מ&quot;ל סודיום ביקרבונט 7.5% ל כל בקבוק. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS-G. ממיסים 16 גרם NaCl, KCl 0.4 גרם, 2.3 גרם Na 2 HPO 4, 0.4 גרם KH 2 PO 4, ו - 4 מ&quot;ל של פנול אדום 0.5% לתוך 1000 מ&quot;ל dd H 2 0. התאם את ה-pH ל 7.1-7.4 עם 2 N NaOH (במידת הצורך). בכוס נפרדת, חום 600 מ&quot;ל של H 2 0 לרתיחה. הסר מהצלחת חם, מוסיפים 10 גרם ג&#39;לטין, וכן לפזר. הוסף פתרון ג&#39;לטין מומס לפתרון PBS ולהתאים נפח סופי 2 L עם dd H 2 O. לוותר על 100 מ&quot;ל של פתרון לתוך בקבוקים החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים להוסיף 42.8 חום מומת מ&quot;ל ארנב בסרום anti-biotic/mycotic 1.4 מ&quot;ל. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS לשטוף התא. הוסף 10X 50 מ&quot;ל PBS Dulbecco של עד 400 מ&quot;ל dd H 2 O. התאם ל-pH 7.1 עם 2 N NaOH. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם dd H 2 O. פתרון סינון עם יחידת ואקום 0.2uM הסינון. לוותר לתוך 5 מ&quot;ל aliquots 8 בורג מכסה צינורות מ&quot;ל. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 8. נציג תוצאות תשעה שונים של וירוסים של 4 משפחות טקסונומיות נמצאו היתושים שנאספו במהלך מעקב רציף ארצית בקונטיקט 1997-2010 (לוח 1). חמישה נגיפים אלה ידועים כגורמים למחלות האדם, פתוגנים הכי חשוב להיות וירוס הנילוס המערבי והמזרחי וירוס דלקת המוח סוסים. הגילויים החדשים כוללים: הבידוד הראשון של WNV מפני יתושים שנאספובצפון אמריקה ב -1999 2, הבידוד הראשון של וירוס פוטוסי בצפון מזרח ארה&quot;ב ב -2000 3, ואת הבידוד הראשון של La Crosse וירוס בניו אינגלנד ב -2005 4. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וירוס </td><td> משפחה </td><td> לא מבודד </td><td> מספר מקומות </td><td> שנים לא זוהה </td><td> האדם מחלות </td><td> השופטים. </td></tr><tr><td> וירוס הנילוס המערבי </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> בינוני עד חמור דלקת קרום המוח, קדחת, </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> מזרח סוסים וירוס דלקת קרום המוח </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> דלקת קרום המוח חמור, </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> בהר J וירוס </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> לא ידוע </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ג&#39;יימסטאון קניון וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> קל עד בינוני, חום, דלקת קרום המוח </td><td> 8 </td></tr><tr><td> פוטוסי וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> לא ידוע </td><td> 3 </td></tr><tr><td> מטמון עמק וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> מתון עד חמור מחלה, חום, נוירולוגית בשני מקרים מתועדים </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> לא ידוע </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> בינוני עד דלקת קרום המוח, חמור </td><td> 4 </td></tr><tr><td> פלנדריה וירוס </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> לא ידוע </td><td></td></tr></tbody></table> וירוסים טבלה 1. זוהה שדה שנאספו על ידי יתושים assay תרבות Vero התא. יתושים נאספו במהלך מעקב ארצית בקונטיקט 1997-2010.

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תרבות Vero assay תא משמשת שיטה יעילה יתושים מסך השדה שנאספו עבור מגוון של וירוסים. זאת בניגוד לשיטות מולקולריות שמתמקדים אחד או כמה וירוסים של עניין. יתר על כן, מצאנו כי assay Vero תרבות התא הוא שווה אם לא יותר רגישה RT-PCR 7 ומספק לנו מבודד וירוס המאוחסנים באוסף התייחסות שלנ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט NaHCO 3, Soln 7.5%. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> אבקת מדיום חיוני מינימלי (מ) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> PBS 10X Dulbecco של </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> הארנב בסרום </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero תאים (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> צלוחיות קטנות בתרבית רקמה, כובעים פרקו, 25 ס&quot;מ 2 </td><td> פלקון - בקטון דיקינסון </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> גדול בתרבית רקמה צלוחיות, כובעים פרקו, 175 ס&quot;מ 2 </td><td> פלקון - בקטון דיקינסון </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> נחושת מצופה של BB, 4.5 מ&quot;מ </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> מיקסר מיל </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack מתלים במקפיא </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

יתושים לשדר מספר וירוסים שונים כולל פתוגנים אנושיים חשובים כמו וירוס הנילוס המערבי, וירוס דנגה, וירוס chickungunya. רבים של וירוסים אלה הגבירו בטווחים אנדמיים שלהם התרחבו השטחים החדשים, דבר המחייב מעקב יעיל תוכניות ובקרת להגיב לאיומים אלה. אסטרטגיה אחת כדי לעקוב אחר פעילות נגיף כרוך באיסוף כמויות גדולות של יתושים מאתרים אנדמיים ובדיקה אותם זיהום ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לטפל, לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור וירוס מדבק ידי assay תא Vero תרבות. יתושים ממוינות לפי מיקום מלכודת מינים, מקובצים בריכות המכילות ≤ 50 אנשים. הם אספו דגימות הומוגני ב מלוחים שנאגרו באמצעות מערבל-הטחנה ואת השלב מימית הוא מחוסן ומחוברות על תרביות תאים Vero (Clone E6). בתרביות תאים מנוטרים להשפעת cytopathic מ 3-7 ימים לאחר חיסון וכל וירוסים מגדלים תרבית תאים מזוהים על ידי מבחני אבחון מתאים. על ידי ניצול גישה זו, יש לנו מבודדים 9 וירוסים שונים היתושים שנאספו בקונטיקט, ארה&quot;ב, ובין אלה, 5 ידועים כגורמים למחלות אנושיות. שלושה וירוסים אלה (וירוס הנילוס המערבי, נגיף פוטוסי, ו La Crosse וירוס) מייצגים רשומות חדשות עבור צפון אמריקה או אזור ניו אינגלנד מאז 1999. היכולת לזהות מגוון רחב של וירוסים הוא קריטי ניטור הן הוקמה ווירוסים המתהווה באוכלוסיית היתושים.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay at JoVE.com

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Views.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

Video: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

זיהוי נוגדן Anti-aquaporin-4 G בנסיוב אדם על ידי Assay מבוססת-תא

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...