Biz onların sürekli işbirliği için teşekkür eder, A. Tager ve B. Shea ve gösteri amaçlı kullanılan akciğer dokusunda sağlamak için burada. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe HL-092.961 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. Bu çalışma, NSF ödül ECS-0335765 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen Nano Sistemleri (MSS), Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi Merkezi&#39;nde yapıldı. MSS, Harvard Üniversitesi Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi parçasıdır.

1. Akciğer Doku Şeridi&#39;nde Hazırlık <ol><li> Akciğer dokusunun son derece uyumlu ve AFM karakterizasyonu için şeritler halinde kesmek için zor. Geçici, kesim için akciğer yapısı stabilize intratrakeal% 2 düşük jel noktası agaroz (PBS içinde hazırlanmış) 50 ml / kg vücut ağırlığı ile izole fare akciğerlerini şişirmek için 37 ° C&#39;ye kadar ısındı Trakea Kravat ve PBS banyosunda şişirilmiş akciğerler serin, 4 ° C 60 dakika. Agaroz jel ve yavaşça bu aralık 5 sırasında akciğer yapısını stabilize etmek için hava sahasındaki pekiştirmek olacaktır. Yüksek agaroz konsantrasyonları, yani% 3-4, kesim için daha fazla doku istikrar geliştirmek için kullanılıyor olabilir. </li><li> Agaroz stabilize fare akciğer dokusunda Kes, uzunluk ve genişlik 5 x 5 mm ve 400 mm kalınlığında şeritler halinde bir jilet veya neşter bıçağı ile 37 önceden ısıtılmış bir PBS banyosunda şeritler yıkama ° C 100 ml artık agaroz çıkarmak için 5 dakika için bir tezgah üstü ısıtmalı heyecan plaka cam beher. Büyük hava yolları ve damarlar hariç tutmak için, ana kök bronşlarda uzak subplevral bölgelerde şeritler kesin. Hava yolları ve büyük damarların görüntülü edilecekse, ana kök bronşlar daha proksimal akciğer dokusundan şeritler kesin. </li></ol> 2. AFM Microindentation ve Floresans Görüntüleme <ol><li> AFM microindentation ilgi alanları izole etmek için, doku, faz kontrast mikroskobu ile görüntülendi ya da immunohistokimyasal ve floresan mikroskobu ile görünür olabilir. Immün için,% 5 ile 2 saat oda sıcaklığında fiksasyon veya permeabilization olmadan istenilen ikincil antikor kaynağı (PBS) serum doku şeritleri engellemek. </li><li> Uygun primer antikor ile doku şeridi inkübe edin (örneğin Rabbit bazal membran görselleştirmek için interstisyel kollajen (1:250 seyreltme), tavşan anti-laminin (1:250 seyreltme) görselleştirmek için anti-kolajen) 12 plaka iyi 1 saat süreyle hafif sallayarak bir rocker, 1 floresan etiketi (örn. Alexa Fluor 546 keçi anti-tavşan sekonder antikoru (1:250 seyreltme)) konjuge uygun ikincil antikor takip PBS ile her 5 dakika için örnek 3 kere yıkayın oda sıcaklığında saat. </li><li> 4 PBS PBS ve mağaza ile yaygın doku şeritleri yıkayın ° C </li><li> AFM karakterizasyonu hemen önce, poli-L-lisin kaplı 15 mm lamel, kayan doku altında lamel kaldırma doku şeridi lamel yüzeyi üzerinde eşit şekilde yayılır emin yaparak doku şeridi eklemek gerekirse, sandviç şerit ikinci bir temiz, lamel kaplanmamış ve poli-L-lisin kaplı lamel doku eki ile yardımcı olmak için hafif basınç uygulayın. </li><li> Microindentation deneyler, her turdan önce hemen üretimi talimatı aşağıdaki AFM sistemi kalibre edin. Gerçek konsol saptırma mesafe fotodiyot çıkış sinyali ölçekli kullanılan bir parametredir ve 2) konsol sapma duyarlılığı, Δd 1) konsol hava 6 termal dalgalanma yöntemi kullanarak sabit bahar: İki kritik parametreleri belirleyin. Sonra kuvvet-deplasman eğrisi (Fig.1B) eğimi hesaplamak temiz bir cam slayt PBS standart bir kuvvet-deplasman eğrisi elde sapma duyarlılığı kalibre edin. Ucu deplasman, Δz bir fonksiyonu olarak takip konsol saptırma, Δd, kuvvet-deplasman eğrisi ölçüm AFM ucuna doğru ve tek bir yerde (XY yönde rastering olmadan), numune yüzeyinden retrakte . </li></ol> 5 mikron çaplı borosilikat küresel ucu (Novascan) ile bir silisyum nitrür üçgen konsol kullanmanızı öneririz. 0,06 N / m sabit bir yay ile AFM problar kullanılarak, mekanik kayma modülü 50.000 Pa 100 yayılan yumuşak malzemelerin karakterize var. <ol start="6"><li> Kağıt mendil ile örnek lamel alt yüzeyi silin, vakum gres ile standart bir cam slayt tutturmak AFM örnek sahnede cam slayt monte ve 500 ul PBS (oda sıcaklığı) ile doku kapağı. </li><li> Mikroskop numune aşamasında ayarlayarak görüş alanının merkezinde AFM ucu hizalamak için göz parça görüntüleme için mikroskop ayarlayın. AFM örnek sahne hareket ettirerek doku üzerinde bir ilgi alanı seçin, daha sonra istediğiniz gibi, faz kontrast görüntü ve / veya doku floresan görüntüleri kaydetmek için izleme CCD kamera geçmek. </li><li> Numune ile temas halinde olduğu kadar yavaşça aşağıya doğru AFM ucu hareket standart AFM nişan işlemi gerçekleştirin. </li><li> Yumuşak örneklerin doğru AFM microindentation karakterizasyonu elastik modülü hesaplaması için kullanılan Hertz modeli geçersiz küçük girinti derinliklerinde büyük yerel suşların önlemek için gereklidir. Büyük suşlar önlemek için, 500 nm konsol maksimum sapma (tetik noktası) ayarı ile tetikleme modu girinti gerçekleştirin. Bu sapma sınırı dizginlemekmaksimum girinti zorlamak için en az 30 nN (F = konsol bahar sabit * deplasman, veya F max = 0.06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> Girinti hızı, yumuşak örnek 7, elastik yerine viskoelastik özellikleri keşfetmek için yeterince yavaş seçilmelidir . Saniyede 2-20 mikron arasında bir hız aralığında akciğer dokusu için uygundur. <ol start="10"><li> Bir ilgi alanı tek bir ölçüm için, AFM prob ilgi konuma taşımak ve standart bir kuvvet-deplasman eğrisi (prob XY tarama olmadan sadece Z-yönünde hareket) toplamak için tek bir girinti gerçekleştirmek. </li><li> Ilgi çeken bir bölge otomatik haritalama, Kuvvet-Harita moduna geçiş seçilen alanın içinde tarama boyutu ve örnek noktaları seçin. Kuvvet-Harita modu, AFM ucu girinti hareketler arasında örnek bir yüzey üzerinde rasterlar ve tanımlanmış bir örnek ızgara içinde, her noktada bireysel kuvvet-deplasman eğrileri toplar. Daha fazla örnekleme noktaları daha yüksek uzaysal çözünürlüğü sağlamak ancak haritalama için gerekli olan süreyi uzatacaktır. Biz pratik bir girinti hızı ~ 10 dakika içinde tamamlanabilir saniyede 20 mikron, 80 x 80 mikron alan haritaya 16 x 16 örnek ızgara kullanmak bulundu. </li></ol> 3. AFM Data Extraction <ol><li> Young modülü hesaplamak için kuvvet-deplasman eğrisi, en küçük kareler doğrusal olmayan kavisli uydurma 8 (Şekil 1 A, C) kullanarak Hertz küresel girinti modeli uyum: <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> burada F = k c * Δ d, konsol viraj için kuvveti, k c sabit konsol bahar olduğunu, Ar-kürenin ucu yarıçapı. δ = Δ z - Δ d girinti olan ve υ örneklemin Poisson oranı (. υ = 9 akciğer dokusu için 0.4). </li><li> Uyum kalitesini değerlendirmek için, non-lineer eğri uydurma sırasında, SSR değeri veya veri ve fit değerler arasındaki farkın karelerinin toplamı hesaplar. Büyük SSR değerleri ile &quot;kötü&quot; eğrileri verileri atarak, güvenilmez ya da un-yorumlanabilir ölçümleri ortadan kaldırın. </li><li> İstenirse, ilişki kullanılarak, kayma modülü (G) elastik modülü (E) E = 2 x (1 + υ) x G., kontur haritaları çizmek modülü veri Kuvvet-Harita modunda toplanan sertlik mekansal kalıpları görselleştirmek için (16 x 16 örnek ızgara örneğin 80 x 80 mikron alanı kapsayan). </li><li> Büyük miktarda kuvvet eğrisi veri işlemek için özel bir algoritma otomatik olarak 3.2 ve 3.3 (örneğin Matlab) belirtildiği gibi aynı usul ve parametreleri kullanarak kuvvet-deplasman eğrileri, özü modülü ve / veya arsa elastographs uygun için yazılmış olabilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 (bir) katı bir substrat üzerinde küresel bir prob (Dimitriadis E., ve ark 2002 Biophys J 8 izni ile yayınlanmıştır) kullanarak yumuşak bir örnek AFM microindentation şematik. (B) Temsilcisi kuvvet-deplasman eğrisi PBS içinde temiz bir cam slayt konsol saptırma duyarlılığını belirlemek için toplanır. (C) Temsilcisi kuvvet-deplasman eğrileri (A) karşılık gelen parametreleri gösteren yumuşak (mavi) ve sert (kırmızı) örnekleri toplanmıştır. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2A, doğrudan ilgi bölge üzerinde yer AFM probu ile PBS poli-L-lisin kaplı lamel bağlı ve microindentation haritalama için hazır bir akciğer parankimi şerit gösterir. Şekil 2B düzgün kesilmiş ve lekeli doku, akciğer parankiminin alveoler mikromimarisini fiksasyon veya permeabilization olmadan bazal membran bileşeni laminin immunofluorescent boyama görüldüğü gibi, korunmuş olduğunu gösterir. Kollajen taze Sabitlenmemiş akciğerlerde fibrozis 10 ikna etmek için daha önce PBS (Şekil 2C) ile tedavi edilen farelerden alınan hasat veya bleomisin (Şekil 2B) ile tedavi için Şekil 2 CD gösterisi immunofluorescent boyama . Şekil 3A AFM microindentation elde edilen numune kuvvet-deplasman grafikleri gösterir. Aynı uygulanan kuvvet ile, AFM ucu (daha sert bir bölge için küçük bir girinti ve &quot;dik&quot; bir kuvvet-deplasman eğrisi karşısında görece &quot;düz&quot; bir kuvvet-deplasman eğrisi, yumuşak bir bölge (mavi çizgi) üzerinde geniş bir girinti oluşturur kırmızı çizgi). Temiz gücü eğrileri elde etmek amacıyla, her bir girinti sonra AFM ucu sonraki girinti önce numune yüzeyinden ve iletişim tamamen retrakte olması gerekir. Bu kişi devlet ucu konsol saptırmadan çevirir Şekil 3A, eğrinin düz bir bölgeye karşılık gelir. Şekil 3B ucu tamamen numune yüzeyinden retrakte değil ne zaman oluşur (örneğin yumuşak bir örnek, bir düz bir bölge olmadan tipik bir yanlış eğrisiucu) temas noktası belirlemek imkansız ttaches. Ucu tamamen yumuşak örnek kaldıysa, eğri, açık bir saptırma, ancak küçük bir gürültü olmadan, Şekil 3C gösterildiği gibi görünebilir. Şekil 4 sertlik haritaları (elastographs), kayma modülü ile renk skalaları gibi mekansal görüntülenir kuvvet-deplasman eğrileri çıkarılan kayma modülü verileri gösterir. Elastographs özellikle fibrotik akciğer örneği içinde çarpıcı farklılıklar normal aralığı ve doku kayma modülü dağıtımı (Şekil 4A) ve fibrozis (Şekil 4B) akciğer parankiminin ve kayma modülü büyük mekansal varyasyonlar göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 (A) bir fare akciğer parankim şerit üzerinden AFM prob gösteren faz kontrast mikrografı. Ölçeği bar, 50 mm. (B) normal fare akciğer dokusunun normal akciğer parankimi alveoler mikromimarisini laminin immün gösteriyor. Beyaz kutu, tipik olarak 80-80μm elastikiyet haritalama alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 20 mm. (C ve D) immün serum fizyolojik (C) ve (D) bleomisin tedavi fare akciğer parankim kollajen. Ölçek barlar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 (A) Temsilcisi yorumlanabilir kuvvet-deplasman eğrileri sırasıyla salin (mavi) ve bleomisin ile tedavi edilen (kırmızı) fare akciğer parankimi toplanır. Siyah çizgiler kaynaklanan küresel Hertz modeli en uygun ve bunlara karşılık gelen hesaplanan Young modülü ile etiketlenir. (B, C) Temsilcisi un-yorumlanabilir kuvvet-deplasman eğrileri. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 tuzlu su (A) ve bleomisin ile tedavi edilen (B) fare akciğer parankimi toplanan Temsilcisi elastographs. Renk çubukları kilopascals kayma modülü göstermektedir. Eksen etiketleri mikrometre mekansal ölçekte göstermektedir. Ölçek çubuğu: 20 mikron

<ol>
	<li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells.">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening.">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+and+smooth+muscle+Ca(2+)+signaling+in+lung+slices+from+different+mouse+strains.">Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains.</a> J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).</li><li>Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+and+ambient-induced+deflections+of+scanning+force+microscope+cantilevers.">Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers.</a> Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).</li><li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+probe-based+frequency-dependent+microrheology+of+polymer+gels+and+biological+cells.">Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).</li><li>Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poissons'+ratio+of+lung+parenchyma+and+parenchymal+interaction+with+bronchi.">Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi.</a> Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).</li><li>Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression.">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).</li><li>Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+and+tissue+viscoelasticity+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis.+Temporal+aspects.">Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects.</a> Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).</li><li>Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+oscillatory+mechanics+of+rat+lung+parenchyma+in+bleomycin-induced+fibrosis.">Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).</li><li>Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+responses+to+the+mechanochemical+microenvironment--implications+for+regenerative+medicine+and+drug+delivery.">Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).</li><li>Berry, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+injection+after+myocardial+infarction+improves+myocardial+compliance.">Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).</li><li>Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+elastography+reveals+phenotypic+differences+in+alveolar+cell+stiffness.">Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness.</a> J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).</li><li>Wagh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+elasticity+measured+in+epithelial+cells+migrating+at+a+wound+edge+using+atomic+force+microscopy.">Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).</li><li>Martinez, F. J., Flaherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+function+testing+in+idiopathic+interstitial+pneumonias.">Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).</li><li>Cavalcante, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+interactions+between+collagen+and+proteoglycans:+implications+for+the+stability+of+lung+tissue.">Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue.</a> J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).</li><li>Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+shear+modulus+and+pleural+membrane+tension+of+the+lung.">Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung.</a> J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).</li><li>Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+constants+of+inflated+lobes+of+dog+lungs.">Elastic constants of inflated lobes of dog lungs.</a> J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).</li><li>Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+hybrid+computational+model+of+AFM+indentation+for+analysis+of+mechanically+heterogeneous+samples.">Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).</li><li>A-Hassan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AFM microindentation ile akciğer dokusunun mekanik karakterizasyonu, doku sertliği microscale varyasyonları üzerinde benzersiz bir bakış açısı sağlayarak, benzeri görülmemiş uzaysal çözünürlük (Şekil 4). Kendi programını bir örnek olarak, normal ve fibrotik akciğer dokusunda şeritleri önceki makro ölçekli ölçümler fibrozis 11,12 ile elastance yaklaşık 2-3 kat artış gösterdi. Aksine, AFM microindentation ~ 30 kat artar, normal akciğer dokusu 10 gözlenen ortanca üzerinde kayma modülü sergileyen bazı bölgelerde doku sertleşmesi, çok lokalize olduğunu ortaya koymaktadır . Matris sertlik şimdi kritik hücre fonksiyonunu etkileyen Bilindiği gibi, bu yerel ölçümleri, akciğer hücrelerinin hücre kültürü çalışması biofidelity geliştirmek için paha biçilmez parametreleri sağlamak. Birkaç pratik konular, akciğer dokusunun ince şeritler kullanımı ile ortaya çıkar. Altta yatan alveoller mimari doku profili aşağıdaki gibi şeritler yüzeyler, tamamen düz değildir. Numune yüzeyinden yüksekliği değişimi bu zorluğu aşmalarına yardımcı olmak için 15 mm daha küçüktür AFM sistemi girinti sırasında otomatik olarak Z-yönünde ipucu konumunu ayarlar. Ölçümler oda sıcaklığında değil, 37 ° C yapılır, bu yüzden onlar küçük olması bekleniyor buna rağmen bu sıcaklık değişimi neden mekanik özelliklerinde sapmalar, değerlendirilemez. Gözlenen mekanik özellikleri altta yatan alveoler duvar mimarisinin etkisi mevcut ışık mikroskobu kurulumu ile belirlemek zordur. Örneğin, alveol duvarları ile uyumlu veya duvar düzlemine enine yönde girintili anizotropi ve farklı mekanik özellikler sergiler belirlemek için arzu edilmektedir. Ancak, mevcut örneklerinin kalın ve görüntüleme sistemi dolayısıyla temas her noktada yerel alveoler duvar yönünü belirlemek için mümkün değildir, 3 boyutlu yeteneklere sahip değildir. Son olarak, ölçülen mekanik özellikleri hücresel bileşenlerinin etkisi tam olarak aydınlatılamamıştır kalır. Burada ayrıntılı yöntemleri, hiçbir çaba özellikle doku hücresel bileşenleri kaldırmak için yapılır. Ancak, hücrelerin yüzeyinde girinti için kullanılabilir mevcut doku hasat ve alveoller erişmek için doku kesme zorunluluğu bu yana geçen süre göz önüne alındığında uygulanabilir olması muhtemel. Hücreleri çıkarmak ya da matrisler canlı hücreleri ile yeniden doldurmanız ve doku sertliği ortaya çıkan değişiklikleri değerlendirmek Belirli deneyler garanti görünecektir. Bu ölçümler için gerekli taze Sabitlenmemiş doku olduğundan, doku hasat ölçümü geçen süreyi en aza indirilebilir ve örnekleri, 4 ° C mekanik özelliklerinde değişiklikleri önlemek için saklanmalıdır. Doku şeritler yıkama veya minimum bozulma veya hasar oluşturulur ve böylece boyama sırasında konteynerler arasında transfer olduğu özellikle dikkat edilmelidir. Sıvı AFM uygulama için önemli bir adım, mümkün olduğunca düz doku kesim ve destekleyici lamel örnek hareketsiz. Varsa, bir vibratome ya da doku dilimleme makinesi gibi otomatik bir kesit makine son derece uniform kalınlıkta dilimlemek için kullanılabilir. AFM ölçümleri hemen önce, doku şeritler eklemek ve örnek sonunda lamelleri ayırmak olarak AFM ölçümleri için geçen süreyi en aza indirmek için önemlidir. Yararlı bir gözlem fişleri kapak ve küçük şeritler PBS içinde daha uzun süreler için yerinde kalması daha stabil bağlamak için büyük şeritler görünür. AFM microindentation 5 mikron çapında küresel ucu ile bir standart 0,06 N / m konsol kullanarak 100 Pa 50 kPa (kayma modülü) için geniş bir aralığı kapsayan örnekleri karakterize. AFM, 0,6 ila 12 mm, 0,01 ila 0,58 N / m arasında değişen çap ve yay sabitleri piyasada bulunan (örneğin Novascan) ve genellikle 3 kullanılan arasında değişen küresel cam ipuçları probları; Bu aralık, farklı yay sabitleri problar kullanılarak açılabilir. 5 mikron küresel bir ucu, ucu ve doku arasındaki teorik temas alanı, 400-700 nm girinti (Şekil 1A) için 5-9 mikron 2. Küçük veya daha büyük ipuçları, uzaysal çözünürlüğü daha küçük veya daha büyük ölçeklerde sağlamak için kullanılabilir. Piramidal ipuçları da daha az temas alanları sağlamak ve böylece veri uydurma, bu uç geometrisi için daha karmaşık olmasına rağmen, haritalama, mekansal çözünürlükte artan AFM microindentation 13-16 kullanılır. Bu yöntem çeşitli sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Akciğer geleneksel mekanik basınç-hacim analizi 17 ya da tüm akciğerlerin yumruk girinti 19,20 kullanarak örneğin, non-invaziv karakterize olmuştur. Hava-sıvı int kaybı yoluyla akciğer mimarisinin önemli yollarından değiştirmek Burada açıklanan biri olarak invaziv yöntemlernormalde hava dolu akciğer ve solunum kaslarının gevşemesi üzerine akciğer kısmi enflasyon korur öncesi stres kaybı var erface. Bu sınırlamalar, akciğer dokusunda şeritler 18 yapılan tüm ölçümlerde sık görülür . Özellikle, bununla birlikte, medyan sertlik dinlenme hacimleri 19,20 sağlam akciğerlere yumruk-girinti dayalı tahminlerden önemli ölçüde farklılık göstermemektedir parankimi normal akciğer dokusunun (kayma modülü ~ 0.5kPa) ölçülür. Akciğer dokusunda artan deformasyonla birlikte non-lineer sertleşme sergilemek bilinen olsa da, sıkı bir moda bu özellik burada istihdam yöntemleri ile mikro ölçekli aşağı devam olmadığını test etmek mümkün değildir. Hertz, model, örnek homojenlik varsayar. Ancak, akciğer parankiminin dahil olmak üzere birçok biyolojik maddeler, mekansal ölçekler azalan giderek daha heterojen. Young modülü, yani deforme katmanı veya bileşen göre girinti derinliğine bağlı değişimi gibi eserler örnek heterojen neden olabilir. Xy-düzlemi heterojenite biyomateryal Dimitriadis EK ve ark tarafından önerilen mikro bağlı olarak uygun bir küresel uç boyutu dikkatle seçerek sınırlı olabilir. 8. Bu malzeme nedeniyle Hertz modeli hatası tahmin ya da düzeltmek için çok daha zordur z-yönünde heterojenite. Azeloglu ve ark. Son zamanlarda ayrık gömülü kapanımlar 21 ile heterojen substrat elastik özelliklerini karakterize etmek için melez bir hesaplama modeli önerdi. Onların yeni bir teknik Hertz analiz sınırlamaları tamamen ortadan kaldırıp heterojen malzemeler dahil özelliklerini hesaplamak için potansiyel bir gelir sağlar. Biyolojik materyaller genellikle zamana bağımlı viskoelastik davranışları görüntülemek Hertz model aynı zamanda, mutlak elastik davranış varsayar. Tam bir doku viskoelastik karakterizasyonu değişen kullanılan girinti hızları elde edilebilir. Önemlisi, normal ve fibrotik akciğer dokusunda önceki makro ölçekli mekanik test, akciğer dokusunun mekanik özellikleri zayıf frekans bağımlılığı ve tüm frekansları arasında normal ve fibrotik doku mekanik özellikleri arasındaki farklılıkların korunması gösteren 11 test . Bu bulgular, güçlü tek bir girinti hızı ile AFM kullanarak mekanik özellikleri ölçümü fibrozis eşlik doku mekanik özelliklerinde değişiklikler önemli bir yönünü yakalar öneririz. Bu çalışmada kullanılan akciğer dokusu için 0,4 Poisson oranı makroskopik ölçüm 9. Ne yazık ki, Poisson oranı ve mikro ölçekli hastalığı koşul altında herhangi bir değişiklik, literatürde mevcut değildir. E, E / (1-υ 2) veya (1-υ 2) / πE alternatifler (elastik sabiti k gösterilir) olarak 22 AFM microindentation hesaplanır ve Poisson oranı bilinmiyor olabilir. En biyomalzemeler için Poisson oranı yüksek su içeriği nedeniyle 0,4 - 0,5 aralığında. 1 / (1-υ 2) faktörü 0.3-0.5 aralığı içinde, Poisson oranı makul farklılıklar rapor modülü sadece mütevazı etkiler, sadece 1,10-1,33 değişir. Normal doku fibrotik doku akrabası için rapor artış kayma modülü, Poisson oranı farklılıklar ile ilişkili hataları gözlenen mekanik özellikleri değişiklikleri küçük ima, büyüklüğü birkaç kat. Kuvvet-deplasman veri analizi için kullanılabilir gerçek algoritma ve kod özel uygulama durumu ve kuvvet-deplasman eğrileri çeşitli topluluklar sonraki özellikleri tabidir. Daha sofistike bir analiz ilgi ise, bir iş Lin ve ark danışabilirler 23. Yazarlar, daha önce Hertz girinti veri modelleri uydurma otomatikleştirmek için çabalarını engellemiştir komplikasyonlar birçok üstesinden bir algoritma sinerjik stratejilerinin bir dizi derlenmiş. Birçok diğer alanlarda daha da geliştirilmesi ve kullanılması için bu yöntem kullanılabilir. Bir antikor etiketleme olmadan alveol duvarlarını görselleştirme ilgi durumlarda, elastin ve kolajen yeşil spektrum autofluorescent sinyal görüntülenebilmekte. Öte yandan, ince doku kesitlerinde, 3D görüntüleme teknikleri ya da her ikisi kullanılarak daha iyi görüntüleme, mekanik özellikleri altında yatan mimari dokusu ilişkilendirmek için yeteneklerini geliştirmek. Mevcut yöntemlerden, kollajen ve laminin gibi ekstraselüler matriks bileşenleri boyama ve görselleştirme izin verirken, daha fazla çaba gösterilmesi, belirli hücre popülasyonlarının belirlenmesi ve bu tür popülasyonlarının çevresinde mekanik mikroçevrelerde karakterize hücre yüzey belirteçleri boyama hedef olabilir. Alternatively, doku işaretleyicileri veya hücre spesifik proteinlerin aynı hedefi takip soyundan floresan etiketli ifade farelerden alınan hasat olabilir. Son olarak, burada bozulmasina astım bozulmasina hipertansiyon damarları ve solunum yolları, akciğer, diğer anatomik özellikleri karakterize uygun görünür ayrıntılı yöntem. Göre, daha fazla geliştirme için potansiyel gelişimi ve bugünkü durumu hakkında AFM microindentation doku sertliği akciğer hastalığın ilerlemesi eşlik değişiklikler hakkında değerli bilgiler verim hazır görünüyor ve herhangi bir mekansal ve zamansal değişiklikler karakterize değeri şüphesiz diğer yumuşak dokularda çeşitli sertlik.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> AFM ucu </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 mikron Borosilikat boncuk, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin lamelleri </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm yuvarlak No.1 cam </td></tr><tr><td> Agaroz, Düşük Jelleşme Sıcaklık </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Kollajen (PAB) Rb antikor </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 keçi anti-tavşan antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan, anti-Laminin </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matrix sertliği 1-3 yapışık hücrelerin büyüme, farklılaşma ve fonksiyon kuvvetle etkiler. Makro ölçekte doku ve organlar, insan vücudu içinde sertlik büyüklüğü 4 çeşitli siparişler kapsar. Daha az sertlik dokular içinde mekansal değişir nasıl bilinir ve sertlik değişikliklerin kapsamı ve mekansal ölçekte doku remodeling sonucu hastalık süreçleri nelerdir. Daha iyi anlamak matris sertlik değişiklikler, sağlık ve hastalık hücresel fizyoloji nasıl katkıda için, yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte elde edilen doku sertliği ölçümleri ihtiyaç vardır. Bu, akciğer, son derece uyumlu ve elastik doku matriks remodeling, astım, amfizem, hipertansiyon ve fibrozis gibi hastalıkların önemli bir özelliği olduğu için özellikle doğrudur. Yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte akciğer parankiminin yerel mekanik ortamı karakterize etmek için, biz doğrudan yerel atomik kuvvet mikroskobu (AFM) microindentation kullanarak taze fare akciğer dokusunun elastik özellikleri ölçmek için yöntemler geliştirdiler. AFM indentor, konsol ve girinti derinliği uygun seçeneği ile, bu yöntemler faz kontrast ve floresan görüntüleme ilgi bölge ile paralel olarak yerel doku kayma modülü ölçümleri izin verir. Doku şeritleri Sistematik örnekleme, kayma modülü yerel mekansal değişimler ortaya doku mekanik özelliklerini haritalar sağlar. Mekanik özellikleri ve altta yatan anatomik ve patolojik özellikler arasındaki korelasyon sertlik fibrozis matriks birikimi ile nasıl değişeceğini göstermektedir. Bu yöntemler yerel doku mekanik özelliklerini alan ve hastalığın ilerlemesi üzerinde nasıl değişiklik gösterdiğini ortaya çıkarmak için diğer yumuşak dokular ve hastalık süreçleri kadar uzatılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Görüntüleme.  Harvard School of Public Health. Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Video: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Biyoloji

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Fare Retina Kılcal Damarlarında ve Subendotelyal Matrikste Sertlik Ölçümü

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

Yazar Gündemi: Erken Diyabetik Retinopatide Vasküler Sertlik ve İnflamasyonun Araştırılması

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.