Giriş MicroRNA birçok önemli biyolojik süreçlerin aktivitesini düzenleyen gen ekspresyonu önemli bir düzenleyici olarak ortaya çıkmıştır. 700&#39;den fazla insan miRNA&#39;lar Şimdiye kadar 1 tanımlanan, mutasyonlar ve miRNA&#39;lar yanlış düzenleme, kanser ve kalp hastalığı 2,3 gibi çeşitli fizyolojik bozukluklar ile bağlantılı olması şaşırtıcı değil. Son çalışmalar miRNA düzenleyici bağlayıcı sitelerin çoğunluğu 3&#39;UTRs 4,5 olduğunu göstermiştir ve bazı araştırmacılar, yüzlerce hücre 6 miRNA başına hedefleri olduğunu tahmin etmektedir . MiRNA&#39;lar biyolojik önemi göz önüne alındığında, çok sayıda var miRNA&#39;lar ve bunların her biri için çok sayıda hedefler, araştırmacılar, güvenilir, tercihen yüksek verimli çalışmalar için uygun platformlarda miRNA&#39;lar endojen hedefleri tespit etmek mümkün olduğu kritik öneme sahiptir. MiRBase, TargetScan ve PicTar 1,6,7 gibi hesaplama araçlarını kullanarak herhangi bir miRNA için olası mRNA hedefleri listeleri oluşturmak için güçlü bir yol olsa da, tahminlerin henüz sadece 8 güvenerek yeterince doğru değildir . Bu nedenle, araştırmacılar da hedefleri de novo öngörülen hedefler belirlemek veya doğrulamak için bir dizi deneysel yaklaşımlar kaldıraç. Birçok ekipleri ifade değişiklikleri miRNA aktivite olduğunda 4,9,10 tedirgin olan genleri tanımlamak için kararlı durum mRNA veya protein düzeyleri yüksek verimlilik önlemleri dayanıyordu. Bu tür değişiklikler, ancak bir miRNA bir transkript ve dolaylı veya alt sinyalizasyon etkileri üzerinde doğrudan etkileri arasında bir ayrım yapmaz, hiç kuşkusuz genel ifade değişiklikleri ölçerek biyolojik olarak anlamlı ve önemli bir ilk adımı temsil ediyor. MiRNA-mRNA doğrudan etkileşim için kanıt Diğer güçlü araçlar miRNA&#39;lar ve mRNA&#39;ların çapraz bağ argonaute proteinler (ve böylece RISC kompleksi), etkileşim ortakları belirlemek rağmen derhal işlevsel etkileri göstermek değildir kromatin-immunoprecipitation (ChIP) stratejileri gibi bağlayıcı bir olay 5,11. Böylece, belirli bir UTR miRNA etkisi için fonksiyonel kanıt 3&#39;UTR muhabiri testlerin, kapsamlı bir miRNA çalışmanın önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Hesaplamalı hedef öngörüleri veya ifade ve proteomik verileri ile birlikte ele alındığında bu hücre bazlı analiz verileri belirli bir 3&#39;UTR doğrudan ilgi miRNA tarafından düzenlenir dair güçlü kanıtlar sağlar. 3&#39;UTR muhabiri tahlil, ilgi bir gen 3&#39;UTR lusiferaz muhabiri gen sonuna kadar erimiş. 3&#39;UTR bir miRNA bir hedef ise, muhabir transkript istikrar ve / veya çeviri verimliliği fonksiyonel miRNA konsantrasyon değişimi ile değişecektir. Yani transkript-bazlı testlerin aksine, muhabir testlerinde istikrarlı bir devlet mRNA ve protein düzeyleri üzerindeki etkileri tespit yardımcı olur. Muhabir sistemleri de aslında interaction8 için gerekli olduğunu onaylamak için bir 3&#39;UTR bir varsayılan miRNA bağlayıcı site mutagenizing fonksiyonel etkilerini incelemek için de kullanılıyor olabilir. Ifade diziler, proteomik teknikler ve argonaute ChIP kullanarak büyük ölçekli çalışmalar, çok az sayıda deneysel koşullar, hücre tabanlı muhabiri deneyleri için değerli genom veri sağlar miRNA-3 &#39;çalışma için ölçeklendirme için en müsait UTR etkileşimler gibi koşullar yüzlerce ya da binlerce küçük moleküller veya diğer kütüphane tabanlı etkileyiciler yüksek verimli tarama için gerekli olabilir. Birçok bilim adamı çalışma miRNA 3&#39;UTR etkileşimleri muhabiri tahlil teknolojisini uyguladık. Ancak, birçok miRNA&#39;lar her hedef yüzlerce farklı transkript, yüksek verimli bir ölçekte bu güçlü bir yaklaşım kullanmak için araştırmacılar için zor olduğunu fikri ile binlerce farklı oluşturmak için klonlama, doğrulama ve optimizasyon adımları çünkü 3&#39;UTR muhabir vektörler pahalıdır maliyet. 3&#39;UTR-muhabiri, küçük ve büyük ölçekli çalışmalar herhangi bir araştırmacı için ulaşılabilir kılmak amacıyla, biz, insan 3&#39;UTRs yüksek optimize LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi içine önceden klonlanmış bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. Muhabir sistemi de doğrulanmış kontrolü vektörler, pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere 700&#39;den fazla sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları bir dizi ve bir dizi standart deney protokolleri içerir. Aşağıdaki protokolü kullanarak, belirli bir insan 3&#39;UTR ilgi miRNA bir hedef olup olmadığını sorabilirsiniz. Bu iş akışında kritik adımlar, deneysel tasarım, muhabir yapıları ve miRNA taklit transfeksiyon, lusiferaz muhabiri testleri ve veri analizi. Deneysel tasarım, düşünceli bir transfectable hücre hattı, deney ve kontrol muhabiri yapıları, ve miRNA taklit ve hedefleme kontrolleri önemlidir. Ortak yüksek transfectable adhHT1080, HepG2 gibi erent hücre hatları, HCT-116, Hela, 293, ve diğerleri genellikle bu protokol ile iyi çalışır. Deneysel tasarım ile ilgili önemli notlar LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi RenSP lusiferaz gen ve LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanan GoClone yapıları içeren bir tam optimize muhabiri sistemi. En iyi muhabir tahlil sonuçları elde etmek için önerilen LightSwitch Sistem tüm bileşenleri kullanın. Şalt GoClone muhabiri yapıları ile herhangi bir oligos / plazmid Co-transfeksiyon non-spesifik bir şekilde genel lusiferaz sinyalleri azaltır. Bu nedenle, aşağıdaki transfeksiyon kombinasyonları gerçekleştirmek için önemlidir: sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabiri + özel miRNA. Empty_3UTR vektör (güçlü organizatörü, UTR yok) lusiferaz sinyal çok yüksek bir seviyeye sağlar ve transfeksiyon verimliliği için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve sentetik miRNA hedef muhabiri vektör taklit aktivite için bir pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, biz doğru sıra-özel vs non-spesifik etkileri ayırmak için GoClone 3&#39;UTR temizlik kontrolleri ve rasgele denetimler kullanmanızı öneririz. Çalışma protokolü ve mümkün pipetleme hata veya buharlaşma nedeniyle veri değişkenliği azaltmak için master miksler yapmak. Bu protokol DharmaFect Duo transfeksiyon reaktifi (Dharmacon) kullanır. 1. Gün ÖNEMLİ İPUCU: hücre hattı akıllıca seçin. En iyi sonuç için, transfectable olduğu bilinen bir hücre hattı kullanın. Biz de o belirli miRNA yüksek endojen seviyeleri ile hücre hatları içinde zayıflatılmış bir miRNA 3 &#39;UTR muhabiri ölçülebilir yanıt taklit olduğunu bulduk. Hücre hattı ifade miRNA nasıl bilmiyorsanız, dolaylı bir hücre, testin dinamik aralık olarak bildiren yanı sıra belirli bir miRNA bolluğu önlemler SGG sentetik microRNA hedef deneyin. 1. Tohum hücreleri transfeksiyon süresi ≥ 80% izdiham verim. <ol><li> Tohum hücreleri 100μl toplam hacmi 96-de beyaz TC plaka. </li><li> Izdiham değerlendirmek için net 96-plaka paralel, tohum hücrelerin uygun sayıda. </li></ol> ÖNEMLİ İPUCU 1: Confluence taklit deney iyi sonuçlar elde anahtarıdır. Optimum demonte için, hücre Transfeksiyondan zamanda konfluent% 100 olmalıdır. ÖNEMLİ İPUCU 2: En iyi sonuçları elde etmek için düşük geçit hücreleri kullanın. Çok kez geçişli olan hücreler gürültülü transfeksiyon veri verim eğilimindedir. 2. Gün GoClonereporter yapıları ve miRNA&#39;lar hazırlayın, sonra konfluent hücrelerin içine transfect. 2. Oluşturur hazırlayın <ol><li> Çözülme GoClone yapıları oda sıcaklığında (plazmid DNA). İyice karıştırın. </li><li> Santrifüj kapağı yoğunlaşma kaldırmak için. </li></ol> 3. Mikro RNA&#39;lar hazırlayın <ol><li> Oda sıcaklığı ve yoğuşma kapakları kaldırmak için santrifüj çözülme microRNA (özel taklit ve hedefleme olmayan kontroller). </li><li> RNaz içermeyen su 2 mcM bir çalışma konsantrasyonu seyreltilir. </li></ol> Deneysel bir miRNA ek olarak DAİMA olmayan bir hedefleme miRNA kontrolü de taklit ediyor. Co-transfecting plazmid ve küçük bir RNA oligo yalnız plazmid transfecting daha düşük sinyal yol açar. Bir veya daha fazla pozitif kontroller içerir. SGG katalog sentetik miRNA hedef muhabiri vektörler yüzlerce birini kullanmayı düşünün. Bir veya daha fazla negatif veya non-spesifik kontrolleri ekleyin. SGG kontrolleri 3 &#39;UTRs housekeeping genler, rastgele parçaları ve / veya boş (hayır UTR insert) kontrolü de dahil olmak üzere bir dizi vardır. Bir veya daha fazla deneysel bir yapı ile birlikte bu denetimleri özel miRNA veya olmayan hedefleme kontrolü aşırı ekspresyonu atfedilebilecek herhangi bir non-spesifik etkileri normalleştirmek için izin verecektir. 4. Transfections hazırlayın <ol><li> Her transfeksiyon için tek bir tahlil için aşağıdaki reaktifler birleştirmek: </li></ol> Karışım 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Bireysel GoClone muhabiri: </td><td> 3.33 mcL </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> * Değişir. </td></tr><tr><td> Serum ücretsiz medya: </td><td> 10 mcL </td></tr></tbody></table> * Etkili konsantrasyon miRNA 10 nM-100 nM değişebilir. Uygun konsantrasyonu için miRNA üreticisine danışın. ÖNEMLİ İPUCU: taklit çok fazla eklemek etmeyin. Taklit konsantrasyonları için makul bir son 100uL reaksiyon aralığı 10-50 nM. En az üç çoğaltma gerçekleştirinte her bir tedavi / UTR kombinasyonu transfections ve hata pipetleme izin vermek için ek hacim içerir. Örneğin, hata veya buharlaşma pipetleme için ekstra dahil olmak üzere 3 çoğaltmak transfeksiyon kuyu için yeterli transfeksiyon karışımı elde etmek için tek bir reaksiyon hacimleri 3.5 ile çarpın. Her muhabir için, aşağıdaki çoğaltır kurmak sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabir + özel miRNA. Olmayan bir hedefleme kontrolü için olduğu gibi, aynı zamanda hedef microRNA transfections ayarlayın. <ol start="2"><li> DharmaFECT DUO (Dharmacon) karışımı olarak her transfeksiyon için aşağıdaki Makyaj: </li></ol> Karışım 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0.15 mcL </td></tr><tr><td> Serum ücretsiz medya: </td><td> 9,85 mcL </td></tr></tbody></table> DharmaFECT Duo eklenecek miktar bağımlı hücre hattı olabilir. Yukarıda belirtilen miktarda HT1080 hücreler için uygun. Hücre hattı için uygun miktarını belirlemek için üreticinin belgelerine bakın. İpucu: gazetecilere sayısına göre yukarıdaki miktarlar çarpılarak büyük bir transfeksiyon karışımı olun sayısını çoğaltır ve miRNA&#39;lar sayısı test edilecek. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için miktarı hesaplanırken, hataları ve buharlaşma pipetleme için hesap için ekstra bir miktar eklemeyi unutmayın. <ol start="3"><li> DharmaFECT Duo karışım 5 dakika oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> 5 dakika sonra, hazırlanan 10uL plazmid ve / veya miRNA (Karışım 1) her tüp DharmaFECT Duo karışımı (Karışım 2) 10μL ekleyin. Her tüp daha sonra çoğaltmak transfeksiyon başına 20μL hacmi içermelidir. </li><li> Her karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 20 dakika sonra, her tüp çoğaltmak transfeksiyon başına 100μL toplam 80 mcL çoğaltmak için önceden ısıtılmış (37 ° C), antibiyotik içermeyen, tam medya ekleyin. Birçok eş zamanlı olarak çoğaltır ve örnekler hazırlanması için kullanılan derin kuyu blok olabilir. Yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın. </li><li> Inkübatör numaralı seribaşı plaka çıkarın. Hücrelerin en az% 80 konfluent olduğundan emin olun. </li><li> Her kuyudan medya kapalı dikkatlice pipetlemeyin. </li><li> Her iyi transfeksiyon karışımı (20uL DNA / reaktif karışımı + 80uL medya) 100μL ekle. </li><li> Gecede inkübatör yerleştirin plakası. </li></ol> Aşırı inkübe etmeyin. En çok taklit eden 24 saat içinde iyi niyetli hedefleri üzerinde önemli sonuçlar üretecektir. 48 saat ölçülebilir baskı daha büyük olabilir, ama çok iyi değişkenlik iyi olacak. Mimik deneyler inhibitörü deneyler daha kolaydır. En çok taklit eden 24 saat içinde gerçek hedefleri önemli ölçüde bastırmak da inhibitörü ilişkin de baskının önemli ölçülebilir olması için 48 saat alabilir ve hemen hemen her zaman taklit etkisi daha az belirgin olacaktır. 3. Gün Not: Lusiferaz testlerin hemen yapılabilir ya da plakaları -80 dondurulmuş olabilir ° C (donma genellikle hücre lizis ve lusiferaz sinyal artar) . Dondurma ve en iyi sonuç için assaying önce hücreleri Çözülme. LightSwitch Testi Reaktif eklemeden önce oda sıcaklığına kadar donmuş hücreleri çözülme izin UNUTMAYIN. 5. LightSwitch AssayReagents ile ölçün lusiferaz aktivitesini <ol><li> Inkübatör plakasını çıkarın ve oda sıcaklığına getirmek. </li><li> LightSwitch Testi Reaktifler (LS010 kiti için, diğer kiti boyutları protokolleri çevrimiçi bulunabilir) hazırlayın: <ol><li> Liyofilize Testi Yüzey tüp Solvent Yüzey 100μL ekleyerek sulandırın 100X Yüzey ışıktan koruyunuz ve oda sıcaklığında süresini en aza indirmek. 100X Yüzey, 2-3 haftayı-20C saklanabilir . En iyi sonuç için, taze sulandırılmış substrat kullanın. </li><li> Testi Buffer oda sıcaklığında su banyosunda 10 ml şişe çözülme Testi Çözüm hazırlayın ve kullanmadan önce sulandırılmış 100X Yüzey 100μL ekleyin. İyice karıştırın. </li></ol></li><li> Doğrudan beyaz 96-plaka Her numune (100uL hücreleri + medya içeren) 100μL LightSwitch Assay Çözümü (buffer + substrat) eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. Hücreleri başka bir plaka veya cam şişe biçimi, transfer örnekleri yetiştirilen olsaydı 100μL toplam hacmi (medya ya da PBS) beyaz 96 plaka. </li><li> Kapak plakası, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eğer birden fazla plaka assaying, böylece her bir plaka okuma 30 dakika önce kuluçkaya yanı sıra tahlil çözüm bocalama . </li><li> 2 saniye boyunca her bir plaka lumi iyi okuyunnometer (SPECTRAmax L veya muadili). </li><li> (Lüminesans = Belirli miRNA / kontrol dışı hedef), hedefleme kontrolü üzerinde özel miRNA için her bir yapı için lusiferaz sinyal oranını hesaplarken demonte hesaplayın. UTR non-spesifik tedavi etkileri kontrol etmek için temizlik, rastgele ve boş yapıları verileri kullanın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Bir hedefleme miRNA varlığı 3&#39;UTR hedefleri lusiferaz demonte göstermektedir. Let-7a 3&#39;UTR lusiferaz muhabiri faaliyet demonte Işıklı muhabiri okuduktan sonra, 24 saat süreyle inkübe 20nm izin 7a taklit veya hedefleme kontrolü ile inşa HT1080 hücrelerinde her muhabir co-transfecting 100ng tarafından ölçüldü LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanarak sinyal. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Nokt ve ARID3B insan 3&#39;UTRs let-7a microRNA hedeflerdir. Nokt ve ARID3B genlerin insan 3&#39;UTR gazetecilere gelen sinyaller let-7a microRNA varlığı önemli ölçüde yere serdi taklit ederken temizlik ve rasgele sıra sinyalleri UTRs değil.

<ol>
	<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cancer+connection:+the+beginning+of+a+new+tale.">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li><li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li><li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li><li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance.">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in.">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li><li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122.">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li><li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs.">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li><li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function.">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li><li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing.">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li><li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p.">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , (2011).</li></ol>

Yazarlar bu makalede yer alan araçlar ve reaktifler yapmak Şalt Genomik çalışanları. Bu makalenin Üretim Şalt Genomik sponsor oldu.

Biz, canlı hücreler olarak miRNA 3&#39;UTR etkileşimleri çalışmalarını sağlamak için ön klonlanmış insan 3&#39;UTR-muhabiri yapıları bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. İşte biz lusiferaz muhabiri sistemi kullanarak 3&#39;UTR-muhabirleri ile birlikte transfecting miRNA taklit ve yüksek işlem tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymuştur. Bu yöntem son derece transfectable hücre hattı kullanarak ve bir aşırı ekspresyonu tekniği ile miRNA faaliyet rahatsızlık vermesini araştırmacılar dayanır. Kötü transfectable hücre hatları kullanan araştırmacılar Sigma (Misyon 3&#39;UTR Lenti GoClones) ile birlikte oluşturulan arkadaşı lentiviral 3&#39;UTR muhabiri toplama kullanmayı düşünebilirsiniz. MiRNA ile hücrelerin tedavisinde aşırı ekspresyonu-tipi bir deneyde sonuçlar taklit eder, ve bu tür bir çalışmada, araştırmacılar, şu ya da gerçek fizyolojik şartlar temsil etmemektedir olabilir ki hesaba katması gerekiyor. Aşırı ekspresyonu endişeleri gidermek için, araştırmacılar pertürbasyon 12-14 iki farklı tipleri ile etkileşim çalışması miRNA inhibitörleri taklit için ek olarak kullanabilirsiniz. Bir kez büyük olasılıkla miRNA hedefler belirlenmiştir, araştırmacılar siteler fonksiyonel etkileşim için gerekli olup olmadığını belirlemek için varsayılan miRNA bağlanma yerleri mutagenize isteyebilirsiniz. Ayrıca yüzlerce farklı potansiyel hedef UTRs (Boutz) test büyütmek isteyebilirsiniz. Buna ek olarak, araştırmacılar miRNA transkript istikrar ya da tercüme verimliliği etkileyen olup olmadığını olarak ilgilenen eğer lusiferaz muhabiri verileri önlemleri kararlı durum transkript seviyeleri karşılaştırıldığında olabilir. Orantılı bir değişim transkript düzeyleri ile ilişkili değildir lusiferaz sinyali herhangi bir değişiklik Çeviri verimliliği üzerinde bir etkisi işaret eder. Son olarak, araştırmacıların farklı UTRs göreli hassasiyeti miRNA konsantrasyonu 14 değişikliklere karşılaştırmak için muhabir vektörler bir doz yanıt eğrisi oluşturmak kullanabilirsiniz.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Beyaz Doku Kültürü Levhalar (96 katı alt) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Kapaklı Clear Doku Kültürü Levhalar (96-well) </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktif </td><td> Şalt </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfeksiyon Reaktif (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Folyo Plaka Sızdırmazlık Tape </td><td> E &amp; K Bilimsel </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Nefes Plaka Sızdırmazlık Tape </td><td> E &amp; K Bilimsel </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Plaka Luminometre </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> SPECTRAmax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

MicroRNA (miRNA&#39;lar) gen ekspresyonu önemli regülatörleri ve birçok biyolojik süreçlerin bir rol oynayabilir. Her biri benzersiz hedef mRNA&#39;ların yüzlerce kadar olan 700&#39;den fazla insan miRNA&#39;lar şimdiye kadar tespit edilmiştir. Hesaplamalı araçları, ifade ve proteomik Testler ve kromatin-immunoprecipitation tabanlı teknikler belirli bir miRNA doğrudan hedefleri olan mRNA&#39;ların tanımlamak için önemli ipuçları sağlar. Onlar için işlevsel kanıtlar sağlar ve hücre tabanlı bir sistem belirli miRNA 3&#39;UTR etkileşimlerin etkileri Asitli Bunun yanı sıra, 3&#39;UTR muhabir testleri ayrıntılı miRNA hedef çalışmaların önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Kaldıraç 3&#39;UTR muhabiri deneyleri için daha fazla araştırmacılar etkinleştirmek ve ölçek yüksek performans seviyesi testleri desteklemek için, biz, son derece optimize edilmiş LightSwitch Lusiferaz, insan 3&#39;UTR lusiferaz gazetecilere genom bir koleksiyon yarattık Testi Sistemi. Bu sistem aynı zamanda, pozitif kontrol, çeşitli endojen 3&#39;UTR muhabiri yapıları, ve bir dizi standart deney protokolleri olarak kullanmak için sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları içerir. Burada miRNA, verimli, tekrarlanabilir ve yüksek verimlilik analizi için uygun olduğunu taklit ile birlikte tek tek 3&#39;UTR muhabir yapıları co-transfeksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells at 

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNA (miRNA&#39;lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.0K Görüntüleme.  SwitchGear Genomics. MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

Video: Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Biyoloji

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling&#39;den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.