Bu protokol, belirli bir hastalık veya tedaviye bağlı olarak hücre morfolojisindeki değişiklikleri gözlemlemek için temas modu atomik kuvvet mikroskobunun kullanımını gösterir. Kontaminasyonu önlemek için bu prosedür için kapalı kapların kullanılması ve yaşlanmayı önlemek için sabit numunenin mümkün olan en kısa sürede analiz edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Numune kuruyana kadar slaytı birkaç kez yavaşça bir alevin üzerinden geçirerek numuneleri slayta sabitleyerek başlayın.
Sabit numuneleri bir Petri kabına yerleştirin ve gözlem için atomik kuvvet mikroskobu ekipmanına taşıyın. Ardından, bilgisayarı ve atomik kuvvet mikroskobunu açın. Ardından yazılımda temas modunu, ContAI-G problarını ve otomatik eğim seçeneklerini seçin.
Ayar noktasını 20 nanometreye, P kazancını 10.000'e, I kazancını 1.000'e, D kazancını sıfıra ve uç voltajını sıfır milivolta ayarlayarak Z denetleyicisi için varsayılan değerleri ayarlayın. 70 mikrometre tarama aralığı kafasını kullanarak numuneleri AFM temas moduna yerleştirin. Tarama kafasına entegre edilmiş iki lense monte edilmiş bir kamera kullanarak probun altındaki alanın yüzeyinin hızlı bir görünümünü elde edin.
Şimdi, XY düzleminde manuel olarak yer değiştirerek istediğiniz alanı seçin. Temas sağlanana kadar probun numune yüzeyine elektronik olarak yaklaşmasına izin verin. XY eğim yönünü azaltarak tarayıcının ve numune yüzeyinin XY ölçüm düzlemini elektronik olarak ayarlayın.
Yazılımın standart parametrelerini saniyede bir satıra ve satır başına 256 noktaya ayarlayın. Ardından, 70 x 70 mikrometrelik bir alanda tam bir tarama aralığı gerçekleştirin. Yakınlaştırma aracını kullanarak daha küçük alanı seçin.
Konsol elektronik olarak geri çekerek ve numuneyi XY düzlemi boyunca hareket ettirerek numuneden yeni bir alan seçin. Ardından, daha önce gösterildiği gibi yeni bir tarama gerçekleştirin. Ardından, veri işlemeyi gerçekleştirmek için filtre seçimindeki görüntünün araçlar menüsündeki satır satır seviyelendirmeyi kullanın.
En iyi görüntü çözünürlüğünü elde etmek için renk çubuğundaki maksimum ve minimum yüksekliği optimize edin. Son olarak, analiz menüsünü kullanarak görüntü analizini gerçekleştirin. Uzunluğu ve mesafeyi belirlemek için istediğiniz araçla başlangıç ve bitiş noktalarını seçin.
Bakteri kültürlerinin atomik kuvvet mikroskobik analizi, Staphylococcus aureus kültürlerinin kok agregaları olan bölgelere dağıldığını göstermiştir. Artan ölçekler, popülasyon dağılımı ve kok morfolojisinin daha fazla takdir edildiğini göstermiştir. AFM temas modu görüntüleri, ortalama 1.25 mikrometre genişliğini gösteren kokların boyutunun belirlenmesine izin verdi.
Pseudomonas hunanensis, yapışkan bir tek tabaka oluşturan tüm cam destek yüzeyinde homojen bir dağılım gösterdi. Kültürler 1.9 mikrometre uzunluğunda ve 0.9 mikrometre genişliğinde çubuk şeklindeydi. Staphylococcus aureus'un magnezyum oksit nanopartiküllerinin mikro seyreltmeye maruz kalması, ciddi hücresel yapı bozulması nedeniyle pürüzsüz bir yüzey ve homojen kontur kaybına neden olmuştur.
Vezikül oluşumu ve sitozolik materyal salınımı kültürlerde MIC'den daha yüksek konsantrasyonlarda gözlenmiştir. E.coli kültürlerinde de homojen çubuk benzeri şeklini vurgulayan pürüzsüz yüzeyler gösteren kontrollerle benzer sonuçlar elde edilmiştir. Yapı, sadece ayırt edilebilir siluetlerle 1.000 PPM nanopartikül maruziyetinde tamamen kayboldu.
Daha fazla analiz için gerekli olduğu için numune sabitlemenin doğru yapılması önemlidir. Görüntü filtresi, iyi görüntü çözünürlüğü ve örnek ayrıntılar sağlamaya yardımcı olur. Sabitleme yöntemi kullanılarak, mekanik özelliklerin incelenmesinde yardımcı olabilecek AFM temassız modları uygulanabilir.
Bu metodoloji, bakteriyel hücre hasarı analizine odaklanan tıbbi ve mikrobiyoloji araştırmaları için ucuz ve kullanışlı bir araç olabilir.
