Bu çalışma, hayat sigortası şirketi &quot;Novalis-Taitbout&quot; Ecole des Nörobilim de Paris (AKP), Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot;, &quot;ERA-NET NÖRON&quot; çerçevesinde tarafından desteklenen FP7 programı, Avrupa Komisyonu tarafından &quot;Vakfı pour la Recherche medicale&quot; Letten Vakfı ve Pasteur Vakfı.

1. Stereotaksik enjeksiyonları <ol><li> Bu deneylerde kullanılan virüs, HIV virüsü Channelrhodopsine2-YFP (sarı floresan proteini) ifade dayalı bir çoğaltma eksik lentiviral vektör füzyon synapsin organizatörü 6 tarafından tahrik oluşturmak . Plazmid K. Deisseroth &#39;nin araştırma grubu (cömertçe sağlanan <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentiviruses laboratuar kurulmuş protokolleri 7 göre, ticari kaynaklardan elde edilen veya üretilen olabilir. Ortalama vektör titreleri 10 10 transdüksiyon ünite / ml sipariş edildi. Viral alikotları -80 ° C&#39;de saklanır ve sadece pipet yüklemeden önce çözülmüş olmalıdır. Birden fazla donma / çözülme döngüsü kaçınılmalıdır. Asla kuru buz doğrudan maruz kalma virüs çözümü. </li><li> Cam pipetler, standart pipet çektirmesi (Sutter P borosilikat cam kapilerleri kullanarak hazırlayın-97 Pipet çektirmesi). Çekerek ayarı düzgün, uzun ve sert bir pipet verim kalibre edilmelidir. Sonra, çapı 30-40 mikron bir ipucu elde etmek için bir makas kullanarak pipet ucu kesilir. Mağaza tozsuz bir kutuya pipetler çekti. </li><li> 50 nL teslimat için üreticinin talimatlarına Nanoject II mikroenjektör Kur. Mineral yağ ile geri-dolgu enjeksiyonu pipet hazırlayın ve mikroenjektör piston yerleştirin. Mikroenjektör stereotaksik bir çerçeve üzerine takın. Kısmen boş yağ virüs çözümü ile doldurmadan önce cam pipet </li><li> Mikropipet Parafilm steril bir parça üzerine 2 ul virüs çözümü transfer. Virüs çözümü açılan cam pipet yavaşça alt ve 1-2 ul pipet doldurun. Pipet hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> 100 mg / kg Ketamin ve steril serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg Xylazine, bir fare anestezisi. Kafa derisi, saç çıkarınkemirgen makası, jilet, makas, ya da kimyasal depilitory ajan kullanılarak yapılan hayvan. % 70 etanol ve betadin alternatif üç uygulama ile saçlı deri dezenfekte edin. Tüm cerrahi aletler de otoklavlanabilir ve daha sonra% 70&#39;lik alkol ile dezenfekte edilmelidir. Baş güvenli olmasını temin etmek, hayvan, kulak çubukları ve burun bar ile stereotaksik çerçeve yerleştirin. Kornealar kurumasını önlemek için göz merhemi sürün. </li><li> Bir neşter ile, gözler arasındaki kulağı arasında kafa derisi kesilir. Deri, kafatası maruz ve kelepçeler bir çift deri çapa kenara çekin. Kafatası yüzeyini temizleyin. Stereotaksik aparat bregma cam pipet ucu ile sıfırlanır. Daha sonra ucu (Medio-Lateral, hem de sağ ve sol hemisferde ± 0.82, sırasıyla Antero-posterior, 3.30) enjeksiyon yerinde konumlandırılmış. Burun çubuğunun konumu stereotaksik koordinatlarını hesaplamasına göre ayarlanmalıdır. Yaptığımız denemelerde, burun çubuğu u ayarlanır.ntil bregma ve enjeksiyon yerinde aynı yükseklikte hizalanır. </li><li> Enjeksiyon yeri belirleyin. Yüksek hızlı bir cerrahi matkap kullanarak, dikkatli bir şekilde kafatasına delik. Ucunda çengel bükük bir şırınga iğnesi ile duramater ortaya çıkarmak için ince kemik kalıntıları çıkarın. Deliğe doğru pozisyonda merkezli olup olmadığını kontrol edin. Delme sırasında beynin yüzey rüptürü kan damarları etmemeye dikkat çekin. Eğer kan damarları parçalanır kan akışı durana kadar, birkaç saniye için küçük bir pamuklu bir çubukla veya doku ile beynin yüzeyine hafifçe basın. </li><li> Alt pipet ve pipet ucu, beynin yüzey dokunduğunda dorso-ventral yüksekliği sıfır. Sonra, doğru dorso-ventral derinliği (beyin yüzeyinden 2.9, dorso-ventral), alt ve basınç denge için 30 saniye bekleyin. 200 nl toplam 4 kez 50 nl virüs enjekte edilir. Her enjeksiyon arasında 30 saniye bekleyin. </li><li> Bir dakika, son enjeksiyondan sonra yavaş yavaş boru geritte. Tekrar diğer yarımkürede için 1.6-1.8 puan. Stereotaksik aparat hayvan çıkarın kesi ve dikiş cerrahi konuları ile kesilmiş deri temiz. Hayvan kafesine dönmeden önce ısınma pad üzerinde kurtarmak için izin verin. Ayrıca, hayvanlar hemen sonra bir non-steroid anti-inflamatuar, analjezik (örneğin, Carprofen 4mg/kg) verilen ve 3 gün cerrahisi sonrası olabilir. </li></ol> 2. Koku ampul in vivo optogenetic stimülasyon LED Kronik implantasyon <ol><li> Lentiviral parçacıkları ile enjekte Hayvanlar bilateral sonraki kronik bir minyatür mavi LED (Osram, LED CMS 4.6W mavi) implante edilir. Konektörü LED ters tarafta konumlandırılmış, böylece bir kadın minyatür elektrik bağlantısı Lehim LED pimleri. Elektrik kısa kesilmiş olduğunu kontrol edin ve konektörü üzerindeki olumlu ve olumsuz pin belirlemek. LED, uygun bir kablo olsa LED için geçerli bir denetleyici bağlayarak test edin. </li><li> LED mutlak ışık güç ölçmek ve / veya ayarlamak için monte mikromanipülatör ve pozisyon LED, pik, 470 nm dalga boyunda ışık yoğunluğu bir güç metre Fotodedektör ile doğrudan temas LED. Opak bir PVC kurulu 3 mm çapındaki bir iğne deliği delin. Yapıştırmayın bu güç ölçer iğne deliği ve optik güç karşı mm 2 başına gücünü hesaplamak için geçerli giriş bir standart eğri oluşturmak. </li><li> Beyin sayesinde ışığın yayılımı ölçmek için, 300 taze beyin dokusu blokları, 500, 1000, 1500 ve 2500 mikron kalınlık 0-4 vibratome 14 ° C ACSF kesti. LED altında canlı farelerde yapılan bir aynısı olan bir kraniotomi ile bir kafatası parçası yerleştirin. İlk olarak, LED merkezli doku olmadan ışık gücü ölçer. Daha sonra, LED ve güç metre fotodetektör arasındaki doku her blokta yer ve güç ölçmek. Oranı olarak hesaplanan doku kalınlığı karşı göreceli iletim fraksiyonu bir eğri, Yapdoku yoluyla ve doku olmadan ölçülen güç arasında. </li><li> 100 mg / kg Ketamin ve steril serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg Xylazine, bir fare anestezisi. LED% 70 etanol ile temizleyin ve dezenfekte edin. Hayvan derisi saç çıkarın ve% 70 etanol ve betadin alternatif üç uygulama ile saçlı deri dezenfekte edin. Sonra stereotaksik çerçeve içinde hayvan yerleştirin. Kornealar kurumasını önlemek için göz merhemi sürün. Stereotaksik sahibine konnektörü takın. Koku ampulü üzerinde kafatası yüzeyinde mükemmel yatay ve LED minyatür yüzeyine paralel kadar burun çubuğunun konumu ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Bir neşter ile kafa derisi, 3 mm 3 mm kulakları posterior gözleri önünde kesti. Deri bir kenara çekin ve kelepçeler bir çift çapa. Jilet kullanarak kafatasının yüzeyindeki membranlar kazınması gerekir. Temiz ve kuru kafatası. Siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir kapak uygulayın sonraki reklama izindiş akrilik hesion. </li><li> Koku ampullere göre; yüksek hızlı bir cerrahi matkap kullanarak, dikdörtgen bir kraniotomi (5.1 mm kaudal merkezli, bregma yanal 0 mm 1 mm kaudal ve lateral 3 mm). Bunu yapmak için dikkatlice ince kafatası, sadece ince bir tabaka kemik kalana kadar. Kalan kemik bükük bir şırınga iğne yardımı ile dikkatlice çıkarın. Özel bakım dura madde delinmesiyle ve iki hemisfer arasında ve koku ampul kaudal sınırında bulunan ana kan damarlarının çatlaması önlemek için alınmalıdır. Beyin yüzeyindeki kan birikimi ve pıhtılaşma dokuya optimum ışık geçişini engellemektedir. Kraniotomi ve steril serum fizyolojik ile beyin yüzeyi durulayın ve sonra kafatası kuru. </li><li> Konektörü LED minyatür takın. Koku ampuller LED minyatür indirin. Minyatür LED ana ekseni, steril tuzlu su ve d ile temizleyin fare rostral-kaudal eksenine paralel olmalıdırry kafatası. Sonra güvenli bir kafatası, ikinci bir diş akrilik tabakası tarafından takip akrilik bir ilk katman (yani, polikarboksilat çimento) ile LED . Iki küçük vida Ayrıca LED düzeltmek için gerekli olabilir. Kafatası üzerinde vidalar yerleştirilir (LED pozisyon posterior) ve her iki akrilik ile kaplı olmalıdır. Akrilik hala sıvı iken, kafa derisi serbest kenarları, diş akrilik yüzeyinde geri çekin ve tutkal. Konnektör üzerinde herhangi bir akrilik uygulamak için özen gösterin. Akrilik sertleştikten sonra, stereotaksik cihazdan kaldırmak ve hayvan kafesine geri dönmeden önce bir ısınma pad üzerinde kurtarmanızı sağlar. Hayvanlar en az yedi gün ameliyat kurtarmak için kafes içinde izole bırakılır. Ayrıca, hayvanlar hemen sonra bir non-steroid anti-inflamatuar, analjezik (örneğin, Carprofen 4mg/kg) verilen ve 3 gün cerrahisi sonrası olabilir. LED&#39;ler deneyler implantasyon öncesi ve sona ermesinden sonra test edilmelidir. </li><li> Hafif elektriklical kablosu LED LED zamanlama ve yoğunluğunu kontrol etmek için bir nabız jeneratörü (Master-8) birleştiğinde bir akım denetleyici halata hayvan için kullanılır. Ince bir kablo tam bir hareket özgürlüğü sağlar. Konektör polarite saygı dikkat edin. Tersini polarite LED kırılabilir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: ChR2-YFP, yaklaşık 48 saat sonra enjeksiyon nöronlar transduced ifade ve birkaç ay 7 için sabit kalır . Şekil 1 15 gün sonrası enjeksiyon paraformaldehid sabit hayvan sagital bölümün temsili bir resim. Yoğun etiketleme ve RMS enjeksiyon yerinde boyutunu unutmayın. Yeni doğan hücrelerin çok sayıda koku ampul (Şekil 1) farklı katmanları kolonize RMS boyunca göç etmiştir. Soma, dendrit ve dikenler de dahil olmak üzere tüm nöron bölmeleri, füzyon proteini ifade edilir. Minyatür LED impla<html> ntation ilgi geniş bir bölgenin büyük ölçekli ve ucuz optik stimülasyon sağlar. Hayvan tam bir hareket özgürlüğü sağlar hafif bir elektrik kablosu ile LED denetleyicisine bağlı. Beyin dokusu ve ChR2 aktivasyon eşiği ışık difüzyon karakterize, biz bu optik aktivasyon LED yüzeyinin altında (Şekil 2A) ~ 2mm derinlikte tetiklemiş olabileceğini tahmin ediyoruz. Fonksiyonel aktivasyon izlemek için ChR2 ifade in vivo nöronlar, nöronal aktivitenin bir belirteci olan c-fos, ifade tekrarlayan ışık stimülasyonu (Şekil 2B) sonra analiz edilebilir. Alternatif olarak, 14 odak ışık uyarımı birleştiğinde ChR2 ifade nöronlar in vitro elektrofizyolojik kayıtlar yapılabilir. Son olarak, iki foton hedef gevşek yama kayıtları, in vivo 9 LED benzer minyatür ChR2-ifade kortikal nöronların fonksiyonel aktivasyon çalışma kullanılmaktadır . ntent &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Şekil 1. Rostral RMS lentivirüs enjeksiyonları 15 gün sonra bir fare koku ampul saggital bölümden ChR2-YFP rostral göçmen akışı içine lentiviral enjeksiyon ifade Temsilcisi konfokal görüntüler. OB farklı katmanları RMS sonundan itibaren göç dağınık YFP yenidoğan nöronların varlığını unutmayın. Çoğu yeni doğan hücreleri (% 95), soma Granül Hücre Katmanı (GCL) ve dendritler yalan Dış Pleksiform Layer (EPL) arborize granül hücreleri,. Yeni doğan nöron küçük bir nüfusu kadar göç Glomerüler Katman OB en yüzeysel tabakası, (GL). Ölçek çubuğu, 100μm. ChR2-YFP membran ifade dendritler yanı sıra dikenler de gösteren yeni doğmuş bir granül hücresi Ankastre, yüksek büyütme. Ölçek çubuğu, 20μm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Şekil 2. Diyagram yeni granül hücreler ifade ChR2-YFP koku ampul ve ışık uyarılmış c-fos ifade üst LED implante. Implante koku ampuller üzerindeki LED, şematik çizim. B gösteren Temsilcisi konfokal görüntüleri çift etiketli ChR2 YFP + c-fos + granül hücrelerinin koku ampul ışık uyarılması bir saat sonra. C-fos ifade tavşan anti-c-fos primer antikor (Calbiochem 1:5000) ve A568-konjuge anti-tavşan sekonder antikoru (Invitrogen, 1:1000) kullanarak ortaya çıkıyor. Ölçek çubuğu, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li><li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs.">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Optogenetic araçları son zamanlarda koku sistemi yetişkin doğan nöronlar da dahil olmak üzere seçici nöronal nüfus üzerinde kontrolü sıkılaştırdı. Burada yetişkin doğumlu nöronlar belirli bir nüfus ChR2 YFP ifade lentiviral vektör stereotaksik enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Enjeksiyon sonrası dönemde dikkatli bir şekilde izleyerek, bir kohort görece homojen bir yaş ile yetişkin doğumlu nöronların aktivitesini analiz etmek ve işlemek için edebiliyoruz. <p ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme </td><td> Şirket </td><td> Katalog No. </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0.2% </td></tr><tr><td> Pipet Çektirme </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Cam kılcal (3.5 &quot;) </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II mikroenjektör </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Yüksek hız cerrahi matkap </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Mikro Matkap Çelik Çapak 0.7mm uç çapı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED CMS mavi 4.6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Kadın elektrik bağlantısı (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Şu LED denetleyicisi (max: 1A) </td><td> A1W ELECTRONIK </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Darbe üreteci </td><td> Ampi </td><td> Master-8 </td></tr><tr><td> Optik güç ölçer </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Siyanoakrilat yapıştırıcı </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Polikarboksilat çimento (ilk tabaka çimento) </td><td> SEPTODONT </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Metakrilat çimento (ikinci kat çimento) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Tic - Sıvı (339.292) Unifast Tic - Toz (339.114) </td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Yerel internöronlar 1-3 yetişkin kemirgenler koku ampul sürekli yeniden üretilir. Bu süreçte, nöral kök hücreler lateral ventrikül duvarları boyunca birkaç milimetre koku ampul içine ulaşmak ve birleştirmek için rostral göçmen akışı (RMS) için göç neuroblasts doğuran, yetişkin nöron denir. Farklı adımlar ve koku alma devreleri önceden var olan yetişkin doğan nöron entegrasyon etkisini incelemek için, nöronların bu özel nüfus aktivitesini seçici etiket ve işlemek için gereklidir. Optogenetic teknolojilerinin en son gelişme, tam çevre nöronlar 4,5 etkilemeden nöronların bu özel kohort aktive etmek için ışık kullanma fırsatı sunuyor . Burada koku ampul ulaşmadan RMS neuroblasts zamansal olarak sınırlı bir kohort viral ifade Channelrhodopsin2 prosedürleri bir dizi (ChR2)-YFP mevcut ve ne yetişkin doğumlu olmakurons. Buna ek olarak, kronik ChR2-ifade nöronlar in vivo uyarılması için LED minyatür bir implant ve kalibre etmek için nasıl göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation at JoVE.com

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K Görüntüleme.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Video: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Yetişkin doğmuş Nöronlar Entegrasyon incelenmesi

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Nörobilim

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...