Bu çalışma, John Horne (R15MH083221 NIMH) NIH R15 ALANI hibe yoluyla finanse edildi.

1. Transgenik embriyolar <ol><li> Burada zebrafish transpozon-aracılı arttırıcı tuzak yöntemi 8 yoluyla oluşturulan bir transgenik hattı kullanıyor. KalTA4, Gal4 transkripsiyonel aktivatör bir zebrafish optimize edilmiş sürümü ve kırmızı floresan proteini, mCherry: transgenik eklemek iki kodlama dizileri içerir. Endojen bir arttırıcı sırası kontrolü altında bu transgenik kaset ifade transgenik zebrafish arttırıcı tuzak yöntemi verim hatları. Böylece, belirli bir arttırıcı dizisi kimliğini bağlı olarak, her iki KalTA4 ve mCherry ifade, gelişmekte olan beynin belirli bölgelerde lokalize olur. Et (: Gal4TA4, UAS: zic4 mCherry) hzm5 doğrultusunda biz burada kullanmakta olduğunuz, burada özel bir önem ifade, arka beyin, ön beyin, çeşitli sitelere lokalize ve koku ampulü 8 (Şekil 1 bkz.) . Bu model, ifade ve genom içinde kaset lokalizasyonu göz önüne alındığında, transgenlerin (ayrıca bkz. Zic4 organizatörü 8 kontrolü altında olması tahmin edilmektedir <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ nörogörüntüleme / lines_distel / ana</a> ). </li><li> Yetişkin Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) transgenik eklemek için heterozigot hzm5 balıkları genellikle yaklaşık% 50 oranında transgenik yavrular önde gelen WT balık (AB) ile evlendirilen. (Transgenik yavruların daha yüksek bir yüzdesi, iki heterozigot evlendirilen olabilir.) </li><li> Pigment oluşumunu engellemek ve floresan görüntüleme kolaylaştırmak, transgenik embriyolar 6-8 hpf az 100 mcM N-phenylthiourea (PTU) başında tedavi için. </li></ol> 2. Montaj embriyolar <ol><li> 24-28 hpf, yumurta su PTU olmadan embriyo transferi. MCherry floresan mikroskop kullanılarak ifade transgenik embriyolar belirleyin. Ince forseps kullanılarak transgenik embriyolar koryonik membran çıkarın. 4: Transfer embriyolar elektroporasyon tampon artı% 0,02 tricaine [180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 5 mM Hepes, pH 7.2 Elektroporasyon Tampon] içeren Petri koryon kurtulmuş. Anestezi için 2 dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin. </li><li> Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek,% 0.5 &#39;lik düşük erime noktalı agaroz elektroporasyon tampon artı tricaine bir çözüm hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 60 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 500 ul) yerleştirin. 6-8 anestezi embriyolar agaroz bu damla ekleyin. </li><li> Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu, hepsi aynı yöne bakan ve dikey bir satır dizilen bu tür embriyoların. Agaroz katılaşmaya ve pozisyon embriyolar tuzak için, 2-3 mm buz büyük bir Petri kabı üzerine çanak yerleştirin. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak, tabak elektroporasyon tampon artı tricaine sel. </li></ol> 3. Plazmid DNA ifade mikro-enjeksiyon <ol><li> Midi ve maxi-hazırlık plazmid izolasyon kiti (örneğin Qiagen) kullanılarak plazmid GFP ifade hazırlayın. Nihai konsantrasyonu 0.5 mg / ul steril su artı% 0.03 fenol kırmızısı plazmid askıya alınması. Burada anlatılan koku ampul hedef deney için, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (14 tandem UAS dizileri ve bazal balık organizatörü E1b) kontrolü altında EGFP kodlama sırası ile plazmid bir ifade kullanıyor. GFP ifade etmek mümkün olacak, transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade bu plazmid, sadece hücreleri kullanarak, bu yüzden, GFP hedeflenen ifade aracılık. Not: burada biz DNA enjeksiyonları, gelişmekte olan beynin diğer bölgeleri hedefleyen için geçerli olmalıdır görünüm için fenol kırmızısı kullanarak sürece bölgede ventriküller erişilen olabilir. Bodipy veya Quantam Nokta boyalar, floresan görselleştirme gerektiren diğer hücre türleri hedef için potansiyel floresan aydınlatma altında enjeksiyon görselleştirmek için kullanılan olabilir. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetler ya yatay veya dikey bir pipet çektirmenin kullanılarak imal edilebilir. Isı ve çekme gücü ayarları çektirme, gözü tipi türüne bağlı olarak değişir ve cam kapiller tüplerin türü. Sutter P-30 dikey çektirmenin kullanarak, uzun, sivri, keskin pipetler filamentler ile ince duvarlı kapiller borosilikat cam üretmek için bir ısı ayarı 980 ve 960 çekme kuvveti [Sutter Enstrüman # BF100-78-10]. Bu ayarlar ile çekilmiş Microinjetion pipetler kapatılır ve enjeksiyondan önce kırık olmalı. </li><li> DNA plazmid çözüm 1-2 ul enjeksiyon pipet eklemek için bir Microloader pipet kullanın. </li><li> Mount vebasınçlı enjeksiyon sistemi pipet tutucu içine yüklenen pipet güvenli. </li><li> Basınç bakliyat, kırmızı DNA çözüm kabarık sürüm, çıkarana kadar ince forseps ile yüklenen pipet geri kırın. Alternatif olarak, ipuçları, hızlı bir şekilde bir batık, katlanmış laboratuvar Kimwipe nüfuz ederek geri kırılmış olabilir. Not: enjeksiyon pipetler başlangıçta kapatılır ve elle geri kırık olması gerekir, çünkü ucu boyutu ve enjeksiyon hacmi değişkendir. İdeal enjeksiyon pipetler 24 hpf embriyolar (40 psi az 100 ms enjeksiyon bakliyat) gelişmekte olan önbeyin ventrikül tamamen doldurmak için 3-5 enjeksiyon bakliyat gerektirir. </li><li> Plazmid DNA çözümü gibi DNA komşu zorla ve beynin koku alma ampul formu mukadder bölge içine ardalanmalı gelişmekte olan beyin ventriküller içine enjekte edilir. Olfaktör bulb önbeyin ventrikül en ön duvarı hücrelerinden elde edilir. Böylece, gelişmekte olan beynin anterior sonuna doğru pipet işaret olduğu gibi ventriküller içine enjeksiyon pipet takarak, basınçlı enjeksiyon DNA&#39;sına ve ileriye dönük bir koku alma ampul komşu zorlar. Kırmızı boya önbeyin ventrikül anterior sonunda açıkça görünür oluncaya kadar DNA enjekte edilir. DNA DNA seyreltilmesi, hemen diffüz başlar, çünkü enjeksiyondan sonra mümkün olduğunca çabuk elektroporasyon adım (örneğin, 10 saniye içinde) devam etmek önemlidir. </li></ol> 4. Elektroporasyon <ol><li> Elektroporasyon Çim platin subdermal elektrotlar (Çim Teknoloji # E2) yapılan kendini inşa elektrotlar kullanılarak yapılmaktadır. Elektrotlar, elde tutulan bir prob ve son platin elektrot arasındaki mesafe 1 mm (inşaat ile ilgili detaylar için 9) olmalıdır. Kare dalga elektroporasyon bakliyat Çim SD-9 Stimülatör (Çim Teknolojisi, Model SD-9) elektrotlar bağlayarak üretilmektedir. </li><li> 70 volt tek, 5 ms elektroporasyon darbeleri üretmek için SD-9 stimülatörü ayarlayın. Elektrot, negatif elektrot embriyo kafasının arka ise pozitif elektrot, embriyo ön sonuna kadar yanında konumlandırılmış gibi yerleştirin. El ~ 1 sn her darbe ayıran, SD-9 stimülatörü tek mod anahtarı kullanılarak ~ 7-8 elektroporasyon bakliyat başlatın. Uygun gerilimler embriyoların yaş ve kullanılan gerilim kaynağı bağlı olarak değişecektir. Eski embriyolar elektroporasyon 7 başlatmak için yüksek gerilimi ise Genç embriyolar, embriyo zarar vermemek için daha düşük voltaj gerektirir. </li><li> Embriyoların agaroz onları kurtararak elektroporasyon sonra en az 10 dakika önce kurtarmak için izin verin. </li><li> Ince forseps kullanarak, embriyoların kendileri ile fiili temas kaçınarak nazikçe embriyoların anahat izleme agaroz embriyoların serbest. </li><li> Bir kere serbest (PTU ile gerekirse) embriyoların yumurta su geri. 28 saklayın ° C GFP ifade için görüntülü kadar. </li></ol> 5. Görüntüleme için Montaj embriyolar <ol><li> Yumurta su artı PTU yumurta su artı% 0,02 tricaine embriyo transferi. Anestezi için birkaç dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin. </li><li> Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek, yumurta su artı tricaine düşük erime noktası agaroz% 0.5 çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 35 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 300 ul) yerleştirin. Agaroz Bu düşüşün bir anestezi embriyo ekleyin. </li><li> Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu mümkün dik bir mikroskop (ters kapsamları farklı bir embriyo geometrisi gerektirir, gelişmekte olan beynin dorsal görselleştirmek için, dik olduğunu embriyolar ve görselleştirme izin aşağıdan farklı bir çanağı; 12). Buz 2-3 mm büyük bir Petri kabı üzerine çanağı yerleştirerek agaroz katılaşmaya. Re-yönelim ince forseps ile büyük olasılıkla yan embriyo üzerine düşmemesi sağlamak için katılaşma sırasında istenecektir. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, sel, tabak, yumurta su artı tricaine ile çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: GFP ifade elektroporasyon 6 saat sonra gibi erken olarak görülebilir olmasına rağmen, biz burada hedeflenen hücrelerin neurite yapısı yeterince gelişmiş olduğu gibi elektroporasyon 4 gün sonra bir embriyodan görüntüleri gösteriyor. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry (ve KalTA4) kurucu ifade görüntüler Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul embriyolarda 5 gün sonrası fertilizasyon (Şekil 1A ve 1C.) Embriyolar hedeflenmiş elektroporasyon (yukarıda açıklandığı gibi), gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri (Şekil 1B, 1D, 1E) ile sınırlı olduğunu göstermek GFP ifade tarafından kurulmuştur plazmid UAS-GFP ifade vardı. Sadece hücreleri transgenically ifade KalTA4 transkripsiyon faktörü UAS-GFP plazmid ifade etkinleştirmek için edebiliyoruz. Transgenik olmayan embriyolara plazmid bu Incorporation saptanabilir GFP ifadesi yol açmaz. Böylece, UAS-GFP ve gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri GFP münhasır ifade KalTA4 sürücü yerelleştirilmiş transgenik ifade hedeflenen elektroporasyon kombine eylem. GFP ifade hücreleri, koku alma ampul mitral hücreleri (Şekil 1B ve 1D) 10 tipik aksonal projeksiyonlar göstermektedir . Akson projeksiyonları görselleştirmek için, rakam 1B ve 1D görüntüleri hücre gövdeleri bölgenin aşırı maruz kalmış olduğu gibi yüksek düzeyde maruz kalan gerekiyordu. Daha düşük bir seviyede maruz kalma (Şekil 1E) GFP ifade hücre gövdeleri gerçekten koku ampul (gri çizgi koku ampul sınır işaretleri Şekil 1C ve 1E karşılaştırmak) lokalize olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. 5 dpf&#39;e zebrafish embriyo koku ampul GFP ifade Hedeflenen. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul (A ve C, mCherry floresan kırmızı ile gösterilen) kurucu ifade görüntüler. MCherry Bu ifade, transgenik Gal4 ifade aracılık. UAS-GFP ekspresyon vektörü ile 28 hpf electroporated edilmiştir Embriyolar, A, yeşil gösterilen hedef, GFP 5 gün sonrası döllenme koku ampul (B, D ifadesi, ve E, GFP floresans aynı embriyo ekran ve C). Alt kısmında daha düşük bir pozlama görüntü (E) bu GFP ifade koku ampul hücre gövdeleri ile sınırlıdır. Gri çizgi koku ampul sınır gösterir. Parlak alan (gri ölçek), yeşil floresan (yeşil) ve kırmızı floresan (kırmızı) görüntüleri Olympus BX60 floresan mikroskobu ile.

<ol>
	<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li><li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ways+to+admire+zebrafish:+progress+in+functional+genomics+research+methodology.">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li><li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+DNA,+RNA,+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos.">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li><li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+methods+for+in+vivo,+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development.">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish:+a+method+for+time-resolved+loss-of-function.">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation.">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li><li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers:+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish.">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li><li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li><li>Distel, M., Kö, s. t. e. r., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li><li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Sch&#228;rer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada electroporated transgen ifade gelişmekte olan koku alma ampul hücrelerin belirli bir nüfus hedef arttırıcı tuzak Gal4 transgenik hat kullanan zebrafish in vivo elektroporasyon yöntemi bir tarif var. Bu yaklaşım arttırıcı tuzak transgenik hatları 8 aracılı hücre türüne özgü bir ifade ile, in vivo elektroporasyon 7 mükemmel zamansal çözünürlüğü birleştiriyor . Rağmen in vivo elektroporasyon koku ampul hedefleme açıklanan gelişmekte olan sinir sistemi 2-7 diğer bölgeleri hedef için kullanılabilir ve birçok farklı özel hücre tipleri veya dokuların Gal4 hedeflenen ifade arttırıcı tuzak hatlarına mevcuttur 8, 11. Tabii ki, bu elektroporasyon teknik Lexa veya Tet sistemleri 13, 14, 15 gibi diğer combinatioral genetik yaklaşımlar için de uygun olmalıdır. Elektroporasyon önemli bir avantajı, uygun bir Gal4-line kullanılabilir olduğunu verilen ek transgenik hatları yapmaya gerek olmadığını. Bu altı ay kaydeder. In vivo elektroporasyon nöronlar ve bunların öncüleri olan, sinir sistemi gelişimi belirli bir aşamasında ilgi 7 ne olursa olsun içine oligonükleotidler birleştirmek için sağlar. Bu temporal çözünürlük, önceki gelişim aşamalarında önemli işlevlere sahiptir hedef genleri ile ilgili sorunları aşmak için-fonksiyon kaybı analizi için özellikle avantajlıdır. Biz burada açıklamak yöntemi de RNAi oligonükleotidler veya yapıları ve morfolino anlamda anti-oligonükleotidler 4, 7 de dahil olmak üzere-fonksiyon kaybı reaktifler dahil etmek için kullanılabilir. Plazmid odaklı reaktifler, dominant-negatif protein ifade plazmid veya kısa saç tokası RNAi plazmid gibi hassas hücre tipine özgü ifade GFP ifade için buraya göstermiştir için izin Gal4 UAS kontrol altına olabilir.

Reaktifler: <ul><li> Agaroz, düşük erime noktası (Sigma, A9414) </li><li> Plazmid, midi ve maksi-hazırlık seti (örneğin Qiagen, # 12643] </li><li> Fenol kırmızı (Sigma, P3532) </li></ul> Ekipman: <ul><li> Kılcal cam filament ile; ID = 0.78 mm, OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Çim SD-9 Stimülatör (Grass Teknolojisi, Model SD-9) </li><li> Çim platin subdermal elektrotlar, düz iğne (Çim Teknoloji, # E2) </li><li> Micro-yükleyici pipet uçları (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipet çektirmesi (örneğin Sutter, Model P-30) </li><li> Pipet çektirmesi (örneğin Sutter, Model P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

In vivo elektroporasyon C olanlar da dahil olmak üzere, gelişmekte olan embriyolar belirli bölgelere ifade plazmid DNA, RNAi reaktifleri ve morfolino anti-sense oligonükleotidler sunmak için güçlü bir yöntemdir elegans, civciv, Xenopus, Zebra balığı, 1 ve fare. Zebra balığı, in vivo elektroporasyon bu reaktifler 2-7 teslimat için mükemmel bir mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip olduğu gösterilmiştir. Belirli bir gelişme aşamasında, bu reaktiflerin birleştirmek için izin verdiğinden bu yöntem zamansal çözünürlüğü önemlidir. Electroporated vektörleri ifade 6 saat içinde 7 nedeniyle oluşur Dahası, bu yöntem, transgenik yaklaşımlar daha zamanında . Tek bir hücrenin 2, 6 hedefleyen mekansal çözünürlüğü son derece hassas olabilir reaktifler, bir doku ya da yapı içinde belirli bir hücre popülasyonu içine dahil etmek için sık sık tercih edilir . Birden fazla hücreyi hedef, in vivo elektroporasyon embriyo belirli bir bölgeye teslimat için verimli Bununla birlikte, özellikle gelişmekte olan sinir sistemi içinde, bu özel hücre tipleri yalnızca mekansal ayrık elektroporasyon yoluyla hedef zordur. Alternatif olarak, artırıcı tuzak transgenik hatları transgenlerin 8 mükemmel hücre türüne özgü ifade sunuyoruz. Burada, özellikle zebrafish koku alma ampul nöronların gelişmekte olan hedef, in vivo elektroporasyon 7, 9 mekansal ayrık transgenik Gal4 tabanlı arttırıcı tuzak hatları 8 birleştiren bir yaklaşım açıklar . Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (eski GA80_9) arttırıcı tuzak hattı daha önce bir zebrafish Beyin de dahil olmak üzere gelişmekte olan beynin birden fazla bölgede mCherry aracılı hedefli transgenik ifade görüntüler, optimize Gal4 (KalTA4) transkripsiyonel aktivatör 8 tarif serebellum, ön beyin, ve koku ampul. Özellikle GFP ifade koku ampul, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (UAS) kontrolü altında GFP kodlama sırası ile plazmid hedef için 24-28 saat sonrası fertilizasyon (hpf) önbeyin ön ucunu electroporated oldu. Bu yöntem önbeyin birden fazla bölgeye plazmid DNA içeriyor olsa da, GFP ifadesi yalnızca transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade hücrelerinde meydana gelir. Böylece GA080_9 transgenik hattı kullanarak, bu yaklaşım sadece gelişmekte olan koku alma ampul GFP ifade açtı. Koku ampul 10 mitral hücreler için daha önce açıklandığı gibi, bu yaklaşım ile hedeflenen GFP ifade hücreleri, tipik aksonal projeksiyonlar gösterdi . Bu yöntem aynı zamanda mekansal ve zamansal ayrık-fonksiyon kaybı analizi için bir yöntem sağlayacak kısa saç tokası RNA girişim ifade plazmid da dahil olmak üzere diğer reaktiflerin hedeflenen teslim için kullanılan olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines at JoVE.com

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Genetik manipülasyon zamansal ve mekansal çözünürlükte karıştırmayı ki biyolojik olayların spektrum belirler. Burada zamansal ve mekansal ayrık<em&gt; In vivo</emZebrafish transgenik hatları ile birlikte, özellikle gelişmekte olan koku alma ampul nöronlarda GFP transgen ifadesi neden&gt; elektroporasyon,.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K Görüntüleme.  Pace University. Genetik manipülasyon zamansal ve mekansal çözünürlükte karıştırmayı ki biyolojik olayların spektrum belirler. Burada zamansal ve mekansal ayrık In vivo elektroporasyon,.

Video: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Nörobilim

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...